黑鲷(Acanthopagrus schlegeli)肿瘤坏死因子α cDNA的克隆及特征分析

采用同源克隆的方法，从黑鲷中获得肿瘤坏死因子(TNFα)全长cDNA序列。该序列含1288个核苷酸，可编码253个氨基酸的TNF前体蛋白。它是一种跨膜蛋白，无糖基化位点和信号肽结构。黑鲷TNFα与其它鱼类的TNFα的相似性很高，占据进化上独立的分支；与哺乳类TNFα和TNFG源于共同的祖先。基因结构分析显示，该基因含有TNF家族pmfile和TNF家族的标签序列；在参与TNFα基因二硫键形成的两个半胱氨酸和TNFα三聚体形成的位点高度保守；空间结构模拟显示，它与哺乳类TNFα的空间结构相似，都是由两个β折叠片组成，每个折叠片包含5个反向平行的β链。表达研究结果表明，黑鲷TNFα在检测的各个组织中均为组成型表达，表现为在刺激与非刺激鱼体中，都可以检测到黑鲷TNFα的表达，但是其表达水平在不同组织中有很大差异。黑鲷TNFα在头肾、脾脏和鳃的表达量较高，而在心脏、肝脏、血液、肾脏和大脑中表达量较低。     

变性梯度凝胶电泳在微生物多样性分析中的应用及其技术发展

变性梯度凝胶电泳技术是目前研究微生物群落遗传多样性及种群动态性有效手段,已被广泛应用于土壤、活性污泥、生物膜、动物肠道、热泉、湖泊等环境微生物生态学研究。阐述了变性梯度凝胶电泳的原理,分析其在微生物多样性分析方面的优越性及局限性;并着重介绍了PCR-DGGE应用过程中的技术发展,包括Cloning/DGGE,GC-DGGE,Nested PCR-DGGE和DG-DGGE。     

一株H_5N_1亚型禽流感病毒株NA基因的克隆与序列分析

用RT-PCR方法从1个H5N1亚型禽流感病毒分离株A/Chicken/Guangdong/DH/1997扩增NA基因cDNA片段,将其克隆至pMD18-T载体,获得重组质粒pMD-NA,并对其核苷酸序列进行测定和分析。结果表明,该毒株的NA基因长度为1350bp,编码449个氨基酸,与其它H5N1亚型AIV分离株的核苷酸序列同源性为97.0%～99.4%,氨基酸序列同源性为97.7%～99.1%,提示禽流感病毒NA基因保守性较高。NA基因氨基酸序列的聚类分析表明该毒株与来自香港的A/Pheasant/HK/FY155/01和A/Ch/HK/FY150/01两个分离株处于同一进化枝,亲缘关系较近。     

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)延伸因子EF-2基因全长cDNA克隆及表达

采用RT-PCR和RACE方法克隆了中华绒螯蟹延伸因子EF-2全长cDNA,序列分析表明EF-2全长2752bp,编码846个氨基酸。经BLASTX分析表明,EF-2核苷酸序列与镶边拟蠢蟹EF-2序列的同源性最高,其相似性为88%;所编码的氨基酸序列与甲壳动物EF-2的氨基酸序列相似性都在90%以上。聚类分析显示,中华绒螯蟹EF-2的氨基酸序列与镶边拟蠢蟹EF-2聚为一支,并与其它甲壳动物聚为一体。荧光定量PCR结果显示,EF-2在正常成熟中华绒螯蟹肌肉中表达量最高,精巢、肝胰腺中有少量表达,心脏、卵巢、胃、肠、鳃中有微量表达。检测了不同发育状态的幼蟹、早熟蟹和正常成熟蟹EF-2在肝胰腺、鳃以及肌肉中的相对表达情况;同时也检测了在不同pH处理下幼蟹EF-2在肝胰腺和鳃中随时间变化的相对表达情况,结果显示pH胁迫对幼蟹EF-2表达有一定的诱导效果。     

凡纳滨对虾G蛋白Gαq基因的克隆和功能鉴定

为了寻找并克隆凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)G蛋白α亚基,为研究对虾的生理调控提供理论基础,通过简并PCR和RACE反应获得目的基因的全长cDNA序列;用Blast, DNAstar和Genedoc软件对所得序列进行分析,确定所得序列为凡纳滨对虾G蛋白Gαq基因,命名为pvGαq.将该基因的编码序列克隆到表达载体,通过免疫共沉淀实验和胞内Ca2 , IP3浓度的测定鉴定该Gαq亚基的功能,发现该亚基的序列和功能与其他Gαq家族成员具有高度保守性.用Western blotting分析发现pvGαq在对虾身体各部位存在普遍分布,尤其在脑神经、眼柄、腮和颚片中有大量表达,在嗅觉器官触角也有适量分布.说明了pvGαq在对虾生命活动中的重要性,为研究对虾的生理调控奠定了理论基础.     

MOLECULAR CLONING AND SEQUENCE ANALYSIS OF INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR ⅠcDNA FROM LARIMICHTHYS CROCEA

采用RT-PCR和RACE技术克隆了大黄鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）cDNA的全序列,序列全长2027bp,由57bp的5’非翻译区、1409bp的3’非翻译区和561bp的开放阅读框组成。序列分析表明,大黄鱼IGF-Ⅰ编码区包括信号肽、成熟肽（B、C、A、D）和E等6个区域的186个氨基酸,形成成熟肽时,信号肽和E区被切除,成熟肽分子量7.5kDa,等电点（pI）为7.76,成熟肽的B区和A区有6个保守的半胱氨酸残基,形成3对二硫键,起到了稳定IGF-Ⅰ三维结构的作用。与其它物种的IGF-Ⅰ比对后发现A、B区域比较保守,C、D区域保守性较差;E区域的分析结果表明,大黄鱼IGF-ⅠcDNA序列为Ea-4亚型。核苷酸同源性分析发现,大黄鱼IGF-ⅠcDNA与美国红鱼同源性最高,为99.47%;与斜带石斑鱼、金头鲷和褐牙鲆的同源性依次降低,分别为97.68%、97.50%和95.90%。     

大黄鱼(Larimichthys crocea)IGF-Ⅰ基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR和RACE技术克隆了大黄鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)cDNA的全序列,序列全长2027bp,由57bp的5’非翻译区、1409bp的3’非翻译区和561bp的开放阅读框组成。序列分析表明,大黄鱼IGF-Ⅰ编码区包括信号肽、成熟肽(B、C、A、D)和E等6个区域的186个氨基酸,形成成熟肽时,信号肽和E区被切除,成熟肽分子量7.5kDa,等电点(pI)为7.76,成熟肽的B区和A区有6个保守的半胱氨酸残基,形成3对二硫键,起到了稳定IGF-Ⅰ三维结构的作用。与其它物种的IGF-Ⅰ比对后发现A、B区域比较保守,C、D区域保守性较差;E区域的分析结果表明,大黄鱼IGF-ⅠcDNA序列为Ea-4亚型。核苷酸同源性分析发现,大黄鱼IGF-ⅠcDNA与美国红鱼同源性最高,为99.47%;与斜带石斑鱼、金头鲷和褐牙鲆的同源性依次降低,分别为97.68%、97.50%和95.90%。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)GnRHR基因全长cDNA 的克隆与组织表达分析

采用同源克隆和末端快速扩增(RACE)方法, 克隆了半滑舌鳎中 GnRHR 全长 cDNA。通过基因全长以及推断的氨基酸序列分析, 得知该序列包含一个 7tm-1 保守结构域, 为 G 蛋白偶联受体家族成员。利用 PHYLIP 3.5c 邻位相连法以及 DNAstar 中的 CLUSTAL W 方法对相应的氨基酸序列进行了聚类分析和序列相似度分析。结果表明, 半滑舌鳎 GnRHR 鳉 与鲈鱼、琥珀鱼、虹鳟以及青 等鱼类中的 GnRHR聚为一支, 亲缘关系较近, 且相似度较高, 分别为 90.1%、 89.7%、 79.0%以及 78.3%, 而与高等哺乳动物人、小鼠相似性仅分别为 18.8%和 16.2%, 亲缘关系较远。应用半定量 RT-PCR 技术分析其组织表达, 发现 GnRHR 广泛表达于各个组织, 但表达量差异较大, 在性腺、脑和肾中表达量较高, 其它组织较弱。     

Genomic cloning and expression of vitellogenin gene from the self-fertilizing fish Rivulus marmoratus (Cyprinodontiformes, Rivulidae)

We cloned the vitellogenin gene from the self-fertilizing fish Rivulus marmoratus, and sequenced 12,326 bp. The number of exons of R. marmoratus and rainbow trout vitellogenin genes were different, and also the splicing junctions are different throughout most of the exons and introns but the amino acid similarity of R. marmoratus vitellogenin gene to other species was rather high. In promoter region of R. marmoratus vitellogenin gene, there were several E2 binding sites and the estrogen response element (ERE). We discuss here the gene structure and expression of R. marmoratus vitellogenin gene.     

副溶血弧菌trh基因的克隆、表达及基因缺失株的构建

利用PCR方法从VP基因组DNA中扩增出trh溶血素基因,构建了大肠杆菌原核表达载体,对trh进行了表达和纯化,经溶血活性检测,复性蛋白具有溶血活性.同时还构建了trh基因缺失株,对trh基因进行了基因敲除研究.结果表明,单独敲除trh基因并不能够影响菌株的溶血活性,说明副溶血弧菌还存在其它溶血素基因.