雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶基因的cDNA和基因组DNA克隆及序列分析

根据已知的β-胡萝卜素酮化酶(β-carotene ketolase,BKT)的cDNA序列设计引物,利用长距离PCR扩增获得了bkt基因的cDNA完整编码片段及基因组DNA片段,并对这些片断进行了序列测定。cDNA和基因组DNA比对结果表明该基因至少包括5个内含子,它们的剪切位点皆符合GU-AG规律。在比对结果中同时还发现一个19bp的短序列重复,该重复序列在bkt的cDNA和基因组DNA上都发生了多次重复,推测在BKT的表达调控中可能具有一定功能。另外,在序列比对过程中还发现本实验所获得的cDNA和基因组DNA序列与前人报道的cDNA序列之间都存在多处单碱基差异和19bp的短序列差异。     

雨生红球藻细胞转化、虾青素积累与光照强度的关系及不同品系间的差异性

于2004年利用3个品系的雨生红球藻(H0、H2和H3)和以去除营养物质的藻液为实验对象,探讨了光强对细胞转化和虾青素积累的影响。结果表明,光照强度对红球藻虾青素积累和细胞转化有显著影响,并在品系间存在一定差异性。其中:品系H0在光强≤25000lx时虾青素积累量随光强的增加而增加,光强在20000～35000lx时虾青素积累量处于较高水平,而光照强度>35000lx时,虾青素积累量随光强的升高而下降;H2品系在光强≤25000lx时虾青素积累量随光强的增加而增加,光强在25000lx左右时虾青素积累量较高,当光强≥35000lx时,虾青素积累大幅度下降;H3品系在≤35000lx时虾青素积累量随光强的升高而增加,20000~45000lx为虾青素积累较适宜的光强,高于45000lx时虾青素积累量则明显下降。进一步分析得出,弱光导致红球藻虾青素含量较低是光照强度不足、细胞内虾青素含量少的结果,而强光下虾青素含量下降则是细胞受到损伤、细胞数量减少导致的。对比研究发现:在较低光强下(20000~25000lx)H2单个细胞内虾青素积累量略低于H0,但其积累虾青素总量却最高,这是由于此时H2不动细胞增长速率比其它品系高造成的,不过适宜H2积累虾青素的光照范围最窄,它对高光强的耐受性也最差;而H3在较低光强下虾青素积累总量及单个细胞内的积累速率均最低,但是它的适宜光照范围最宽,即对高光强的耐受性最强,在较大的光强波动范围内都可以保证较高的安全转化量,这就使得它在较高的光强下虽然单个细胞积累虾青素的速率仍然最低,积累总量反而显著高于其它两个品系。     

雨生红球藻多糖的提取分离及理化性质研究

将雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)经乙醇/乙酸乙酯(1:2,V/V)脱脂,通过冷水、热水和5%碳酸钠提取,得到3种粗多糖(HPC、HPH和HPA),通过Q-Sepharose FF阴离子交换柱进一步分级,从HPC中得到HPC1、HPC2和HPC3共3种多糖组分。运用高效液相色谱法(HPLC)、红外光谱(IR)等方法对其单糖组成、相对分子质量和基本结构特征进行分析比较。结果表明,各组分单糖组成复杂,主要含有半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、阿拉伯糖(Ara)、葡萄糖(Glc)、葡萄糖醛酸(GlcUA)、半乳糖醛酸(GalUA)、木糖(Xyl)、鼠李糖(Rha)、岩藻糖(Fuc)、葡萄糖胺(GlcN)和半乳糖胺(GalN),其中,Gal含量最高,大于20%。多糖HPC1、HPC2和HPC3的相对峰位分子质量分别为502.6,373.2,577.5和300.5 ku。     

稀土元素Ce对雨生红球藻生长及虾青素积累影响的研究

采用反相高效液相色谱分析法（RP-HPLC）研究了稀土元素铈（Ce^3＋）对雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）生长及虾青素积累的影响。结果表明,低质量浓度的Ce^3＋对微藻生长和虾青素积累均具有明显的促进作用,当Ce^3＋的质量浓度为0．1mgm时,对藻生长的促进效果最佳,细胞密度较对照组提高34％;当Ce^3＋的质量浓度为1mg/L时,虾青素质量分数可达到细胞干质量的3．2％,较对照组提高167％。此外,高质量浓度Ce^3＋的对雨生红球藻有抑制作用,当Ce^3＋的质量浓度高于40mgm时,红球藻的生长完全被抑制,虾青素质量分数也明显降低。     

不同有机溶剂对雨生红球藻中虾青素提取成分的影响

研究了有机溶剂提取雨生红球藻中虾青素过程中,不同液料比对提取效率的影响,并以分光光度法及高效液相色谱法(HPLC),检测了不同有机溶剂对提取组分及主要组分(叶绿素和虾青素)含量的影响.结果显示,提取率随着液料比的增加而上升,当液料比大于20:1时,其升高变缓,趋于平衡;不同有机溶剂提取物的化学组分无明显差异,但各组分含量的比例差异较大,如二氯甲烷提取物在480nm下吸光度为30.64±0.54,高于丙酮、乙酸乙酯及甲醇(分别为27.68±5.54、25.32±8.43及24.31±0.79),而645和663 nm下吸光度为2.54±0.46和5.33±0.19,较丙酮、三氯甲烷、无水乙醇及甲醇(分别为5.70±0.71、12.87±0.14、7.60±0.23及6.44±0.28)低,说明该种溶剂对于虾青素有较高的提取效率,但其挥发性强且毒性大,而无水乙醇的提取率略低于二氯甲烷,具有安全、低毒的优势,因此无水乙醇是较为合适的虾青素提取溶剂.     

雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶基因克隆、分析及叶绿体表达载体构建

β-胡萝卜素酮化酶(BKT)是雨生红球藻虾青素合成途径中的关键酶。根据GenBank中所收录的雨生红球藻BKT的cDNA序列设计特异性引物,以高光照处理的雨生红球藻细胞的总RNA为模板,采用RT-PCR的方法克隆出了β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt)。序列测定结果表明,bkt全长960bp编码320个氨基酸。克隆的bkt序列与GenBank收录的BKT的cDNA(AY603347)序列只相差一个碱基。并对其编码的氨基酸进行了二级结构的预测和疏水性分析。同时将所克隆的bkt构建入衣藻叶绿体表达载体p64Dbkt,为基因的进一步表达研究及探索其作用机制奠定了基础。     

雨生红球藻和虾青素研究述评

虾青系作为食品和饲料色素添加剂有着广阔的应用前景,单细胞绿藻雨生红球藻在特定条件下可双大量积累虾青素,有可能成为该色素的良好天然资源,受到微藻学界的重视。但目前雨生红球藻培养还处于实验室阶段,大规模生产尚存在许多问题有待解决,我国这方面的研究处于起步阶段。为此通过微机查阅１９８１￣１９９７年的国内外发表的有关文献,结合我们的实验结果,从该藻的基础生物学特性、虾青素累积的机制、养殖现状进行了综述,并     

雨生红球藻cDNA表达文库的构建与初步分析

为了筛选雨生红球藻虾青素合成过程中的关键酶基因的反式调节因子基因,以雨生红球藻的绿细胞为材料,提取了高质量的总RNA,并分离纯化了mRNA,经过反转录后的得到cDNA,构建了以λ-ZAPExpress为载体的表达型cDNA文库。经检测,所构建的文库的滴度为5.1×105,重组率为100%。用PCR方法对文库的质量进行了鉴定,文库的平均插入片断的大小为1.7kb。雨生红球藻cDNA表达文库的构建为研究虾青素的代谢工程奠定了基础。     

雨生红球藻的信号物质

以单细胞雨生红球藻为材料，在室内通气培养条件下，研究了经该藻处理过的培养液内是否存在对细胞生长或转化产生影响的信号物质。对比研究结果表明，处理过的旧液明显不利于红球藻游动细胞生长，但有利于不动细胞增加。预显着旧液中可能存在着降低游动细胞生长、同时还促使游动细胞向不动细胞转化的信号物质。旧液中该信号物质的多少与原来处理旧液的藻细胞密度有密切关系，密度越大信号物质越多，对细胞生长和转化的作用也越强。     

利用光生物反应器培养雨生红球藻的研究初探

用光生物反应器与光照培养箱两种培养容器培养雨生红球藻(Haematococcus pluvialis),对雨生红球藻在两种容器培养过程中细胞生长、pH值、溶解氧(DO)及虾青素积累情况进行比较,同时比较不同接种密度对光生物反应器培养效果的影响。实验表明,光生物反应器中藻细胞的调整期较短,接种1 d后即进入指数生长阶段,在胁迫阶段则仅需4 d即达到虾青素含量的峰值;将pH值控制在偏碱性条件下(7.75±0.10)有利于藻细胞更好生长;营养培养阶段DO相对饱和度上升至80%,而在胁迫阶段则迅速降低,最低值小于6%;较高的接种密度(2.3×104个/mL)具有较短的营养培养周期(7 d),且因接种密度变化对胁迫周期长短无明显影响(均为4 d),选用较高的接种密度可望降低工业生产成本。     

雨生红球藻细胞形态转换和藻落形成差异研究

基于雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)培养过程中游动细胞和不动细胞的形态差异与转换,对比研究了两种细胞类型在离心收集与藻落形成效率上的差异。结果表明,雨生红球藻SCCAP K-0084在BYA培养基中培养4~6 d和9~12 d分别以绿色游动细胞与绿色不动细胞为主;早期游动细胞离心收集需要更高的离心力,但500~1 000 g离心5 min可以在不影响细胞存活率的情况下有效收获所有类型细胞;相比于传统直接涂布法,双层琼脂平板法可有效提高平板藻落形成效率,且游动细胞藻落形成效率比不动细胞藻落形成效率更高。TAP培养基由于藻落形成效率较低并不适合于雨生红球藻平板培养与筛选,自养型培养基虽然具有较好的藻落形成效率但是藻落形成速度较慢,相比而言,BYA培养基藻落形成效率较高且生长速度快,更适合用于雨生红球藻细胞的后期平板培养与筛选过程。     

红球藻虾青素资源开发历程与趋势展望

经30多年不懈努力与系统创新研发,我国已成功地实现红球藻虾青素资源的规模化生产,开发出新资源食品和功能性生物制品。期间,我们结合微藻产业现状与国情,围绕红球藻资源开发的产业化链条,针对上中下游重要环节的关键性瓶颈问题,开展了基础理论探索、新技术开发、产业化推广与新活性功效发掘等系列工作。借建所70周年所庆成果专刊出版之际,全面回顾总结我们在该藻种质资源、基于细胞周期调控的二步串联培养模式、关键参数优化与控制、光反应器培养设施创制、生物污染危害和防控原理与策略、活性物质开发与新功能挖掘、产业标准与体系建设等方面所取得的进展,同时展望发展趋势,以期促进红球藻以及整个微藻产业的健康可持续发展。     

兼养对雨生红球藻细胞生长的促进作用及藻株差异性

结合叶绿素荧光技术,对比研究了不同雨生红球藻藻株在兼养(光照+乙酸钠)培养过程中细胞生长和光合作用的共性与差异性反应。结果表明:兼养明显提高红球藻细胞密度和比生长速率;乙酸钠不仅为红球藻提供异养的有机碳源,而且还明显导致藻细胞光自养的光合综合性能指数发生改变,兼养对细胞生长促进作用的贡献在前期主要来自于其中的异养部分,而在后期却明显来自于自养部分;兼养对细胞生长的促进作用在藻株之间存在一定差异,不同藻株对乙酸钠的适应能力和最适质量浓度也存在明显差异,藻株H0可适应的乙酸钠质量浓度较高,而藻株H6对乙酸钠需求和适应性相对较低。上述结果意味着规模化培养红球藻过程中,针对不同藻株采用适宜乙酸钠兼养方式可有效缩短培养周期,提高生产效率。     

杜氏盐藻磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆和分析

为研究杜氏盐藻（Dunaliella salina）磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC）基因的功能, 根据莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、花生（Arachis hypogae...     

坛紫菜别藻蓝蛋白α,β亚基基因的克隆和序列分析

以野生坛紫菜色素体DNA为模板, 通过PCR扩增获得编码坛紫菜别藻蓝蛋白α亚基和β亚基的序列及两者之间的间隔序列,该序列全长为1 055 bp,其中编码α和β亚基的序列均为486 bp,间隔序列为83 bp.该序列与GenBank收录的其他4种红藻相关序列的同源性在75.6%~87.4%,与2种蓝藻的同源性分别为66.9%,68.5%,其中编码区同源性更高.     

缢蛏天然抗性相关巨噬蛋白2(Sc-Nramp2)基因克隆及其在副溶血弧菌刺激下的表达分析

克隆得到缢蛏天然抗性相关巨噬蛋白2（Sc-Nramp2）基因的cDNA全长序列3 681 bp,该基因的开放阅读框有1 776 bp,编码591个氨基酸,预测分子量为65.86 kDa;其结构具有Slc11蛋白家族的典型特征,包括有10个典型的跨膜结构和2个糖基化位点。Sc-Nramp2基因3'-UTR有2个类似于脊椎动物Nramp2中铁反应控制蛋白结合位点;同源性分析表明,Sc-Nramp2和太平洋牡蛎Nramp2-like的同源性最高为71.6%。实时荧光定量PCR结果表明,Sc-Nramp2基因在闭壳肌、外套膜、肝胰腺、斧足、水管和鳃6个组织中均有表达,其中肝胰腺中的表达量最高,其次是鳃,与其他组织均有极显著性差异（P<0.01）;注射副溶血弧菌后,肝胰腺中Sc-Nramp2基因的表达量较对照组显著上调（P<0.01）,且表达量呈现先上升后下降的趋势,在12 h时达到最大表达量,推测Sc-Nramp2基因参与了缢蛏非特异性免疫应答反应。