虾类体液免疫研究进展

近年来,由于受病害影响,对虾养殖业蒙受了巨大的损失。传统上治疗和预防虾类疾病主要依赖抗生素、化学药物等,这些药物的滥用造成环境污染、药物残留、产生耐药性细菌等严重问题,对安全水产品的生产、出口创汇带来负面影响。因此,人们已开始把注意力转移到对虾的免疫机制,并越来越重视提高虾类自身的抗病能力。一般认为,甲壳动物的免疫主要为非特异性免疫,其体液不具有免疫球蛋白。然而许多体液免疫因子在甲壳类动物机体的免疫防御反应中具十分重要的作用。这些因子包括天然形成和诱导产生的各种生物活性分子,主要有血淋巴中各种抗菌因子、…     

溶藻弧菌胞外产物注射赤点石斑鱼后的组织病理学观察

在注射溶藻弧菌胞外产物（ECP）48h后，石斑鱼Epinephelus akaara出现死亡．临床痱状表现为；运动迟缓．体色变深．腹部膨大．腹腔有明显的积水．肝脏出血有花斑．肾脏和脾脏肿大。病理组织切片观察发现：肝细胞坏死，解体．界限模糊．细胞核变形、裂解甚至消失；肝脏出血．肝索中有红细胞浸润．有的红细胞变形甚至破裂；肾小管上皮细胞脱落、坏死；肠粘膜上皮细胞脱落、坏死．微绒毛不整齐．模糊不清．脱落；脾窦和脾索不清晰．分界不清．且在脾窦和脾索中分布着大量的、形态不规则的红细胞。此外．还发现在肝脏、脾脏、肾脏、肠壁肌层、心肌和鳃等组织中存在一种相同结构，该结构有平滑肌环绕．管腔内壁衬以扁平上皮细胞．管腔中含有一团染成紫红色的物质．经推断为小动脉透明样变性．而在正常的组织切片中．均无此结构。     

尼罗罗非鱼pik3r1基因的克隆和mRNA表达分析

【目的】哺乳动物pik3r1基因参与多种免疫途径,探索pik3r1基因在罗非鱼(Oreochromis)中的作用。【方法】克隆尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)pik3r1(命名为On-pik3r1)cDNA全长,对该基因进行生物信息学分析,并运用荧光定量PCR方法分析无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)刺激后On-pik3r1 mRNA在各组织种的表达模式。【结果与结论】On-pik3r1基因编码区2190 bp,编码729个氨基酸,5′端非编码区(UTR)为542 bp,3′UTR为2248 bp,理论分子质量为83.99 ku,等电点为5.73。On-pik3r1与斑马拟丽鱼(Maylandia zebra)相似性最高(98.53%),与其他物种的同源性在70%以上,表明pik3r1在物种进化过程中高度保守。On-pik3r1在健康尼罗罗非鱼各组织中均有表达,在肌肉中表达量最高,其次是鳃、皮肤,在胸腺中表达量最低。经灭活无乳链球菌刺激后,On-pik3r1表达量在肠道、鳃、脾脏、头肾、脑部等5个组织中均极显著下调(P<0.01),在胸腺中表现为4 h时极显著下调(P<0.01),24、48、72 h时为显著下调(P<0.05)。On-pik3r1参与了罗非鱼的对无乳链球菌的免疫应答过程。     

脂多糖、苯酚、硫酸铜对红笛鲷非特异性细胞毒性细胞受体基因表达的影响

应用Real-time PCR技术,研究脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、苯酚、硫酸铜刺激红笛鲷(Lutjanussanguineus)后非特异性细胞毒性细胞受体(NCCRP-1)基因在不同组织里的表达差异。结果发现,LPS刺激红笛鲷24 h后NCCRP-1在红笛鲷头肾、脾脏、胸腺、肝脏、心脏、脑、肌肉和肠组织中均有表达,其中头肾表达量最高,脾脏次之,然后依次是肝脏、脑、肌肉、胸腺和肠,心脏表达量最少。LPS、苯酚和CuSO4刺激红笛鲷后,随着刺激时间的增长,NCCRP-1表达量在各组织达到峰值的时间不同。以头肾为模式组织,RT-PCR的结果显示,红笛鲷NCCRP-1在LPS、苯酚和CuSO4的刺激下的表达模式相似,随着时间的增加NCCRP-1表达量逐渐增加,分别在24、9、12 h处达到最高,达到对照组的52、30、24倍左右,之后表达量开始下降。免疫组织化学表明,NCCRP-1只在头肾、脾脏和胸腺的特定细胞中表达。     

罗非鱼源无乳链球菌培养基及培养条件的优化

研究无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)ZQGY08的培养与生长特性,探讨脑心浸液(Brian Heart Infusion,BHI)培养基的营养因子、初始pH值、溶氧、温度等因素对无乳链球菌生长的影响,并采用正交实验法对无乳链球菌培养基营养因子添加量进行优化。结果表明,无乳链球菌生长的最适初始pH为7～8,培养温度为28～37℃,振荡转速为180～200 r/min。在BHI培养基中添加20 mg/mL的酵母粉和2 mg/mL的葡萄糖即可在对数期获得最大细菌量。     

无乳链球菌灭活疫苗对罗非鱼的免疫效果

制备无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)临床分离株ZJ02的灭活疫苗,采用注射和浸泡2种方法,研究疫苗对吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)的免疫保护效果和血清抗体效价。注射组以4个不同浓度的白油佐剂灭活疫苗免疫罗非鱼,浸泡组以相同免疫剂量的灭活疫苗分别与消旋山莨菪碱、脂肪醇聚氧乙烯醚和氯化钠3种佐剂免疫罗非鱼。结果显示,无乳链球菌疫苗对罗非鱼具有较强的免疫原性,与对照组相比,免疫组血清中的抗体效价水平均显著性提高(p<0.05),注射组和浸泡组的抗体效价最高分别达到1∶256和1∶128;注射组中不同剂量的疫苗免疫组免疫保护率较高,高浓度组可达到95%,浸泡组中使用3种佐剂的免疫组免疫保护率分别为59%、64%、55%。表明无乳链球菌灭活疫苗对罗非鱼具有很好的免疫保护性,免疫剂量在5×108~4×109cfu/mL之间对注射免疫效果有显著性影响,消旋山莨菪碱、脂肪醇聚氧乙烯醚和氯化钠对浸泡免疫效果具有不同的免疫保护率。     

红笛鲷CD40和去除信号肽CD40的原核表达

根据红笛鲷(Lutjanus sanguineus)CD40基因cDNA全长序列设计2对特异性引物,利用RT-PCR技术从红笛鲷头肾组织中扩增出CD40 ORF序列和去信号肽序列,分别与原核表达载体pET-32a(+)相连,构建原核重组表达质粒,命名为pET32-CD40和pET32-△CD40,并分别转化至大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导后,分别于54 ku和53 ku处有清晰的目的蛋白条带。融合蛋白的表达效率最佳的表达条件,pET32-CD40是诱导温度37℃,起始D(600nm)为0.4,IPTG浓度为0.08 mmol/L,诱导5 h;pET32-△CD40是诱导温度37℃,起始D(600nm)为0.6,IPTG浓度为0.10 mmol/L,诱导6 h。在各自优化的表达条件下,pET32-△CD40融合蛋白表达量较pET32-CD40融合蛋白高。RNAstructure软件分析发现,CD40的mRNA 5′端序列形成复杂且较为稳定的二级结构,不利于翻译的起始,表明信号肽序列的存在可能对CD40基因在原核细胞中的表达有一定的影响。     

单细胞转录组测序技术在水产养殖领域的应用

单细胞转录组测序技术可揭示不同组织细胞间和同一组织不同细胞间的异质性,已大量用于模式物种研究,但在水产养殖物种中的应用则处于起步阶段。综述单细胞转录组测序技术在水产养殖物种的人工繁殖、良种选育和病害防控相关研究中的应用,指出其在应用过程中存在样本采集、单细胞分离、数据分析方面的困难,并提出相应的解决举措,展望其在水产养殖领域内应用的发展前景,为促进单细胞转录组测序技术在水产养殖领域的广泛应用提供参考。     

溶藻弧菌外膜蛋白对凡纳滨对虾免疫功能的影响

应用溶藻弧菌外膜蛋白(Outer membrane protein,OMP)注射凡纳滨对虾Penaeus vannamei,测定其对凡纳滨对虾免疫指标的影响以及对凡纳滨对虾的免疫保护作用。注射OMP0.5、1.0和1.5mg.ml-1后3个实验组的凝集效价均显著高于对照组(p<0.05),但实验组之间差异不显著,而血清溶菌活力在注射后急剧上升,在6h时达到最高,随后下降,到96h时基本恢复正常。0.5和1.0 mg.ml-1OMP组的抗菌活力在12h时达到最高值,且在12—72 h之间均明显高于对照组和1.5 mg.ml-1组(p<0.05)。血清溶血活力在注射后3h达到最高值,在1—96h内,实验组的溶血活力维持较高水平,均高于对照组。0.5、1.0和1.5mg.ml-13个OMP实验组对凡纳滨对虾的免疫保护率分别为65.9%、75.6%和70.7%。     

尼罗罗非鱼Galectin-3基因的原核表达与条件优化

【目的】对Galectin-3蛋白进行纯化,优化诱导相关表达条件,为大量获取罗非鱼Galectin-3蛋白提供方案。【方法】根据NCBI上已公布的罗非鱼(Oreochromismossambicus)Galectin-3基因序列,设计多对带Eco RI和Xhol酶切位点的引物,筛选出良性扩增引物,对罗非鱼cDNA经进行聚合酶链式反应(PCR)扩增、限制性快切酶双酶切、T4连接酶连接等步骤,构建罗非鱼Galectin-3基因的原核表达质粒pGEX-4T-Galectin-3,将重组质粒导入大肠杆菌BL21中,进行Galectin-3重组蛋白的表达。并比较不同的诱导温度、诱导时间、IPTG浓度条件下的表达效果,对Galectin-3蛋白表达最优条件进行筛选。【结果】构建了罗非鱼Galectin-3原核表达质粒,进行Galectin-3重组蛋白后发现37℃下,0.4 mmol/L浓度的IPTG诱导5 h即可诱导Galectin-3重组蛋白高效表达。免疫印迹结果显示,经蛋白纯化柱纯化后的pGEX-4T-Galectin-3重组蛋白可与GST-Tag单克隆抗体发生特异性反应,进而表明表达的重组蛋白是罗非鱼的Galectin-3蛋白。【结论】本研究成功构建了罗非鱼Galectin-3基因的原核表达载体,并确定了Galectin-3融合蛋白最适的表达条件:37℃下,0.4 mmol/L浓度的IPTG诱导5 h。