Cloning and expression analysis of the chloroplast fructose- 1,6-bisphosphatase gene from Pyropia haitanensis

Fructose-1,6-bisphosphatase(FBPase) is one of the key enzymes in Calvin circle and starch biosynthesis. In this study, the full-length of cpFBPase gene from Pyropia haitanensis was cloned by using rapid amplification of cDNA ends(RACE) technology. The nucleotide sequence of PhcpFBPase consists of 1 400 bp, including a 5′ untranslated region(UTR) of 92 bp, a 3′?UTR of 69 bp, and an open reading frame(ORF) of 1 236 bp, which can be translated into a 412-amino-acid putative peptides with a molecular weight of 44.3 kDa and a theoretical pI of 5.23. Multiple sequence alignment indicated that the protein belonged to the chloroplast FBPase enzyme. Phylogenetic analysis showed that the protein assembled with the cpFBPase of a thermal tolerant unicellular red micro-algae Galdieria sulphuraria. Expression patterns analyzed by qRT-PCR revealed that the expression of PhcpFBPase gene in the thallus phage was 7-fold higher than in the conchocelis phage, which suggested the different mechanisms of inorganic carbon utilization among the different life phages of P. haitanensis. And the different response modes of PhcpFBPase mRNA levels to high temperature and desiccation stress indicated that PhcpFBPase played an important role in responsing to abiotic stress.     

夜光藻配子细胞实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

夜光藻是我国广泛分布的赤潮原因种之一,其有性繁殖在种群增长中的作用尚不明确,定量分析配子细胞是研究夜光藻有性繁殖过程的重要手段。利用实时荧光定量PCR技术,以夜光藻rRNA基因的18S-ITS1为靶区域,建立了定量检测夜光藻配子细胞的方法。以配子细胞基因组DNA和含目的片段的重组质粒分别建立标准工作曲线,二者均呈现良好的线性响应,检出限分别为每反应0.17个细胞和10²个拷贝,满足定量检测应用需求。应用该方法对2015年逐月采集的胶州湾环境样品进行检测,并首次对夜光藻配子细胞的季节变化、水平分布与垂直分布进行了研究。结果表明,调查海域夜光藻配子丰度呈冬末春初、夏季双峰分布,范围为18.12~9.70×10⁵ cells/L;在水深小于10m的湾内近岸站位,配子丰度较低,垂直分布均匀;在湾中心、湾口和湾外的深水站位,配子丰度较高,仅在2~3月、7月和11月出现垂向差异。夜光藻配子细胞对种群增长和存续有潜在的积极意义,其丰度在营养细胞丰度高值期相对较高,在营养细胞丰度极低时仍可普遍检出。丰富了对近岸海域夜光藻配子细胞时空分布的认识,为深入研究夜光藻的种群增长模式、进一步探究其赤潮暴发的内在机理奠定了基础。     

青岛崂山湾近海扇贝养殖区细菌多样性及环境因子分析

为研究日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicus)耐高亚硝酸盐的分子调控机制,利用新一代高通量Illumina测序技术,对日本囊对虾在高亚硝酸盐胁迫下的肝胰腺进行转录组测序,通过对高质量序列的拼接组装以及功能基因的注释和分类,发掘与耐高亚硝酸盐相关性状的候选基因。实验结果表明:①10个文库共获得920785608个净读本,数据量为6.48G~7.34G。②Q30>93.07%。利用 Trinity软件组装后获得 46308条单基因簇,N50为1833bp。③与对照组相比,高亚硝酸盐组分别识别出593、606、1089、497和988个差异表达基因。④对 DEGs进行功能注释,得到与免疫和代谢相关的通路和基因。⑤采用 qPCR 对随机选择的9个差异基因(DPD、ABCH、ProPOb、ACADL、CYP2J、PAT4、BHMT、CLEC 和PEPCK)在高亚硝酸盐胁迫下的表达情况进行检测,其表达量与转录组测序技术(RNASequencing,RNA-seq)趋势一致。本研究结果丰富了对虾cDNA 数据库的信息,为日本囊对虾在高亚硝酸盐胁迫下的分子机制研究奠定了基础。     

病毒感染海洋球石藻Emiliania huxleyi的转录组分析

海洋球石藻Emiliania huxleyi及其特异性裂解病毒E. huxleyi virus (EhVs)在调节海洋碳、硫循环及全球气候变化中起着重要作用，也是开展真核生物病毒–宿主相互作用研究的良好模型系统之一。为了探究病毒感染条件下E. huxleyi基因表达水平的变化，以海洋球石藻E. huxley–BOF 92及其专一性裂解病毒EhV-99B1为研究对象，利用Illumina HiSeq 2000高通量测序技术，分别对E. huxleyi病毒感染组(Exp)和非感染对照组(Con)6 h和45 h的藻细胞样品进行转录组测序分析。共得到32 909条平均长度为1 153 bp的基因。病毒感染6 h和45 h分别得到2 617和5 229个差异表达基因，其中共差异表达基因465个。随机选取10条差异表达基因，采用qRT-PCR进行实验验证，结果证实转录组分析可靠。GO功能注释和KEGG通路富集，发现大量基因与氧化应激反应、脂类代谢、碳水化合物代谢及信号转导等代谢过程相关，其中变化最显著的是谷胱甘肽代谢途径。从病毒感染球石藻转录组中筛选出部分与氧化应激反应相关的基因，其中9个基因显著上调，11个基因显著下调，表明宿主能够通过体内的氧化应激反应响应病毒胁迫。     

太湖梅梁湾水华微囊藻基因型组成和产毒微囊藻丰度的变化

采用基于ITS序列的PCR-DGGE方法分析了太湖梅粱湾水华暴发过程中(6-11月)微囊藻的不同基因型组成的变化,同时利用针对微囊藻毒素合成酶基因mcyA和微囊藻特异性的16S rDNA部分核苷酸序列的引物,应用实时荧光定量PCR方法(qRT-PCR)分析水华样品中产毒微囊藻与总微囊藻的量.通过两者的比值反映产毒微囊藻丰度.结果表明,在发生水华的不同时期,微囊藻的基因型组成发生了变化,其中以8月末、9月和10月的基因型最多,基因型M5和M10存在于整个水华发展过程中.共检测到12种主要的基因型,每个基因型在水华的不同时期所占的比例互不相同.实时荧光定量PCR结果显示从6月到10月,产毒微囊藻的丰度呈增大的趋势,从0.750%增加到32.16%,而11月产毒微囊藻的丰度显著下降.     

克氏原螯虾(Procambarus clarkii) CypA基因应答WSSV侵染的表达研究

克氏原螯虾亲环素蛋白A(Procambarus clarkii Cyclopllilin A,简称PcCypA)是一种存在于克氏原螯虾(P.clarkii)中高度保守的重要蛋白,具有多种生物学功能。为了初步阐明CypA在病毒侵染克氏原螯虾过程中的免疫应答机制,本研究利用qRT-PCR等技术分析了克氏原螯虾在WSSV病毒感染后,PcCypA在不同组织中的转录表达情况。研究结果表明克氏原螯虾在感染WSSV后,心脏和肌肉组织中都出现了肌纤维断裂溶解的情况,在肝胰腺组织中出现了脂肪颗粒脱落、细胞空泡化和细胞膜溶解现象。同时,不同组织中的PcCypA基因表达存在明显的时序差异,以24hpi为界,0—24hpi为注射应激期,在此期间,肝胰腺、心脏等组织中的PcCypA转录表达量均有上调;24—36hpi为应激恢复期,绝大多数的组织中PcCypA转录表达均出现了回落,但在心脏、肌肉、血淋巴组织中出现了上调,说明这三个组织对WSSV感染的响应可能早于其他组织;48hpi之后为病毒感染响应阶段,在此期间鳃和肌肉组织中PcCypA表达量显著提升,而在肝胰腺和精巢组织中却出现表达下调;96—120hpi为感染响应后期阶段,肝胰腺和肠组织的PcCypA转录水平再次上调。因而,可以初步推断PcCypA在病毒WSSV侵染克氏原螯虾过程中参与了机体的免疫应答,且在不同的组织中PcCypA的转录表达水平存在显著差异。     

LPS胁迫下五个群体菲律宾蛤仔TYR基因在鳃和肝胰腺中表达特性研究

为了解TYR基因与蛤仔免疫的关系,本实验利用荧光定量PCR技术研究了菲律宾蛤仔五个群体(白蛤、白斑马蛤、斑马蛤、养殖和野生群体)的鳃组织和肝胰腺组织在LPS胁迫下TYR基因在不同时间(0 h、3 h、12 h、24 h、48 h)的表达特性。结果表明,在LPS注射后鳃组织中TYR6基因表达水平在白蛤和白斑马蛤3 h、6 h、12 h,野生蛤仔3 h,斑马蛤3 h、6 h,养殖群体6 h、12 h显著上调(P0.05),3h野生蛤仔和斑马蛤达到峰值, 6 h白蛤、白斑马蛤、养殖群体达到峰值(P0.05);在肝胰腺中,养殖群体和白斑马蛤6 h,白蛤6 h、24 h,野生群体24 h,斑马蛤3 h显著上调, 3 h野生蛤仔和斑马蛤达到峰值,6h养殖群体、白蛤、白斑马达到峰值(P0.05);鳃组织中TYR10基因表达水平在白蛤、野生群体和白斑马蛤3 h,养殖群体3 h、6 h,斑马蛤3 h、12 h显著上调(P0.05),肝胰腺组织中TYR10基因表达水平在白蛤3 h,野生群体3 h、6 h、12 h,斑马蛤、养殖群体6 h显著上调(P0.05),推测TYR基因在五个菲律宾蛤仔群体的鳃和肝胰腺中参与了免疫应答。通过对TYR基因的氨基酸序列进行二级结构分析和系统发育树分析,找到两个铜离子结合位点和6个组氨酸残基,并发现TYR6基因和长牡蛎同源性最高,为39.43%, TYR10基因和大珠母贝同源性最高,为51.04%。本文首次探讨在LPS胁迫下菲律宾蛤仔TYR基因的表达特性,为进一步探究TYR基因与菲律宾蛤仔免疫应答机制提供参考。     

香鱼Apo-14基因的克隆、序列分析及其mRNA表达与盐度适应性的关系

14 kDa载脂蛋白（Apo-14）是鱼类一种特有的载脂蛋白,是鱼类高密度脂蛋白（HDLs）的重要成分,其生物学功能目前还不明确.本研究采用简并引物,从香鱼（Plecoglossus altivelis）肝脏cDNA文库中筛选香鱼Apo-14基因,该基因cDNA序列全长905个核苷酸,开放阅读框编码一个有144个氨基酸,分子量约为15.9 kDa的蛋白.香鱼Apo-14基因mRNA主要在香鱼肝脏中表达,在肠、肾和鳃中也有少量表达.同源性分析揭示,香鱼Apo-14与已知鱼类中虹鳟（Oncorhynchus mykiss）Apo-14最相似,氨基酸序列同源性为70%.qRT-PCR表明,咸淡水处理组（盐度为10）的肝、肠、肾、鳃中,该基因mRNA均比淡水处理组（盐度为0）明显下调（p〈0.05）,揭示载脂蛋白Apo-14可能与盐度适应相关.