温石棉通过活性氧激活线粒体通路诱导A549细胞凋亡的机制研究

探讨活性氧(reactive oxygen species,ROS)在温石棉激活线粒体通路诱导A549凋亡中的作用。采用不同浓度温石棉粉尘染毒人肺上皮细胞(A549)后,MTT法检测细胞存活率,流式细胞术检测ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)预处理前后的细胞凋亡率、胞内ROS水平及线粒体膜电位,Western Blot法检测各组细胞半胱天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、p53蛋白表达水平。实验结果显示,温石棉可降低A549细胞存活率,呈现时间-剂量效应关系;NAC可显著减少胞内ROS水平、阻止线粒体膜电位下降,并下调caspase-3、p53蛋白的表达水平,抑制部分细胞凋亡的发生。表明ROS可通过诱导p53蛋白过表达,激活线粒体凋亡通路,诱导A549细胞发生凋亡。     

我国四大矿区温石棉粉尘诱导A549细胞凋亡和周期阻滞的对比研究

通过FT-IR和XRD对四川新康、陕西陕南、甘肃阿克塞和青海茫崖四大矿区温石棉的物相成分、谱学特征进行测试分析,利用MTT法、流式细胞术检测了4种温石棉纤维粉尘染毒A549细胞后的细胞存活率、凋亡率和细胞周期分布,比较和探讨了四大矿区温石棉纤维粉尘抑制细胞增殖能力的大小及其对细胞凋亡和周期阻滞的影响。研究结果显示,四大矿区温石棉的主要物相是斜纤蛇纹石,新康温石棉成分比其他3种温石棉的复杂,阿克塞和茫崖温石棉的成分相似;四大矿区的温石棉化学基团基本相同,阿克塞和茫崖温石棉纤维的表面结构较陕南和新康温石棉的完善。4种温石棉均能不同程度地抑制A549细胞增殖,诱导细胞凋亡和周期阻滞:茫崖组凋亡率最大(22. 56±2. 56)%,陕南组凋亡率最小(19. 57±3. 07)%;细胞周期阻滞均以G2/M期阻滞为主,新康、陕南、阿克塞和茫崖组处于G2/M期细胞比例分别增加8. 90%、8. 58%、9. 13%和10. 44%。4种温石棉导致细胞凋亡和周期阻滞的能力:茫崖新康阿克塞陕南。     

3种硅酸盐矿物粉体对V79和A549细胞的遗传毒性

通过噻唑蓝(MTT)比色法、微核试验、单细胞凝胶电泳实验(SCGE),检测了3种硅酸盐矿物粉体(绢云母、石英、钠长石)对V79和A549细胞存活率、微核及DNA损伤的影响,比较和探讨了3种硅酸盐矿物粉体细胞遗传毒性的差异。研究结果表明,3种硅酸盐矿物粉体均不同程度抑制细胞增殖,诱发细胞染色体和DNA损伤,作用大小顺序均为绢云母石英钠长石,且对V79细胞的增殖抑制率和DNA损伤率均明显强于A549细胞,推测一定浓度范围内的硅酸盐矿物粉体对细胞遗传物质的稳定性可能存在影响,对人体可能具有遗传毒性。     

我国温石棉与其4种代用品致V79细胞肿瘤蛋白谱表达的影响

将中国仓鼠肺细胞(Chinese Hamster Lung Cell, V79细胞)分别暴露于不同浓度的温石棉及代用品粉体悬液中48 h后,MTT检测细胞存活率;免疫组化法检测V79细胞中Survivin、Cap43、Bcl-2、p16和p53肿瘤相关蛋白的分布及表达,分析我国两大主产区的温石棉及4种主要人工代用品对V79细胞的增殖抑制率与肿瘤相关蛋白谱的影响,以探讨我国温石棉及人工代用品是否是导致肿瘤的高危因素之一。结果表明: ① 在6种粉体中,四川新康及陕西陕南温石棉对细胞生长抑制最强,岩棉纤维粉体对细胞生长抑制最弱。各粉体对V79细胞的存活率影响不同,随着暴露粉体浓度的增加,细胞的存活率降低,呈现剂量效应关系。②各染毒组细胞的癌基因Survivin、Cap43、Bcl-2表达的蛋白上调,抑癌基因p16和p53表达的蛋白下调,以胞浆阳性为主。综合以上结果,发现我国不同地区温石棉及其代用品均不同程度抑制V79细胞生长,上调肿瘤相关蛋白Survivin、Cap43及Bcl-2,下调p16和p53,从而诱导癌症的发展。     

正常菌与可吸入矿物细颗粒作用致突变性研究

采用Ames试验分别对蒙脱石、石英、方解石、钠长石4种可吸入矿物细颗粒及其与大肠杆菌、表皮葡萄球菌相互作用48 h后的混悬液作为受试物进行检测,分析IMG是否具有致突变性,及其与人体正常细菌群作用后,IMG/正常菌复合体是否有致突变性毒力改变。结果显示石英以及石英/大肠杆菌复合体对TA98、TA100菌株Ames试验呈阳性反应;石英/表皮葡萄球菌复合体对TA98菌株Ames试验呈阳性反应;而蒙脱石、方解石、钠长石纯矿及其与正常菌作用后的复合体Ames试验结果均为阴性。结果表明石英具有直接致突变作用;石英与正常菌菌作用后复合体依然具有致突变性,但石英表现出的碱基置换突变作用在与表皮葡萄球菌作用后消失,其机制有待进一步研究。     

我国主产地温石棉可吸入纤维致鼠肺损伤与抑癌基因p53、p16的表达

选取我国四大矿区主产地的温石棉,制备成粒径小于10μm的可吸入纤维,采用非暴露式气管滴注法染毒Wistar雄性大鼠,分别于1、3及6个月时称重并处死,迅速分离肺组织,观察肺形态并称量,计算肺脏器系数,并采用HE染色法利用光学显微镜观察肺组织病理改变,RT-PCR法测定p53、p16基因表达,探讨我国温石棉可吸入纤维的生物安全性。结果表明,四大主矿区的温石棉纤维粒度基本小于10μm,符合可吸入纤维粉尘标准,研磨前后纤维粉尘的结构和活性基团无破坏;染毒组Wistar大鼠体重明显减轻,肺重量显著增加,肺脏器系数变大;染毒组Wistar大鼠肺组织发生严重病理改变,出现不同程度的充血、水肿、炎性细胞浸润和纤维增生;染毒组Wistar大鼠肺p53、p16基因表达均降低。综合以上结果,发现我国四大主矿区温石棉的可吸入纤维粉尘均对Wistar大鼠肺组织呈不同程度和方式损伤。随着染毒时间延长,Wistar大鼠肺组织的抑癌基因p53、p16表达显著降低,推测我国四大矿区温石棉的可吸入纤维粉尘具有致肺癌的风险。     

PM_(2.5)降尘诱导A549细胞G2/M期阻滞的机制研究

PM_(2.5)降尘作用于A549细胞后,MTT法检测细胞存活率,扫描电镜观察细胞形态,流式细胞术检测细胞周期改变,RT-PCR检测周期阻滞相关基因p53、p21、CDK1、c-myc和lncRNA H19的表达水平,Western-blot检测周期蛋白cyclin B1表达。通过转染H19 siRNA干扰H19的表达,RT-PCR检测其对p53、c-myc及CDK1表达的影响,以探讨PM2.5降尘诱导A549细胞周期阻滞的作用机制。结果显示,PM2.5降尘暴露可降低A549细胞存活率,随作用浓度及时间增加呈递减趋势,并可观察到细胞形态破坏,细胞膜表面吸附聚集大量粉尘颗粒。PM2.5作用于细胞24 h后,A549细胞增殖阻滞在G2/M期,周期阻滞相关基因p53、p21及H19表达增加,CDK1及cyclin B1表达降低。此外,转染H19 siRNA后成功干扰H19的表达,并调控CDK1表达进一步降低。综合以上结果,PM2.5降尘处理A549细胞后可通过激活p53及p21活性,抑制CDK1和cyclin B1表达水平,诱导G2/M期阻滞从而抑制细胞增殖。短期暴露于PM2.5后,lncRNA H19在染毒细胞中可能发挥特异性癌基因的作用,通过与p53及c-myc结合参与调控细胞周期,干扰H19低表达使细胞G2/M期阻滞更加明显。