厦门近岸水域海洋附着细菌的群落结构及其动态变化

为研究海洋附着细菌的群落结构及动态变化,在厦门近岸海区进行挂板实验.将无菌玻璃板浸没于海水中,连续放置14 d.分别于放置1 h和7、14 d后取玻璃板上附着生物样品.用细菌通用引物构建16S rRNA基因克隆文库,每个克隆文库随机挑选约40个克隆子测序,序列同源性分析和系统进化分析结果表明,所有的克隆子可分为六大类群:γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、α-变形菌纲(α-Proteobacteria)、蓝细菌门(Cyanobacteria)和真核硅藻类叶绿体,各类群分别占42.0%、4.5%、2.2%、2.2%、1.1%和45.0%.γ-变形菌纲变形斑沙雷氏菌(Serratia proteamaculans)为优势附着细菌,占测序克隆子的31.5%.这类细菌在1 h样品中的比例超过一半,说明变形斑沙雷氏菌在生物膜形成初期发挥着重要作用.随着挂板时间延长,检测到的细菌类群有所增加:附着7 d后检测到拟杆菌门细菌,附着14 d后检测到厚壁菌门细菌.γ-变形菌纲细菌所占比例随挂板时间的延长而逐渐降低,从挂板1 h的81%降至7 d的21%,14 d的18%.另外,在各阶段的附着样品中,都检测到较多的真核克隆子序列,约占16%～64%.本研究为进一步阐明海洋附着细菌的附着动态及其在生物膜形成过程中的作用奠定了基础.     

Adhesion mechanisms of Vibrio fluvialis to skin mucus of Epinephelus awoara

Vibrio fluvialis incubated in trypticase soy broth (TSB) showed stronger adhesion to the skin mucus of Epinephelus awoara than V. fluvialis grown on trypticase soy agar (TSA), and this bacterial adhesion was assessed in terms of saturation kinetics. Treating bacteria with antibody against O-antigens resulted in significantly reduced bacterial adhesion. In the early growth stage, the adhering bacteria numbers increased with incubation time, peaked at 24 h, and then dropped sharply. Prior heat treatment of the mucus at various temperatures resulted in different effects on bacterial adhesion. No remarkable effect on bacterial adhesion was detected after treating mucus with protease K and trypsin, whereas periodic acid treatment significantly enhanced bacterial adhesion. Extracts of V. fluvialis surface structures at high concentrations significantly inhibited bacterial adhesion, while relatively low concentrations enhanced adhesion. V. fluvialis had strong affinity for a high molecular weight mucus component. These results indicate that V. fluvialis adhered strongly to E. awoara mucus by specific adhesion and that this adhesion was influenced by many factors, including bacterial conditions, mucus, and the environment.     

溶藻弧菌的间接荧光抗体快速检测

建立了大黄鱼病原溶藻弧菌的间接荧光抗体检测方法，溶藻弧菌的特异性抗血清由新西兰兔制备，试管凝集法测定抗血清及交叉反应效价，吸附离心法去除交叉反应，荧光抗体为异硫氰酸荧光素标记的羊抗兔免疫球蛋白，现场检测对具典型弧菌病表症大黄鱼病原检出率为100％，表观健康大黄鱼病原检出率为30％，养殖海水检测结果均为阴性，结果表明，间接荧光抗体检测法不仅可以用于已感染发病大黄鱼的快速检测，而且还能用于已感染未发病大黄鱼的检测。     

大黄鱼病原菌──溶藻弧菌的ELISA快速检测研究

以灭活溶藻弧菌（0.05%甲醛，30℃,8h）制成菌苗，注射免疫实验兔获得抗血清。该抗血清经吸附后与副溶血弧菌、河流弧菌等10株对照菌株无交叉反应，用该抗血清进行溶藻水中溶藻弧菌浓度均低于最低检测限、外观健康大黄鱼肝脏中溶藻弧菌的阳性检出率为20%、患病大黄鱼的阳性检出率为80%，表明ELISA法不仅可以用于诊断大黄鱼的溶藻弧菌病，也可能检测无病症带菌大黄鱼。     

溶藻弧菌脂多糖对大黄鱼的毒性与免疫保护性试验

用酚水法从20dm3大黄鱼的病原菌--溶藻弧菌菌液分离出脂多糖(LPS)溶液380cm3,冻干后得到LPS粉末97.6mg.在注射剂量为0.2cm3不同浓度LPS溶液对大黄鱼肌肉注射毒性试验中,LPS注射浓度为0.5 mg/cm3 时, 5d内能引起大黄鱼死亡;当LPS浓度提高到2 mg/cm3时,大黄鱼的死亡率达到100%.以剂量为0.2 cm3、浓度为0.2 mg/cm3的LPS溶液对大黄鱼进行免疫注射,15d后用0.2cm3浓度为9×108 个/cm3的溶藻弧菌进行攻毒试验,40%的大黄鱼获得免疫保护.     

致病性副溶血弧菌生物膜形成特性研究

采用改良的微孔板法测定了12株弧菌的形成生物膜的效果,选择形成生物膜效果最好的副溶血弧菌ND-02,进一步研究了环境因子对其生物膜形成的影响。实验结果显示副溶血弧菌ND-02菌株在静置培养24～36 h后形成成熟的生物膜,在起始菌浓度为107～108CFU/mL形成生物膜的量最大;在30℃,NaCl浓度为3%～5%,pH偏弱碱性时的生物膜OD590值最大;C 2a+促进副溶血弧菌生物膜的形成,而M 2g+抑制生物膜的形成;副溶血弧菌在分别经大黄鱼表皮黏液、肠黏液和肝脏提取液包被的的基质上形成生物膜的作用明显,鳃黏液和脾脏提取液中次之,肌肉提取液包被后生物膜形成量最低。以上结果表明,副溶血弧菌ND-02菌株能形成稳定而明显的生物膜,而且生物膜的形成受温度、NaCl浓度、pH值等环境因子的影响。     

河流弧菌(Vibrio fluvialis)对牙鲆(Paralichthys olivaceus)粘液的趋化和粘附作用

采用生长曲线法测定了河流弧菌在牙鲆表皮、鳃和肠粘液中的生长情况，结果表明，河流弧菌在3种粘液中都能生长，生长前期符合Logistic模型，然后进入Gompertz模型，在鳃粘液中的生长量高于肠粘液和表皮粘液。采用毛细管法研究了河流弧菌对牙鲆3种粘液的趋化作用，结果表明，河流弧菌对牙鲆3种粘液具有较强的趋化应答，在粘液总蛋白含量相同的情况下，河流弧菌对牙鲆鳃粘液的趋化应答显著强于对表皮粘液的趋化应答（P〈0．05），而对肠粘液的趋化应答极显著低于对鳃粘液和表皮粘液的趋化应答（P〈0．01）。采用^3H—TdR示踪法进行了河流弧菌对牙鲆3种粘液的粘附作用研究，结果表明，河流弧菌对牙鲆表皮粘液和鳃粘液的粘附率较高，而对肠粘液的粘附率较低，特别是孵育30、60和90min时河流弧菌对牙鲆表皮粘液和鳃粘液的粘附率显著高于对肠粘液的粘附率（P〈0．05）。这些结果表明，河流弧菌能够在牙鲆粘液，尤其是鳃粘液中生长和定植，有利于其进一步感染、致病。     

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)内脏白点病病原分离鉴定及致病性研究

于2013年4月从宁德患内脏白点病大黄鱼(Pseudosciaena crocea)中分离得到两株优势菌NZBD9和NZBD11,这两株菌在16—19°C条件下回归感染能引起大黄鱼内脏白点病,而在7—10°C和24—27°C条件下同样的人工感染不能致病,从而证实这两株菌为大黄鱼内脏白点病的病原菌。经16S rDNA基因的测序和时间飞行质谱微生物鉴定仪分析,NZBD9和NZBD11同为变形假单胞菌。药敏性实验结果显示NZBD9对庆大霉素、诺氟沙星和四环素等7种药物高度敏感。组织病理学观察结果显示病鱼的肝脏、脾脏、头肾等组织中均出现明显病症,如变性和坏死。     

大黄鱼病原弧菌耐药质粒转移研究

用混合培养法进行耐药质粒从大肠杆菌 (Escherichiacoli)向病原弧菌转移研究 ,结果表明 ,耐药质粒 pBR322和 pBR325可以从大肠杆菌向病原弧菌转移。在混合培养30min后 ,部分弧菌获得耐药质粒 ,质粒的转化率随着培养时间的延长而增大 ;混合培养24h后 ,转化率分别提高至4.62×10-6～1.18×10-5。耐药质粒 pBR322和 pBR325在2株病原弧菌细胞内能较为稳定地遗传 ,在培养初期 (0～1h) ,均未出现质粒丢失 ,随着培养时间的延长 ,有少量细胞因丢失耐药质粒而表现出对药物的敏感性 ;培养72h后 ,质粒 pBR322和 pBR325在副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)中的丢失率分别为10 %和9% ,溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)中2种质粒的丢失率分别为22%和19 %。细菌的药敏试验表明不同菌株在获得耐药质粒后对特定药物的抗性大大增强 ,但不同菌株的耐药水平有所不同 ,说明耐药质粒在不同菌株中的表达水平有所不同。