PaCLR介导PaLECT2激活脂多糖刺激的香鱼(Plecoglossus altivelis)单核巨噬细胞功能

香鱼(Plecoglossus altivelis)白细胞衍生趋化因子2(leukocyte cell-derived chemotaxin 2,PaLECT2)可以激活香鱼头肾来源的单核巨噬细胞(monocytes/macrophages,MO/MΦ),提高细菌感染后香鱼存活率。进一步研究显示,PaLECT2与香鱼C型凝集素受体(C-type lectin receptor,PaCLR)相互作用可激活静息状态下香鱼MO/MΦ,增强其免疫活性。在前期基础上,本研究通过抗体封闭实验检测PaCLR是否介导PaLECT2激活LPS刺激的MO/MΦ功能。结果显示,重组PaLECT2成熟肽(rPaLECT2m)显著提高了LPS刺激的香鱼MO/MΦ细胞因子的表达,并增强了其吞噬能力和杀菌活性。封闭PaCLR显著抑制了rPaLECT2m激活LPS刺激的香鱼MO/MΦ细胞因子表达、吞噬和杀菌功能。因此,PaCLR介导PaLECT2可以激活病理状态香鱼MO/MΦ。这一认识进一步揭示了LECT2在病理状态的鱼类巨噬细胞调控和炎症反应中的作用及机制。     

香鱼(Plecoglossus altivelis)铁蛋白的分子鉴定、表达及功能研究

铁蛋白(Ferritin,Fer)是一类广泛存在于生物体内、并与铁代谢密切相关的铁储存蛋白。本研究通过香鱼(Plecoglossus altivelis)单核/巨噬细胞转录组测序获得铁蛋白亚基基因(Pa Fer)c DNA全序列,结果显示,Pa Fer由943个核苷酸组成,开放阅读框为531bp,编码176个氨基酸,预测相对分子质量为20.4k Da,等电点为5.46。氨基酸序列多重比对结果显示,Pa Fer具有保守的铁蛋白样双铁结构域,与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)和大西洋鲑(Salmo salar)Fer M亚基(Fer-M)同源性最高,均为92%;系统进化树分析表明,Pa Fer与胡瓜鱼、大西洋鲑和虹鳟的Fer-M聚为一个小簇,与虹鳟Fer-M进化相关性最高。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q PCR)结果表明,Pa Fer m RNA主要在香鱼脾脏中表达量最高,肾脏、鳃、脑和心脏中次之;鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后,香鱼肝脏、脾脏和肾脏等组织中Pa Fer m RNA表达显著上调。原核表达了Pa Fer重组蛋白(r Pa Fer),r Pa Fer以包涵体形式表达,镍柱亲和层析纯化重组蛋白,尿素梯度透析法复性r Pa Fer。铁螯合实验结果显示,当r Pa Fer浓度为4μg/m L时,螯合铁的能力最大,为43.96%。抑菌实验结果表明,r Pa Fer对鳗弧菌、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的最小抑菌浓度分别为1.5625、25.0和100.0μg/m L。综上,Pa Fer与香鱼抗病原感染的免疫反应紧密相关,可能通过调控铁代谢参与鱼类抵抗微生物的宿主自身免疫过程。本研究为进一步研究鱼类Fer的功能及在病原菌感染免疫中的分子机制奠定基础。     

副溶血弧菌特异性卵黄抗体(AHPND-VpIgY)对凡纳滨对虾幼体被动免疫和育苗成活率的影响

将抗高致病性副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)特异性卵黄抗体(AHPND-VpIgY)应用于育苗生产,通过测定氨氮、亚硝酸盐、细菌总数、弧菌总数、相对保护率和育苗成活率,评价了AHPND-VpIgY在育苗期对凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)幼体的保护效果。结果表明,0.1g/m3和0.2g/m3AHPND-VpIgY组的相对保护率为35.7%和57.2%,两者均显著高于非特异性卵黄抗体组(P0.05);两组的育苗成活率为50.8%和57.2%,比对照组分别提高19.1%和25.6%。各实验组氨氮、亚硝酸盐、细菌总数及弧菌总数与对照组无显著差异,对水质无影响。综上,特异性的AHPND-VpIgY能在不改变水质的前提下,有效提高凡纳滨对虾幼体的存活率、相对保护率和育苗成活率,从而提高凡纳滨对虾苗种产量和质量。     

传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)在双壳贝类中的感染情况研究

采用国际兽医局推荐的传染性皮下及造血组织坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)检测方法,首次开展IHHNV在双壳贝类(中国蛤蜊、泥蚶、花蛤、缢蛏、文蛤和白蛤)和螺类软体动物(螺蛳、中华圆田螺)中的感染情况。此外,本研究以泥蚶为研究对象,建立了IHHNV在双壳贝类中的实验室感染模型,研究了人工感染泥蚶后IHHNV在其体内的增殖和致病情况。结果显示:在采集的不同种类贝类样品中均检测到IHHNV,其中在泥蚶中的阳性率最高(50%),在文蛤中的阳性率最低(15%),表明IHHNV在双壳贝类中的分布较为广泛,是IHHNV的重要携带物种。在采集的螺类软体动物中均未检测到IHHNV。系统发育分析表明,来自不同贝类中的IHHNV构成了进化树中不同的分支,其中中国蛤蜊、花蛤、白蛤源的IHHNV属于Ⅱ型感染株,而泥蚶、缢蛏、文蛤源的IHHNV单独成簇,形成了一个全新的分支。实验室感染结果显示,IHHNV对泥蚶没有明显的致病性,但可在其体内增殖,在感染后第5天其体内的病毒载量达到最大(1.8×104copies/g),随着感染时间的增加,其体内病毒含量呈现递减趋势,但在感染后第30天体内仍可检测到病毒的存在。本研究结果对对虾养殖尤其是虾贝混养模式中预防和控制IHHNV的传播具有重要意义。     

大黄鱼(Larimichthys crocea)白细胞介素10(IL-10)基因克隆及溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)侵染后表达变化分析

白细胞介素10(interleukin10,IL-10)是鱼类先天性免疫因子之一,在炎症反应和免疫调节中有着重要作用。本研究获得大黄鱼(Larimichthys crocea)IL-10基因cDNA序列,由899个核苷酸组成,含1个555bp的开放阅读框、编码184个氨基酸,预测编码蛋白分子量为21.24kDa、N端有22个氨基酸组成的信号肽序列。氨基酸序列多重比对表明大黄鱼IL-10具有IL-10家族特征性序列和构成2对二硫键的4个保守性半胱氨酸,与欧洲鲈(Dicentrarchuslabrax)IL-10序列相似性最高(78.5%);系统进化树分析显示大黄鱼IL-10和其他鱼类IL-10形成一个大簇,与欧洲鲈进化关系最近。荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测结果显示健康大黄鱼IL-10基因在鳃和肠中高表达,肝和头肾中低表达;溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)侵染后大黄鱼肠、脑、脾、肝和头肾中IL-10基因表达量均显著上调(P0.05),其中头肾和肝中上调幅度最大(分别为菌侵染前的10.06倍和8.79倍)。综上,大黄鱼IL-10基因表达与病原菌感染密切相关,为深入研究大黄鱼IL-10的生物学功能及免疫机制提供了基础资料。     

梅氏新贝尼登虫(Neobenedenia melleni)卵黄铁蛋白的cDNA克隆、原核表达及抗血清制备

从cDNA文库中获得了梅氏新贝尼登虫卵黄铁蛋白(NmYF)的编码序列。序列全长739个核苷酸,3′-末端具有polyA尾,单一大开放阅读框编码一个由226个氨基酸组成的分子量为26.1kDa的蛋白。序列比较表明,NmYF与卫氏并殖吸虫卵黄铁蛋白最相似,氨基酸序列同源性为23.7%。系统进化树分析表明,NmYF、卫氏并殖吸虫卵黄铁蛋白和头槽绦虫卵黄铁蛋白形成了一个小的进化簇,而体铁蛋白序列形成了一个大的进化簇,揭示了卵黄铁蛋白和体铁蛋白间的差异以及进化上的相关性。这是梅氏新贝尼登虫卵黄铁蛋白基因序列的首次报道。随后,构建了插入有全长NmYF基因开放阅读框序列的原核表达质粒pET-22b-NmYF,转化大肠杆菌BL21pLysE菌株,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE检测表明预期大小的目的蛋白大量表达。随后制备了目的蛋白的多克隆抗血清,它能与目的蛋白起强的特异性反应,但与细菌自身蛋白不起反应,可用于后续研究。     

海水养殖环境中拟除虫菊酯类农药降解菌的分离鉴定及降解特性研究

从近岸海水养殖环境中分离获得一株能高效降解氯氰菊酯(Cypermethrin,CYP)和溴氰菊酯(Deltamethrin,DEL)的菌株HS-10,经生理生化和16S rDNA分析,初步鉴定其为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)。不同降解条件下的实验结果表明,菌株HS-10在pH 7.0、温度28°C的环境中具有较好的生长和降解效率,在该条件下,对初始浓度为100mg/L的CYP和DEL的降解效率分别为75.6%和90.9%。进一步采用发光细菌和核磁共振(NMR)方法对菌株HS-10的降解产物进行分析,结果表明,CYP和DEL主要通过微生物降解消除,其降解产物的毒性显著降低。同时,考察了菌株HS-10对氯氰菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯(BIF)、氟氯氰菊酯(CYF)和氰戊菊酯(FEN)5种拟除虫菊酯类农药(浓度分别为100mg/L)的降解效率,结果表明,对5种农药的降解率均达到50%以上,本研究获得的菌株HS-10可用于海水养殖环境中拟除虫菊酯类农药残留污染的生物修复。     

香鱼(Plecoglossus altivelis)养殖群体遗传多样性的AFLP分析及性别特异性分子标记筛选

采用扩增片段长度多态性(AFLP)技术分析了香鱼(Plecoglossus altivelis)养殖群体的遗传多样性,并筛选性别特异性分子标记。结果表明,15对选扩引物组合共扩增到889个位点,其中多态性位点380个,多态率为42.74%;群体Nei氏遗传多样性指数为0.1454,Shannon氏指数I为0.2174。香鱼养殖群体的遗传多样性较丰富,处于中等偏上水平。仅引物组合E-ATG/M-CTG扩增到1条雄性特异性条带,长度为139bp。以该雄性特异性AFLP条带的DNA序列为模板,设计1对特异的PCR引物并在10尾已知性别的香鱼(雌雄各5尾)中扩增检验,结果显示5尾雄鱼均可扩增到目的条带而5尾雌鱼均无扩增。表明该序列是雄性特异性分子标记,可用于鉴别香鱼的遗传性别,并为香鱼的性别决定机制和性别控制研究奠定基础。     

应用LAMP-LFD技术可视化检测河流弧菌(Vibrio fluvialis)的研究

以河流弧菌(Vibrio fluvialis)为检测对象,将环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)与横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)联合应用,建立了快速便捷的LAMP-LFD方法。该方法以河流弧菌的外膜蛋白omp U基因作为检测靶标,在其保守区域设计6条特异性引物(上游内引物由生物素标记),并在两条外引物的有效扩增区段内设计1条特异性探针,由异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记。使用引物进行有生物素标记的LAMP反应,产物与FITC标记的探针完成杂交,杂交产物在LFD上进行结果展示。结果表明,LAMP-LFD方法可特异性地检出河流弧菌,对近似物种如创伤弧菌等弧菌病原以及迟缓爱德华菌等其他水产养殖病原的检测均呈阴性。经优化,LAMP的反应条件为63°C反应25min,加上5min的探针杂交和3—5min的LFD显色,整个检测时程约35min。利用该方法最低可检测到1.0×10~2 CFU/m L的河流弧菌纯培养物,能够从污染强度为5.0×10~2 CFU/m L的组织样品中检测到该病原。该方法设备依赖性更低,仅需简单的恒温加热设备即可完成。因此,本研究建立的河流弧菌LAMP-LFD方法,具有操作便捷,设备依赖性低、灵敏度高和检测快速等优点,在河流弧菌的基层检测中具有良好的应用前景。