管状蠕虫Ridgeia piscesae TAK1的克隆及其转基因果蝇制备

Ridgeia piscesae是唯一一种存在于东北太平洋Juan de Fuca Ridge热液区的管状蠕虫,我们成功通过RACE PCR获得Ridgeia piscesae TAK1(Rp TAK1)基因全长c DNA序列.为深入研究TAK1基因在管状蠕虫中的作用,本文通过显微注射获得Rp TAK1转基因果蝇,并在果蝇体内成功过表达Rp TAK1基因.我们发现由Rp TAK1编码的氨基酸序列具有一定保守性,可能暗示其功能上的保守性,同时也暗示TAK1蛋白在物种进化中的保守性.而过表达突变体果蝇的眼睛出现变异,包括眼睛变得粗糙、单眼排列不整齐及整体形状变小,可以看出Rp TAK1基因影响果蝇的机体发育,我们猜测在Rp TAK1基因在管状蠕虫的生长发育过程中也可能起到重要作用.     

深海热液区管状蠕虫Ridgeia piscesae β型半乳糖凝集素的克隆与功能研究

Lectins are sugar-specific binding proteins or glycoproteins that play important physiological roles in cellular recognition and regulation. And they are also valuable in medicine and pharmacy. Tubeworm is the representative species around the hydrothermal vent in the deep sea. They have developed unique mechanisms to adapt to the harsh environment. In this study, a 1 092 bp c DNA, designed as rpgal, was first cloned and characterized from the tubeworm Ridgeia piscesae. Sequence analysis showed that RPGAL had low homology with the known galectin. And it had two homologous carbohydrate-recognition domains, which is the characteristic of the tandem-repeat type galectins. The RPGAL was successfully recombinant expressed in Escherichia coli and purified. Analysis of biological activity revealed that RPGAL was metal ion independent and it could agglutinate all the vertebrate erythrocytes tested. It was stable at 10–50°C and p H 5–10. And the hemagglutinating activity of RPGAL was strongly inhibited by D-Lactose and lipopolysaccharide. Although RPGAL had no effect on the microorganisms tested, it showed anti-tumor activity towards He La cells and HT1080 cells, which was accomplished by apoptosis. The study demonstrated that RPGAL was a novel galectin and provided a potential candidate for therapy of anti-tumor.     

热液区管状蠕虫几丁质结合蛋白的克隆表达及功能鉴定

本文应用PCR技术对四种管状蠕虫几丁质结合蛋白进行了扩增,进而连接到pIZ-FLAG构建了重组表达载体,并在昆虫细胞中实现了几丁质结合蛋白的异源重组表达.我们对几丁质结合蛋白的功能进行了初步研究,亲和活性实验结果表明这四种几丁质结合蛋白对α-chitin具有亲和活性,并且可以辅助几丁质酶,对降解α-chitin和β-chitin均有不同程度的促进作用,且作用效果明显.结果表明,这四种几丁质结合蛋白均为α型,且可以促进几丁质酶的活性,对降解几丁质多糖具有巨大的应用潜力和应用价值.     

深海热液区管状蠕虫Ridgeia piscesae新型C型凝集素的克隆与表达

C型凝集素作为凝集素家族的主要成员之一,在无脊椎动物中有着丰富的多样性,其独特的生物学功能广泛应用于生物、医药等诸多领域。本研究从采集于东北太平洋深海热液区胡安·德富卡洋脊的管状蠕虫Ridgeia piscesae中克隆获得了一种新型C型凝集素基因RPCL。该基因与已报道的凝集素的相似性都很低,并且三维结构预测有异于传统凝集素,提示其可能具有一些特殊的功能性质。进一步的原核表达成功实现了 RPCL的异源重组表达,通过透析复性获得了大量可溶性蛋白,为其相关功能性质的研究打下了坚实的基础。     

凡纳滨对虾CTSL基因与生长相关的SNP位点的特征

对3个凡纳滨对虾品系的CTSL基因进行单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）筛查,发现在生长指标差异的对虾中存在特征较为显著的7个SNP位点,其中3个属于外显子上的突变,4个属于内含子上的突变．B210对虾品系体重月平均生长量约为7．58g,体长月平均生长量约为2．31cm,B310对虾品系体重月平均生长量约为3．96g,体长月平均生长量约为1．48cm,HNIT对虾品系体重月平均生长量约为3．04g,体长月平均生长量约为2．18em．从市场价值来看,B210和B310品系比HNTr品系生长相对好些．进一步的PCR产物直接测序比较分析表明在生长指标较好的对虾品系,这7个SNP位点表现为纯合子;而在生长指标较差的对虾品系,在这7个SNP位点上31．6％表现为杂合子．虽然国内外有不少关于CTSL基因SNP位点的报道,但是与生长快慢的相关分析还鲜有报道,且这些SNP位点与前人发现的位点有所不同．本研究发现的CTSL基因的SNP位点与对虾生长快慢相关,将为凡纳滨对虾生长研究提供有用信息,从而有助于为对虾选育提供可靠的分子标记．     

四脊滑螯虾造血组织细胞培养条件的优化

稳定的体外细胞培养体系,可以为基因功能和宿主 病原相互作用研究提供平台。本研究通过对四脊滑螯虾(Cherax quadricarinatus)造血组织(hematopoietic tissue, HPT)细胞的体外培养条件进行优化,以期获得状态稳定、活力良好的造血组织细胞培养物。我们从四脊滑螯虾中分离提取造血组织细胞后,通过对培养基种类(L 15、Express Five、DMEM),谷氨酰胺浓度(0、1%、5%、10%),胎牛血清浓度(0、1%、5%、10%),以及体外培养温度(20、27 ℃)等培养条件进行优化。细胞形态观察和细胞活力分析结果表明,HPT细胞在添加1%青霉素 链霉素、10%L 谷氨酰胺、1%胎牛血清的L 15培养基中状态最佳,在20 ℃培养温度下能存活30 d左右。这些培养条件将有利于四脊滑螯虾造血组织细胞的体外培养。     

凡纳滨对虾4种血蓝蛋白亚型的特征分析

血蓝蛋白是对虾体内的氧运输蛋白,占血浆中蛋白含量的95%以上.研究表明,它参与了许多生理功能,包括蛋白储运,渗透压调节,蜕皮过程以及骨架形成等等.近年来的研究表明,血蓝蛋白还参与了对虾的先天性免疫反应,具有酚氧化酶,抗菌肽、抗病毒等相关生物活性.本研究从凡纳滨对虾中克隆获得了血蓝蛋白L亚基LvHcL,并对其基因组织结构进行了分析.该基因具有丰富的多态性,含有多个SNP位点.研究中发现该基因亚基至少存在4种亚型,其中一种亚型缺失第二个外显子,仅含有2个外显子.对各个亚型的转录水平分析表明,抗病对虾在病毒感染刺激下,各个亚型的转录水平均会被诱导提高.而普通对虾在病毒感染刺激下,各个亚型的转录水平则被抑制.研究结果表明,血蓝蛋白参与了对虾的抗病毒免疫反应.这些结果不仅有助于深入了解对虾血蓝蛋白的免疫学特点,也有助于促进对无脊椎动物抗病毒免疫机制的认识.     

白斑综合症病毒囊膜蛋白VP28单链抗体的酵母表面展示及其抗病毒特性的初步研究

白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是对虾养殖业中危害最大的病原微生物之一,对对虾养殖业造成了巨大的经济损失,但目前尚无有效防治手段.本研究从WSSV囊膜蛋白VP28免疫的小鼠细胞中分别扩增到重链可变区基因和轻链可变区基因,大小为351 bp和342 bp.两基因序列通过Linker序列连接后,构建到酵母表面载体pYD1中,得到重组质粒pYD1-vp28scfv.将该重组质粒在酿酒酵母EBY100中诱导表达,通过免疫荧光实验发现,重组蛋白VP28scFv在酿酒酵母EBY100表面实现展示.进一步通过结合实验表明该展示蛋白具有WSSV的结合活性.本研究在结合酿酒酵母可作为饲料添加剂的特性基础上,对WSSV囊膜蛋白VP28单链抗体的抗病毒特性进行了应用,从而为WSSV的防治提供了新思路.