日本七鳃鳗外周血细胞显微结构及类淋巴细胞体外培养

以日本七鳃鳗(Lampetra japonica)为研究对象,观察其外周血细胞显微结构和探讨类淋巴细胞原代培养条件。采用Wright氏和Giemsa氏染色法对日本七鳃鳗外周血液有形成分进行显微观察,可鉴别出红细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞;未发现嗜碱性粒细胞。通过Ficoll密度梯度离心法和流式细胞仪分选获得高纯度的七鳃鳗类淋巴细胞。经条件优化后确定最适培养液L15+20%FBS(5%七鳃鳗血清)+0.46%NaCl,在18℃,pH 6.8-7.0的条件下对日本七鳃鳗类淋巴细胞进行体外培养,大多数类淋巴细胞半贴壁生长,细胞状态较好,最长可以存活近一个月。类淋巴细胞的原代培养为日本七鳃鳗细胞体外培养的深入研究提供了实验依据。     

河北围场地区发现早白垩世七鳃鳗化石

七鳃鳗是一种古老而原始的特殊无颌类脊椎动物。因其仅发育脊索上的小软骨片及口腔内的角质齿,一般很难保存为化石。国内外现存的七鳃鳗化石记录很少,例如南非晚泥盆世的Priscomyzon riniensis、北美石炭纪的Mayomyzon pieckoensis和Hardistiella montanensis,还有我国内蒙古下白垩统义县组的Mesomyzon mengae。近几年,在河北承德围场地区早白垩世地层中发现了丰富的鱼类化石,其中就有七鳃鳗化石,表明围场地区是继内蒙古宁城之后我国第二个重要的早白垩世七鳃鳗化石产地。研究了产自围场地区早白垩世九佛堂组的3件七鳃鳗化石标本（MHGU4270、MHGU4271、MHGU4272）,化石保存基本完整,可见吸盘、眼、鳃囊、肌节、背鳍、后背鳍、尾鳍等构造。成年期个体（MHGU4270、MHGU4271）体长为24～27 cm,体高为1.9～2.0 cm;非成年期个体（MHGU4272）体长约为17.0 cm,体高约为1.2 cm,明显大于内蒙古宁城地区发现的孟氏中生鳗。根据形态结构特征,认为这3件七鳃鳗化石应为一个新的属种,将其命名为围场河北鳗（Hebeimyzon weichangensis gen. et sp. nov.）。围场中生鳗（新属、新种）的发现不仅为我国早白垩世七鳃鳗化石的研究增添了新材料,扩大了研究的区域范围,而且对进一步深化研究早白垩世七鳃鳗的演化历史、生活习性、生态环境和古地理分布具有重要科学价值。     

重组七鳃鳗PHB2蛋白的原核表达及纯化

为了研究PHB2蛋白的生物学活性及后续抗体的制备,作者以前期构建的p MD18-T-Lm-PHB2质粒为模板,PCR扩增Lm-PHB2基因全长CDS区,PCR产物经Hind III和Eco R I双酶切后连接至表达载体p ET-32a,构建重组质粒p ET-32a-Lm-PHB2。将鉴定正确的重组质粒转化入大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta Blue,经IPTG诱导表达后,表达产物通过SDS-PAGE和Western blotting进行检测,利用镍柱亲和层析纯化得到纯度较高的目的蛋白r Lm-PHB2。结果表明,经PCR、双酶切和测序鉴定,所构建的重组质粒p ET-32a-Lm-PHB2序列正确,表达产物存在于裂解菌液的上清和沉淀中,经SDS-PAGE和Western blotting证实在约47 ku处有目的蛋白r Lm-PHB2的表达条带。本研究构建了重组七鳃鳗(Lampetra japonica)PHB2蛋白的原核表达载体,并大量表达和纯化目的蛋白,为该蛋白后续的抗体制备及生物活性研究奠定了基础。     

Microscopic structures of Japanese lamprey peripheral blood cells and culture of lymphocyte-like cells in vitro

以日本七鳃鳗（Lampetrajaponica）为研究对象,观察其外周血细胞显微结构和探讨类淋巴细胞原代培养条件。采用Wright氏和Giemsa氏染色法对日本七鳃鳗外周血液有形成分进行显微观察,可鉴别出红细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞：未发现嗜碱性粒细胞。通过Ficoll密度梯度离心法和流式细胞仪分选获得高纯度的七鳃鳗类淋巴细胞。经条件优化后确定最适培养液L15＋20％FBS（5％七鳃鳗血清）＋0．46％NaCl,在18℃,pH6．8～7．0的条件下对日本七鳃鳗类淋巴细胞进行体外培养,大多数类淋巴细胞半贴壁生长,细胞状态较好,最长可以存活近一个月。类淋巴细胞的原代培养为日本七鳃鳗细胞体外培养的深入研究提供了实验依据。     

东北七鳃鳗和日本七鳃鳗成体形态性状对体质量的影响分析

为研究东北七鳃鳗和日本七鳃鳗形态性状对体质量的影响,测量314尾东北七鳃鳗和302尾日本七鳃鳗成体的体质量(Y)和全长(X_1)、躯干长(X_2)、尾长(X_3)、头长(X_4)、吻长(X_5)、眼径(X_6)、背鳍前长(X_7)、眼后头长(X_8)8个形态性状,运用相关分析、通径分析和回归分析方法,确定影响体质量的主要形态性状,建立体质量和形态性状的多元回归方程。分析结果显示:东北七鳃鳗和日本七鳃鳗体质量服从正态分布,体质量的变异系数最大,全长、躯干长、尾长、头长、吻长、眼径、背鳍前长和眼后头长8个形态性状均与体质量呈正相关(P0.01)。经偏回归系数检验,东北七鳃鳗全长、头长、眼径和眼后头长呈显著性水平(P0.05),其通径系数分别为0.636、0.202、0.060和0.105;日本七鳃鳗全长、吻长和眼后头长呈极显著性水平(P0.01),其通径系数分别为0.730、0.098和0.153。单个性状对体质量的决定系数中,东北七鳃鳗和日本七鳃鳗全长对体质量的决定系数最大。东北七鳃鳗和日本七鳃鳗形态性状的单独决定系数和两个共同决定系数的总和分别为0.855和0.857。建立以东北七鳃鳗全长、头长、眼径和眼后头长4个形态性状为自变量,体质量为因变量的多元回归方程:Y=1.502X_1+2.699X_4+8.554X_6+1.915X_8-41.547;日本七鳃鳗全长、吻长和眼后头长3个形态性状为自变量,体质量为因变量的多元回归方程:Y=4.895X_1+9.688X_5+6.973 X_8-157.460。东北七鳃鳗和日本七鳃鳗成体形态性状对体质量的分析为七鳃鳗优良亲本的人工选育以及其形态学研究提供参考依据。     

利用色谱和飞行时间质谱方法分离并鉴定七鳃鳗血清中凝集素

本研究利用阳离子交换和分子筛的方法成功分离鉴定出分子量为105kDa，以多聚体形式存在七鳃鳗凝集素。实验结果表明，首先运用阳离子交换色谱方法能够将七鳃鳗血清混合组分进行初步分离，结合凝集活性鉴定方法，鉴定凝集活性最强组分存在于第二峰中。其次；利用分子筛方法将具有凝集活性组分进一步分离，最终得到分子量为105kDa左右具有凝集活性组分。结合Native-PAGE和SDS-PAGE结果表明，凝集活性组分以三聚体形式存在。同时，飞行时间质谱方法鉴定结果为凝集素（gi:13094239）。最终，体外鉴定结果表明七鳃鳗凝集素对兔红细胞和山羊红细胞均具有较强的凝集活性。七鳃鳗凝集素的分离纯化对研究七鳃鳗先天免疫防御机制和可变淋巴受体介导的适应性免疫防御机制均具有重要意义。     

七鳃鳗鸟嘌呤转移因子Vav2分子克隆、表达及系统发育分析研究

鸟嘌呤转移因子Vav2为Vav家族成员,其在Ras-related GTP酶活性调节过程中发挥重要作用。本文首次从七鳃鳗体内克隆并表达出七鳃鳗Vav2分子（Lj-Vav2）。系统发育分析结果阐明,Lj-Vav2为脊椎动物Vav2基因家族的直系同源基因。进化动力学分析指明,CH结构域、DH结构域、PH结构域、C1结构域、SH3结构域、SH2结构域贯穿于脊椎动物Vav2家族的进化历程。实时定量PCR结果表明,Lj-Vav2分布于七鳃鳗心脏、肾脏、髓样组织、肝脏、鳃以及类淋巴细胞中,同时经过LPS刺激后淋巴细胞中Lj-Vav2的表达水平呈现明显上调趋势。综上,Lj-Vav2在七鳃鳗体内免疫防御过程中发挥重要作用。此外,我们的研究将为今后更好地阐明Lj-Vav2生物学功能奠定坚实的物质基础。     

补体系统的进化

动物免疫由先天性免疫和获得性免疫系统组成。先天性免疫是机体先天就有的,而且始终存在的防御机制,它们的作用没有特异性。获得性免疫力不是天生就有的,而是个体在发育过程中接触抗原后而逐步发展而来,它对诱发的抗原有特异性。它最早出现在有颌鱼类中。获得性免疫系统区分于先天性免疫系统的主要成分包括免疫球蛋白(Ig),主要组织相     

日本七鳃鳗转化生长因子β I型受体基因(L-Tgfbr1)的克隆与表达分析

作为无颌类脊椎动物的现存代表之一,日本七鳃鳗(Lampetrajaponica)是研究免疫系统起源与进化的重要模型。为了探究TGF-β(Transforming growth factor beta)信号通路在日本七鳃鳗免疫调节中的功能,本研究利用PCR技术克隆了日本七鳃鳗TGF-βⅠ型受体基因(L-Tgfbr1)的编码序列,开放阅读框长度为1 335 bp,编码444个氨基酸残基。L-Tgfbr1蛋白含有已知的TGF-βⅠ型受体分子的主要功能结构域,其中位于胞内的丝/苏氨酸激酶催化结构域保守性较高。系统进化树分析表明,L-Tgfbr1处于脊椎动物Tgfbr1蛋白的底端进化枝上,表明其在Tgfbr1进化史中具有原始性地位。实时定量PCR结果发现,L-Tgfbr1在心脏等组织中的转录水平较高。利用脂多糖注入七鳃鳗激活其先天性免疫应答,L-Tgfbr1在肾脏、鳃、髓小体、肝脏、白细胞、口腔腺中的转录水平呈现一过性的迅速上调。利用免疫印迹进一步验证了脂多糖免疫24 h时后L-Tgfbr1在白细胞中的蛋白表达水平显著上调。利用免疫荧光染色发现L-Tgfbr1蛋白主要分布于七鳃鳗白细胞和髓小体细...