蛤蜊科3种贝类16SrRNA基因片段及ITS2核苷酸序列分析

利用PCR技术分别扩增连云港及启东沿海蛤蜊科的西施舌（Coelomactra antiquata）、中国蛤蜊（Mactra chinensis）和四角蛤蜊（Mactra veneriformis）3种双壳贝的16SrRNA基因片段和ITS2核苷酸序列．测序后用DNAstar软件分析了核苷酸差异。结果显示：三种贝类16SrRNA基因片段长度相同，均为306bp（去除引物）．核苷酸存在多态性。共有45个变异位点，54个核苷酸发生了变异。全部为碱基置换。西施舌与中国蛤蜊此片段核苷酸的同源性为88．9％．与四角蛤蜊的同源性为88．6％．中国蛤蜊与四角蛤蜊的同源性为90．6％。三种蛤蜊ITS2序列分别为390bp（西施舌）、441bp（四角蛤蜊）和466bp（中国蛤蜊）。存在长度多态性．ITS2核苷酸差异分析结果显示．西施舌与中国蛤蜊的同源性为70．9％-71．1％，西施舌与四角蛤蜊的为70．5％-71．0％。中国蛤蜊与四角蛤蜊的同源性为88．1％-88．8％。ITS2序列分析结果与16SrRNA基因片段分析结果一致．2种分子分析法均显示中国蛤蜊与四角蛤蜊的亲缘关系近。     

西施舌同工酶组织特异性研究

采用不连续垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,对西施舌5种组织(肝胰脏、鳃、后闭壳肌、外套膜和足)的酯酶(EST)、苹果酸脱氢酶(MDH)和超氧化物歧化酶(SOD)同工酶进行了研究。同工酶图谱显示:西施舌上述组织的3种同工酶具有一定的组织特异性。其中,肝和鳃组织EST酶活性较高,闭壳肌MDH酶活性最高,而肝组织SOD酶活性略高,上述组织是进行同工酶分析的理想材料。     

西施舌器官的发生和形成

本文叙述采用“直接法”、连续又系统地观察西族舌幼虫至幼贝器官的发生和形成的细微，变的全过程，有全套显微绘图和摄影并详细文字说明，特别是对雅贝与幼贝的晶杆囊、平衡囊和三对神经节的形成之描述，是国内，外的首例。     

西施舌营养成分分析与评价

对西施舌(Coelomactra antiquata)肉的水分、灰分、粗蛋白、粗脂肪及部分微量元素等进行了分析,并对其营养价值进行了评价。结果表明:西施舌鲜肉含水量为82.31%,粗蛋白11.18%(占干基质量的63.19%),粗脂肪0.54%,灰分2.36%;西施舌蛋白质中含有18种编码氨基酸,其中含人体所需的全部8种必需氨基酸,必需氨基酸的质量分数为20.93%(干基),占氨基酸总量的36.28%,谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)和甘氨酸(Gly)的质量分数较高,分别占干基的7.80%、5.57%和6.70%;高度不饱和脂肪酸C20:4(EPA)和C22:6(DHA)分别占脂肪酸总数的20.41%和10.20%;对西施舌肉营养价值评价结果显示:Gly,Asp、Glu和丙氨酸(Ala)4种呈味氨基酸占水解氨基酸总量的44.77%,占游离氨基酸总量的72.94%;氨基酸评分(SAA)和化学评分(SC)结果都显示第一限制性氨基酸是色氨酸,其SAA值和SC值分别为0.73和0.43,必需氨基酸指数(IEAA)为64.91,牛磺酸含量丰富,质量比为13 830 mg/kg(干基);西施舌含有较丰富的Fe和Zn,在其干基中的质量比分别为130.0 mg/kg和52.0 mg/kg。     

西施舌人工育苗及幼虫、稚贝生长研究

对西施舌 (Coelomactraantiquata)室内人工育苗进行了研究。结果表明 ,西施舌在广东的繁殖高峰期为 5～ 6月 ,用阴干加流水刺激的方法诱导亲贝排放精卵 ,其受精率和孵化率可达 98%左右。 1997年和 1999年两次育苗试验结果 :在盐度为 2 6 .0 0～ 32 .0 0、水温为 2 3～ 2 6℃条件下 ,幼虫在培育密度为 1～ 2mL- 1时生长较好 ,经 9～ 10d培育 ,可进入附着变态期 ,其壳长生长速度为14 .1μm·d- 1。稚贝阶段在日流水量为育苗水体的 1.5～ 2 .0倍时取得较好效果 ,其壳长生长速度为 112 .4 μm·d- 1。     

西施舌3个群体H2A基因和nad6-nad1片段序列比较研究

西施舌(Coelomactra antiquata)浮游幼虫EST序列拼接获得组蛋白H2A ORF及其两翼的非编码区,在ORF两翼设计引物Can-H2AF和Can-H2AR,扩增H2A基因片段;从nad6 3′端和nad1 5′端设计引物,扩增两基因区域DNA序列,测序并进行核苷酸序列差异分析,研究漳州西施舌分化水平。结果:共获得西施舌3个群体H2A基因606bp或616bp基因区DNA片段23条,检测到9种基因型(Gen)。西施舌漳州群体H2A基因AT含量(51.51%)高于日照、北海群体AT含量(50.58%);序列比对分析显示,简约信息位点占4.05%。基于H2A基因的漳州群体与日照/北海混合群体间遗传距离平均为0.044,漳州群体,混合群体内遗传距离分别为0.003和0.004,群体间与群体内遗传距离之比为11~14.7;AMOVA分析结果显示,漳州群体和混合群体间发生了极显著遗传分化(FST=0.937,P0.01)。从nad6~nad1片段中共检出7种单倍型(Hap),漳州群体与日照群体无共享单倍型,基于nad6~nad1的漳州群体与日照群体间遗传距离为0.199~0.202,群体间与群体内遗传距离之比50~66,两个群体间nad1多肽链一级结构存在极大差异,有9个位点的氨基酸不同,日照西施舌缺失6个氨基酸。线粒体DNA显示西施舌漳州与日照群体发生了明显的遗传分化。     

臭氧对西施舌胚胎孵化率和幼虫摄食生长与成活的影响

研究了臭氧处理后的海水对西施舌(Coelomactra antiquata)胚胎孵化率、幼虫摄食率、生长率和成活率的影响。结果表明,臭氧处理后的海水的化学耗氧量(COD)及NH 4-N的浓度明显下降。西施舌胚胎在通入臭氧(4.17mg/L)10min的海水中,孵化率最高,为97%,在充入臭氧25min的海水中孵化率最低,为72.7%;西施舌幼虫在充入臭氧10～15min的海水中和未经处理的海水中生长较快;幼虫在充入臭氧5min和10min的海水中成活率有所提高。将幼虫放在多次充入臭氧的海水中培养,再放回未经臭氧处理的海水进行17h和30h恢复,30h后其死亡率达85%,而在充入臭氧时间短的的海水中死亡率较低,为33.3%,表明西施舌幼虫的生理机能受到了臭氧的不可恢复破坏。     

西施舌群体遗传结构及分化的RAPD分析

采用55个随机引物对西施舌(Coelomactra antiquata)5个群体, 即长乐(CL)、启东(QD)、连云港(LYG)、胶南(JN)和北海(BH)群体进行RAPD 扩增。用PopGen(Version1.32)软件进行遗传多样性分析。结果共筛选出12个重复性好的引物, 得到88条清晰稳定的条带, 扩增片段在100 bp～3 000 bp之间, 其中引物S299扩增的600 bp片段为长乐群体特有。多态位点比例为62.07%～78.26%(JN、LYG、BH、QD、CL群体分别为78.26%、77.05%、72.58%、70.05%、62.07%), Shannon指数为0.210 5～0.312 3。群体间遗传距离为0.068 3～0.223 9,其中长乐群体与其余4个群体间的遗传距离为0.182 7～0.223 9, 4个非长乐群体的遗传距离为0.068 3～0.136 7。群体间遗传分化系数(F_st)为 0.313 01(P<0.05), 表明在整个遗传变异中群体间占31.30%。CL群体与QD, BH, JN, LYG群体间的遗传分化系数(G_st)分别为0.364 9,0.344 8, 0.325 0, 0.309 0;而非长乐群体之间的遗传分化系数为0.148 2～0.240 3;以上数据显示长乐群体遗传分化最大。聚类结果显示, 启东和胶南群体首先聚为一支, 然后与北海群体聚在一起, 再和连云港群体相聚; 而长乐群体则单独形成一支。     

环境因素对西施舌稚贝生长发育的影响

在室内控制条件下,研究了几种环境因素对西施舌稚贝生长发育的影响。结果表明,西施舌稚贝最适生长温度为25.50~27.40℃,最适盐度为24.16~25.66,适应pH为7.5~8.5。壳长1 000~1 200μm的稚贝,在气温25℃与30℃时,干露时间不宜超过25 min;中砂有利于稚贝附着与生长。立体培育的西施舌稚贝,活动强、生长快。     

西施舌ISSR-PCR扩增条件优化

采用CTAB裂解、酚氯仿抽提法,提取了连云港、长乐、北海、胶南等地的西施舌基因组DNA,并从10条ISSR引物中筛选出了能够显示西施舌种群遗传差异的引物835和847,对模板DNA浓度、镁离子浓度、dNTP浓度、引物浓度和Taq酶浓度等条件进行了优化,初步筛选出适于西施舌ISSR分析的最佳反应体系:在25μL体系中,加模板38ng,10×Buffer 2.5μL,镁离子浓度为3.5mmol/L,引物浓度为0.8μmol/L,dNTP为0.3μl(10mmol/L),Taq DiNA聚合酶2U,退火温度为47.2℃。