| 摘 要： | 针对活性中心突变型胃蛋白酶原难以被激活且稳定性差的问题,本文研究了活性中心突变对胃蛋白酶原激活及其稳定性的影响。根据猪胃蛋白酶原A的基因序列设计引物,通过RT-PCR和重叠延伸PCR法分别获得野生型(rPG)和突变型(D32A和D215A)胃蛋白酶原基因片段,其中突变型胃蛋白酶原分别为活性中心关键氨基酸天冬氨酸(D)突变为丙氨酸(A)。将野生型和突变型胃蛋白酶原分别在酵母中成功表达,研究其激活、激活后的稳定性和活性情况。研究表明,可以成功地在酵母中表达并纯化野生型和突变型重组猪胃蛋白酶原rPG、D32A和D215A。在pH=2.0条件下,rPG在5min内即可全部激活,且在37℃具有良好的稳定性,而D32A和D215A需24h以上才可激活。通过在激活反应中加入野生型胃蛋白酶,D32A和D215A的激活时间可缩短至1h,虽然激活过程有部分酶原发生降解,但激活后获得的突变型胃蛋白酶可稳定3d,激活后的突变型胃蛋白酶无蛋白水解活性。研究结果表明,活性中心关键氨基酸突变后的胃蛋白酶原仍可激活,虽然在激活过程中胃蛋白酶原的稳定性差,但激活后产生的胃蛋白酶稳定性良好,这为进一步研究突变型胃蛋白酶提供了可能和保证。
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