瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)卵黄蛋白原的纯化、性质鉴定及ELISA检测方法的建立

腹腔注射17β-雌二醇(E2),使瓦氏黄颡鱼雄鱼在7天内产生卵黄蛋白原(Vtg)。采用凝胶过滤和离子交换两种层析技术,从E2诱导的雄性瓦氏黄颡鱼血浆中分离、纯化出Vtg,采用糖、磷、脂蛋白染色技术证明分离、纯化的蛋白为Vtg,该Vtg在非变性条件下分子量约为240kDa,在SDS变性条件下分子量约为143kDa。纯化的瓦氏黄颡鱼Vtg经检测显示可能含有类胡萝卜素,但没有二硫键,对热相对稳定。利用纯化的瓦氏黄颡鱼Vtg,制备了兔抗瓦氏黄颡鱼Vtg多克隆抗血清。用双向免疫扩散法测得抗血清的纯度较高,效价为1︰32;Western blotting检测显示抗血清的特异性较好。以瓦氏黄颡鱼Vtg多克隆抗血清为抗体,以纯化的瓦氏黄颡鱼Vtg为抗原,建立了间接酶联免疫吸附反应(ELISA)方法检测瓦氏黄颡鱼体内Vtg的含量,标准曲线线性部分的线性方程为y=0.099x+0.4529(R2=0.9327),该方法检测的灵敏度为15.6ng/ml,工作范围为31.2—4000ng/ml,在此范围内,标准曲线具有良好的线性。     

兔抗对虾白斑症病毒(WSSV)独特型抗体的制备及其特性分析

以前期已制备的抗WSSV囊膜蛋白单克隆抗体4G9(Ab1)杂交瘤细胞生产小鼠腹水,腹水经辛酸-硫酸铵法、ProteinG亲和层析法纯化后,用以制备兔抗血清,所得血清经纯化得到粗提的兔抗WSSV独特型抗体(Ab2)。采用竞争酶联免疫吸附实验、间接免疫荧光法、斑点免疫印迹和蛋白免疫印迹等实验方法分析了Ab2特性,结果表明:Ab2能识别Ab1并与WSSV竞争Ab1的抗原结合位点,是具有模拟WSSV特性的抗独特型抗体;Ab2能与中国对虾血细胞结合,并能部分阻断WSSV与血细胞膜的结合;其与中国对虾血细胞膜上结合的蛋白分子量分别为94.5、51.5和27.0kDa,由此推断,这三个蛋白为WSSV在中国对虾血细胞膜上的结合蛋白。本研究结果可为进一步研究WSSV侵染机理提供资料。     

抗杂交鳢(Channa argus×C. maculate)弹状病毒卵黄抗体制备及ELISA检测方法的建立

为确定杂交鳢(Channa argus×C. maculate)弹状病毒卵黄抗体效价水平消减规律并验证抗体对病毒的中和能力,采用杂交鳢弹状病毒灭活疫苗免疫蛋鸡,使用醋酸-醋酸钠-辛酸法制备卵黄抗体,建立间接ELISA检测方法以监测卵黄抗体产生过程抗体水平消减情况,以中和试验评估卵黄抗体中和杂交鳢弹状病毒效果。结果显示, ELISA检测方法 最佳条件为抗原包被浓度0.5×10^5.8 TCID₅₀/0.1 mL, 37℃包被2 h, 37℃封闭2 h。与大口黑鲈蛙虹彩病毒卵黄抗体、SPF蛋黄提取物、免疫前蛋黄提取物以及MBC空细胞均无交叉反应。以S/N(sample/negative)>2.1且敏感性最高为标准确定阳性、阴性样品。卵黄抗体于首免后28 d产生效价,四免后达到最高水平,效价为1︰25 600,平台期可持续40～60 d,通过中和抗体检测结果证明平台期内抗体中和效价在免疫周期内最高,约为46.3。通过ELISA检测方法对卵黄抗体产生规律进行监测,通过中和检测方法评估卵黄抗体中和病毒效果。高滴度卵黄抗体具有被开发为新型抗杂交鳢弹状...