三氯生对雌性斑马鱼肝胰脏凋亡相关基因表达的影响

【目的】研究三氯生(TCS)对雌性硬骨鱼类肝胰脏损伤的相关分子机制。【方法】采用半静态水体接触染毒法,将雌性斑马鱼(Danio rerio)暴露于0、0.017、0.034、0.068 mg/L的TCS溶液42 d,采用普通PCR和实时荧光定量PCR技术测定雌性斑马鱼肝胰脏凋亡相关基因(Bcl-2、p53、MDM2、Bax)的表达情况。【结果】0.017~0.068 mg/L组的雌性斑马鱼肝胰脏Bcl-2、MDM2和Bax基因的表达极显著下调(P<0.01),p53基因的表达极显著上调(P<0.01)。【结论】0.017~0.068 mg/L的TCS显著影响雌性斑马鱼肝胰脏凋亡相关基因的表达,促进雌性斑马鱼肝胰脏细胞凋亡的发生。     

海洋土曲霉C23-3代谢产物epi-aszonalenin A对内皮细胞的活性机制

【目的】探究海洋土霉菌代谢产物epi-aszonalenin A(EAA)对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导HUVEC人脐静脉内皮细胞的动脉粥样硬化斑块内血管新生的作用。【方法】用CCK法检测细胞活力,DCFH-DA法测定活性氧(ROS)的含量,划痕实验检测细胞迁移能力,血管生成实验检测细胞成管能力,酶联免疫吸附法ELISA试剂盒检测LOX-1和VEGF蛋白表达情况,蛋白免疫印迹法检测MAPK通路、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)的蛋白的表达情况,分子对接模拟EAA与LOX-1蛋白的相互作用。【结果】CCK法证明EAA对HUVEC细胞无明显毒性作用(P>0.05);与空白组相比,EAA对HUVEC细胞的迁移和血管生成起到显著抑制作用(P<0.001);与对照组相比,随着实验组EAA浓度增加,细胞内ROS含量显著减少(P<0.001),LOX-1、VEGF、MAPK通路蛋白p38、JNK、ERK的磷酸化和ICAM-1、VCAM-1的表达也显著降低(P<0.001);此外EAA能与LOX-1形成稳定的相互作用。【结论】EAA能清除ROS,抑制HUVEC细胞炎性因子的表达和血管生成。     

羟基红花黄色素A对Aβ_(25-35)诱导PC12细胞凋亡的保护作用

为探讨羟基红花黄色素A(HSYA)对β-淀粉样蛋白(Aβ)25-35诱导的神经元样PC12细胞凋亡的影响,并阐明其可能的作用机制,采用Aβ_(25-35)(20μmol/L)诱导PC12细胞凋亡建立AD细胞模型,以不同浓度HSYA(20,40,80μmol/L)对抗干预,使用形态学观察法及Hoechst染色法检测各组PC12细胞凋亡形态,MTT法检测各组细胞存活率,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率,同时应用RT-PCR检测细胞PUMA m RNA的表达变化。结果表明,HSYA可维持PC12细胞及其突触的正常形态,提高细胞存活率,明显抑制细胞凋亡,下调促凋亡蛋白PUMA m RNA的表达,与Aβ_(25-35)组差异均有统计学意义(P0.01)。HSYA可明显对抗Aβ引发的神经元样PC12细胞损伤,其保护作用机制与下调PUMA m RNA的表达量有关。     

哈维氏弧菌PspF基因的克隆及原核表达分析

【目的】对哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)ZJ0603的PspF基因进行克隆与原核表达分析,优化表达条件。【方法】克隆哈维氏弧菌菌株ZJ0603的FspF基因,对其编码蛋白进行理化性质、信号肽、亚细胞定位、二级结构及三级结构分析,构建表达载体pET28a-PspF,经BamHI和XhoI双酶切和测序鉴定正确后转入表达菌株大肠杆菌BL21,对表达重组菌株进行表达条件优化及Western Blot鉴定。【结果与结论】PspF基因的开放阅读框(ORF)全长为1 179 bp,编码336个氨基酸,分子质量为38.04 ku,理论等电点5.27,不稳定系数41.97,总平均亲水性-0.382,PspF蛋白整体表现为亲水性蛋白。成功构建含pET28a-PspF的表达菌株,其最佳诱导条件为37℃下异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)0.2 mmol/L诱导6 h,其表达蛋白为38 ku。Western Blot结果表明PspF重组蛋白成功获得,蛋白同源性高,具有作为抗弧菌病疫苗的潜力。     

线纹海马乙醇提取物对脂多糖诱导BV2小胶质细胞炎症反应的作用

【目的】研究线纹海马乙醇提取物对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导BV2小胶质细胞神经炎症和氧化反应的抑制作用。【方法】利用LPS诱导BV2小胶质细胞建立炎症反应模型,根据对BV2细胞不同的处理方法将其分为对照组、模型组、线纹海马乙醇提取物组(0.1～1 000 ng/mL)和模型组+线纹海马乙醇提取物组(1ng/m L)。用CCK8法检测BV2细胞存活率,显微镜下观察细胞形态的变化,Greiss法测定细胞释放的一氧化NO含量,ELISA法检测BV2细胞上清液中促炎症因子如白细胞介素(interleukin,IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF-α)的表达量。【结果】与对照组相比,线纹海马乙醇提取物对BV2细胞的增殖无显著影响,而LPS刺激显著促进BV2细胞的增殖,细胞呈典型的阿米巴状,同时大量释放氧自由基NO和促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α。线纹海马乙醇提取物显著抑制LPS诱导的BV2细胞增殖,改善LPS诱导的细胞阿米巴状形态,并抑制LPS激活BV2细胞释放的促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和氧自由基NO(P 0.05)。【结论】线纹海马乙醇提取物可明显抑制LPS诱导的BV2细胞的增殖、细胞形态的改变及其所产生的炎症因子和氧自由基的增加。     

草鱼呼肠孤病毒GCRV 096 VP7蛋白的表达及免疫原性

【目的】研究草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)096 vp7基因的原核和真核表达及其编码蛋白的免疫原性。【方法】应用RT-PCR技术获得GCRV 096 vp7基因,构建GCRV 096 vp7基因原核表达载体pET-VP7,用原核表达的GCRV 096 VP7蛋白免疫草鱼(Ctenopharyngodon idellus)15 d后,用GCRV 096和GCRV GD108分离株对其攻毒,检测GCRV 096 VP7的免疫原性。构建GCRV 096 vp7基因真核表达载体p EGFP-N3-VP7,分析其在草鱼CIK细胞中的表达。【结果与结论】GCRV 096 vp7基因的开放阅读框ORF (GenBank登录号为JN206665)为831 bp,编码276个氨基酸。成功构建GCRV 096 vp7基因原核表达载体pET-VP7,并在大肠杆菌BL21中诱导表达成功;最优表达条件是0.2 mm/L IPTG、28℃下表达5 h,通过HisTrap HP柱纯化融合蛋白,Western blot分析结果表明,所表达的蛋白为目的蛋白。经免疫及GCRV攻毒后,GCRV 096(Ⅰ型)免疫组vp7基因的表达水平降低(P 0.05),而GCRV GD108(Ⅱ型)免疫组vp7基因的表达无显著差异,表明GCRV 096 VP7蛋白对GCRV096具有良好的免疫效果,但对GCRVGD108无明显的免疫效果。成功构建GCRV096vp7基因真核表达载体pEGFP-N3-VP7,Western blot分析结果表明,GCRV 096 VP7蛋白在草鱼肾(CIK)细胞中成功表达。     

DHA和EPA对慢性应激诱导大鼠抑郁样行为和杏仁核相关基因表达影响比较

【目的】比较二十二碳六稀酸(DHA)和二十碳五稀酸(EPA)改善慢性不可预测温和应激(CUMS)诱导的大鼠抑郁样行为的作用机制。【方法】应用糖水偏好实验测定糖水偏好度,强迫游泳实验测定不动时间,荧光定量PCR检测杏仁核脑源性神经营养因子(BDNF)、其受体酪氨酸激酶受体(TrKB)和神经营养素(p75NTR)基因表达。【结果】与对照组相比,CUMS组大鼠糖水偏好度、BDNF和TrKB基因表达显著降低(P﹤0.05),而不动时间和p75NTR基因表达显著升高(P﹤0.05);给予DHA和EPA喂食治疗,可显著改善CUMS诱发的大鼠快感缺乏,绝望行为以及BDNF和TrKB的表达(P﹤0.05);DHA提高BDNF的表达作用显著优于EPA,而EPA对降低不动时间和p75NTR的表达作用显著优于DHA(P﹤0.05)。【结论】DHA和EPA通过调控不同基因表达改善CUMS诱导的抑郁样行为变化。     

罗非鱼鱼皮多肽对H_2O_2诱导的HaCaT细胞氧化应激损伤的保护作用

【目的】分析罗非鱼鱼皮多肽(TSP)对H_2O_2诱导HaCaT细胞氧化损伤的保护作用及其作用机制。【方法】将HaCaT细胞随机分成空白组(细胞正常培养)、对照组(800μmol/L的H_2O_2作用24 h)和3个罗非鱼鱼皮多肽浓度组(10、20、50μmol/L TSP),应用MTT比色法检测细胞活力,DCFH-DA法检测细胞内活性氧(ROS)含量,蛋白质印迹法测超氧化物歧化酶(SOD)和谷氨酰转肽酶(GGT)含量。【结果】与空白组相比,对照组的细胞活力明显下降(P﹤0.05),细胞内ROS含量增强,GGT表达量增加,SOD表达量减少;与对照组相比,随着多肽组浓度增加,细胞活力增强,细胞内ROS含量减少,GGT表达量减少,SOD表达量增加。【结论】10~50μmol/L罗非鱼皮多肽TSP能够提高细胞活力,通过清除细胞内的ROS,抑制GGT的表达,增加SOD的表达,达到保护H_2O_2诱导的HaCaT细胞的氧化应激损伤的效果。     

尼罗罗非鱼补体3基因片段的原核表达及条件优化

【目的】补体3(Complement3,C3)在罗非鱼的抗病感染中有重要作用,研究C3基因判断原核表达及表达条件。【方法】根据NCBI中已公布罗非鱼补体C3的基因序列,选取C3基因片段,设计一对带有酶切位点的特异性引物,经连接、转化等后,使用限制性核酸内切酶EcoRI和XhoI对克隆成功的C3基因片段以及原核表达载体pGEX-4T进行双酶切,构建重组质粒pGEX-4T-C3,导入大肠杆菌进行原核表达,并优化表达条件,并对纯化目的蛋白进行Western Blot鉴定。【结果】C3基因片段的重组质粒pGEX-4T-C3构建成功。罗非鱼C3基因片段编码区长度为1 341 bp。获得的目的蛋白分子质量为75 ku,与预期结果相符。最佳诱导时间、浓度以及温度分别为4 h、0.2 mmol/L以及37℃;目的蛋白主要以包涵体的形似存在。重组蛋白可以与GST-Tag单克隆抗体特异性结合,说明成功获得罗非鱼C3片段的重组蛋白。     

17β-雌二醇注射雌性金钱鱼下丘脑转录组分析

【目的】通过转录组测序分析雌激素(17β-Estradiol,E₂)对雌性金钱鱼下丘脑中基因表达的影响。【方法】E₂体注射后进行雌性金钱鱼下丘脑转录组测序,基因功能注释,差异基因筛选、鉴定,GO(Gene Ontology annotation)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信号通路富集分析,并利用实时定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)检测E₂体注射后雌性金钱鱼下丘脑中相关基因的表达。【结果】雌性金钱鱼下丘脑转录组测序共测得Clean reads为190909756,注释到17687个基因,筛选和鉴定了22个差异表达基因,包括prl、erf3α、pgr和cyp19a1b等11个表达上调基因和chsy1、muc17l、prf1和hla-α等11个下调基因。通过KEGG功能富集分析发现差异基因涉及13个代谢通路。转录组和qPCR结果显示,与对照雌鱼相比,E₂注射组雌鱼下丘脑中prl、pgr、cyp19a1b和3β-HSDI的表达显著上调,而生长轴相关基因ghrh、sst1、sst3、sst5和sst6的表达未受影响。【结论】E₂通过反馈作用调节下丘脑中部分性类固醇激素合成通路相关基因的表达,但不影响生长相关基因的表达。