黑潮源区沉积物古菌多样性调查及研究

为了研究西太平洋黑潮源区不同深度沉积物中古菌群落结构的多样性,应用16S rDNA文库技术,对IMAGES XIV航次采集的岩芯MD06-3047进行基因文库的构建和分析,得到260个克隆,经分析处理后得到56个OTUs(Operational Taxonomic Units).基于16S rRNA序列的同源性比较,绘制系统进化树,进行统计学分析.研究结果显示,西太平洋黑潮源区的本哈姆高原(Benham Rise)沉积物中有丰富多样的古菌群落,在1m内的沉积物中分布着9种古菌类群.古菌序列归属于泉古菌(Crenarchaeota)和广古菌(Euryarchaeota),并以泉古菌为主(占总序列的91.5％).其中,泉古菌包含MGI、MBG-B、MCG和UCII-b 4个类群,并且主要由MGI构成(占总序列的40.8％),而广古菌包含MBG-D、SAGMEG、DHVEG、MBG-E和VAL Ⅲ 5个类群,各类群所占总序列比例均较低(占总序列的0.4％～5.4％之间).研究结果对于理解西太平洋黑潮源区沉积物中古菌多样性有重要意义,并为今后研究古菌群落与环境之间的关系提供科学依据.     

甘肃西峰黄土中细菌16S rDNA 文库的构建与组成初步分析

对黄土高原西峰地区黄土沉积物中的有机质进行了总DNA 提取和PCR（聚合酶链式反应）扩增,通过克隆测序技 术构建了含有44 个克隆子的细菌16S rDNA 文库。对16S rDNA 系统发育的分析表明,西峰地区的黄土沉积物中细菌可分属 13 个类群,包括：酸杆菌（Acidobacteria）、变形菌（Proteobacteria）、放线菌（Actinobacteria）、绿弯菌（Chloroflexi）、厚壁菌（Firmicutes）、疣微菌（Verrucomicrobia）、浮霉菌（Planctomycetes）、芽单胞菌（Gemmatimonadetes）、异常球菌-栖热菌（Deinococcus-Thermus）、硝化螺旋菌（Nitrospirae）、蓝细菌（Cyanobacteria）、拟杆菌（Bacteroidetes）和Candidate divisionTG1。其中酸杆菌为最主要优势类群,变形菌为次优势类群,二者占黄土细菌总克隆数的70%,且大多为不可培养的基因型。     

瓜伊马斯深海热液口古菌分布及多样性研究

深海热液口由于剧烈的温度(可达到400℃以上)、pH和化学梯度,成为地球生命起源和演化研究的焦点,海底热液口生命系统为人类提供了一个探索深部生命及生命起源和进化的窗口.本文主要开展了瓜伊马斯深海热液口高温环境下沉积物和烟囱样品中古菌多样性的研究.采用实时荧光定量PCR首先对样品中古菌进行了定量,发现沉积物和烟囱两个样品都含有高丰度的古菌,沉积物和烟囱中古菌分别达到1.47×109拷贝数/g和5.29× 108拷贝数/g(湿重).通过核糖体小亚基16S rRNA基因的PCR扩增,文库构建和系统发育分析,发现沉积物和烟囱样品中的古菌类群多数是嗜热和超嗜热微生物,但两个样品中的古菌群落组成差异很大:沉积物以泉古菌门为主,优势菌群为Miscellaneous Crenarchaeota Group (MCG)和Hot Water Crenarchaeota Group Ⅰ(HWCG Ⅰ);烟囱样品则主要是广古菌门类群,其中以Thermococcales,Marine Benthic Group D (MBGD)/Deep Hydrothermal Vent Euryarchaeota 1(DHVE 1)为主.在沉积物样品中发现了一个新的MCG类群,命名为MCG-H,可能是MCG的高温独特类群.研究揭示,在瓜伊马斯深海热液口烟囱和沉积物中都包含有丰富的古菌类群包括未被发现的新类群,对瓜伊马斯深海热液口古菌分布和多样性的研究将为进一步深入的古菌生理功能和演化的研究提供基础.     

南海西沙海槽沉积物细菌多样性初步研究

对来自南海西沙海槽的深海沉积物进行总DNA提取，并构建细菌16S rDNA文库。细菌16S rDNA系统发育分析表明沉积物中细菌分属4个类群：变形杆菌(Proteobacteria)、浮霉菌(Planctomycene)、低G+C含量革兰氏阳性菌和放线菌(Actinobacteria)，它们分别占总体的49%、22%、22%和7%。Proteobacteria类群又以δ Proteobacteria亚群占优势，其他分属α 和γ Proteobacteria亚群。Planctomycene和低G+C含量革兰氏阳性菌两个常见于浅海的类群，在西沙海槽沉积物的丰度高于其他深海沉积物，可能是随沉积物被浊流搬运至海槽。     

祁连山冻土区天然气水合物DK-2钻孔微生物群落

对青海省祁连山永久冻土区天然气水合物DK-2钻孔的11件样品进行分析,通过微生物群落分析来探寻水合物层样品与非水合物层样品的差别。在11件样品中均发现了细菌16S rDNA,未检测到海洋天然气水合物地区常见的古菌16S rDNA、mcrA(Ⅰ,Ⅱ)、pmoA、mmoX和mxaF。分析得到的细菌16S rDNA分属5个门,包括变形杆菌门、放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和异常球菌-栖热菌门,随着样品深度的增加,细菌多样性有降低的趋势。对非水合物层样品DK2-19和水合物层样品DK2-25进行细菌系统发育树分析,发现这2个样品群落结构相差较大。水合物层样品与非水合物层样品细菌群落对比后发现,水合物层样品中γ-变形杆菌的比例低于非水合物层样品中γ-变形杆菌的比例,而Arthrobacter属多发现于非水合物层的样品中。     

承德地区两温泉中古细菌基因型多样性分析

通过构建16S rDNA克隆文库,对承德地区两个不同温度的温泉中古细菌的基因型多样性进行了分子生态学研究。结果表明:山湾子温泉(A12)74.5℃热水中的古细菌主要分属泉古菌门(Crenarchaeota)和广古菌门(Euryarchaeota)两个门;七家温泉(A14)61.4℃热水中的古细菌则只属于泉古菌门,没有广古菌门微生物的分布。样品A12中的古细菌序列只可分为3种基因型,而A14中的古细菌序列可分为10种基因型。古细菌多样性的差异表明,温度是影响温泉中古细菌多样性水平的重要因素。样品A12中古细菌群落具有厌氧发酵乙酸产甲烷的生理功能,而A14中大多数古细菌均与氨氧化古菌有密切的亲缘关系,其主要生理功能为好氧氨氧化。     

东海内陆架泥质区沉积物古菌群落垂向分布特征

为研究东海内陆架闽浙沿岸泥质区不同深度沉积物中古菌群落垂向分布特征, 利用古菌16S rDNA基因文库得到473个有效克隆、50个OTUs(Operational Taxonomic Units).16S rDNA序列系统进化和统计分析发现古菌分别归属于泉古生菌(Crenarchaeota)和广古生菌(Euryarchaeota), 其中以Miscellaneous Crenarchaeotic Group(MCG)为主, 仅含少量的Marine Benthic Group B(MBG-B)、South African Gold Mine Euryarchaeotic Group(SAGMEG)、Anaerobic Methanotrophs 3(ANME-3)、Marine Crenarchaeotic Group I(MG-I)和Marine Benthic Group D(MBG-D).该泥质区沉积物可能存在由ANME-3催化的甲烷厌氧氧化作用, 同源序列分析表明其古菌群落分布与周边环境有较大联系.UniFrac与沉积物环境因子分析表明该泥质区古菌群落垂向分布与沉积物有机质含量和粒度变化密切相关.      

祁连山水合物分布区不同高寒生态类型冬季表层土壤中古菌群落及变化特征

祁连山冻土区是我国青藏高原重要永久冻土区之一,也是我国陆域天然气水合物分布的重要地区。前期调查表明祁连山木里天然气水合物钻井区一带具 有丰富多样的高寒冻土生态类型。为了解该地区高寒草甸和高寒沼泽草甸表层土壤中古菌群落的多样性及分布特征,对2014年初冬在该区采集的表层土壤样品利用16S rRNA分子生物学技术和 地球化学等方法进行了分析和研究。结果显示,高寒草甸区土壤呈中性,而高寒沼泽草甸区土壤呈弱酸性。钻井区土壤中的TOC和顶空气甲烷含量均显著高于背景区,而在背景区内的两种生态 类型土壤中的TOC和顶空气甲烷含量差别较小。钻井区(除1个点)微生物细胞丰度高于背景区2~5倍。冬季表层土壤中的古菌多样性较低,含泉古菌的3个类群和广古菌的3个类群。不同植被类型 古菌群落的优势种群显著不同,在高寒草甸区为泉古菌门的Group Ⅰ.1b,而高寒沼泽草甸区为广古菌门的甲烷八叠球菌目(Methanosarcinales)。根据研究结果推测,土壤水分可能是导致高 寒草甸区和高寒沼泽草甸区细胞丰度和古菌群落差异的一个主要原因,高寒沼泽草甸区内产甲烷菌占优势可能与土壤高TOC含量有关。高寒沼泽草甸土壤中存在较丰富的产甲烷古菌,它们在厌 氧条件下的甲烷氧化作用也是土壤中甲烷来源之一。     

苏禄海深海沉积物古菌群落结构多样性研究

为了研究热带西太平洋深海沉积物中古菌群落结构的多样性,应用16S rDNA文库技术,对IMAGES ⅪⅤ航次采集的岩芯MD3 059进行基因文库的构建和分析,选取得到543个克隆,处理获得137个OTUs(Operational Taxonomic Units).基于16s rRNA序列的同源性比较,绘制系统进化树,进行统计学分析.研究结果显示,热带西太平洋苏禄海沉积物中有丰富多样的古菌群落,在不足5 m的沉积物中垂直分布着11种古菌类群.古菌序列归属于泉古菌(Crenarchaeota)和广古菌(Euryarchaeota),其中,前者主要由Miscellaneous Crenarchaeotic Group(MCG)构成(占总古菌克隆序列的50%以上),而后者主要由Marine Benthic Group D(MBG-D)、South Africa Gold Mine Euryarchaeotic Group(SAGMEG)和Marine Benthic Group B(MBG-B)等种属构成(占总古菌克隆序列的30%以上).研究结果对于理解热带西太平洋深海沉积物中微生物多样性和未来开发利用微生物资源具有重要意义.     

西太平洋深海沉积物古菌多样性垂直分布

以提取并纯化的西太平洋深海沉积物DNA为模板,利用古菌PCR特异性引物扩增出样品中古菌的16S rDNA片段,构建其克隆文库,建立阳性克隆子RFLP(Restriction Fragment Length Polymor-phism)酶切图谱。据酶切图谱对所获得的120个克隆进行测序,并与数据库中的序列进行比对,从而进行古菌的多样性和系统发育分析。结果表明,沉积物中扩增的16S rDNA古菌序列分别来自泉古生菌(Crenarchaeota)和广古生菌(Euryarchaeota),以Marine Benthic Group B(11.8%)、Marine Benthic Group D(13.6%)、Marine Crenarchaeotic Group(68.69%)为主。少量序列为South African Gold Mine Euryarchaeotic Group(1.07%)、Deep-Sea Hydrothermal Vent Euryarchaeotic Group(1.61%)、UIIB(1.25%)、VALIII(1.79%)、Marine Benthic Group E(0.18%)。以上结果表明西太平洋深海沉积物中有丰富多样的古菌群落。     

岩石中微生物学研究的分子生物学技术——中国大陆科学钻探（CCSD）微生物研究

本文介绍了中国大陆科学钻探（CCSD）微生物学研究中所建立起来的分子生物学技术，即环境基因组DNA提取、16SrDNA分析、Real-timePCR技术和磷脂酸分析技术。另外探索了防污染的手段以及监测方法，并介绍了我们以这种方法对CCSD的微生物学研究所得到的一些初步结果。     

西太平洋暖池核心区Ontong Java 海台古菌多样性研究

为了研究西太平洋暖池核心区表层古菌群落结构及多样性,应用16S rDNA文库技术对KX08-973-22站位(取名为CWP)水体样构建基因文库,得到了561个克隆,经分析处理后得到50个OUT(Operational Taxonimic Units).通过对16S rRNA基因序列的同源性比较,构建系统发育树分析及统计...     

中国大陆科学钻探（CCSD）微生物研究——地下3900米一株细菌的分离与鉴定

在中国大陆科学钻探科钻一井的3911.28米处利用厌氧培养基分离到一株细菌CCSDFL3900,该菌的最适生长温度为65℃,兼性厌氧,革兰氏染色为阴性,端生芽孢,不运动,电镜观察无鞭毛。利用细菌16SrDNA通用引物对其16SrRNA进行PCR扩增,16SrRNA序列及其进化树分析结果显示,该菌为芽孢杆菌或地杆菌。生化试验检测显示,该菌株能够利用多种糖类发酵产酸,最终鉴定为热坚芽孢杆菌。     

海南红树林湿地可培养硫酸盐还原菌的垂直分布特征研究

利用厌氧微生物分离技术,对深度为1.2 m 的海南红树林湿地沉积物钻孔样品进行了分离培养,共获得11 株 厌氧sulfate-reducing bacteria（SRB） 菌株。经显微观察和16S rDNA序列分析,可归纳为6个属,其中已经报道有芽孢杆菌 属（Bacillus）、弧菌属（Vibrio） 和梭状芽胞杆菌属（Clostridium）,另外3个属分别为伯克霍尔德菌属（Burkholderia）、希瓦氏菌属（Shewanella） 和海杆菌属（Marinobacterium）。不同属的细菌对硫酸盐还原的速率最低为14.71%,最高可达 56.78%,并且以上6属11株菌都能将+6价的硫还原生成-2价硫,并与培养基中的Fe2+结合生成黑色FeS沉淀,而这些无定 形FeS沉淀是生成黄铁矿的前体。红树林湿地SRB种群数量随沉积物深度的增加而降低,结合沉积物的地球化学分析测试 结果表明,表层（0 cm） 水界面的沉积物由于处于氧化-还原界面,氧气的周期性输入在一定程度上抑制了SRB的生长;随着 深度增加（10~40 cm）,充足的有机质、偏中性的pH值以及厌氧环境的增强,使得SRB种类和数量明显增加;而60 cm以下 沉积物中因TOC含量降低,减少了微生物可利用的碳源,pH值明显降低,Na+和Ca2+离子浓度明显增加,这些因素都抑制了 SRB的生长,使得深部沉积物中SRB的种类和数量显著减少。     

石油污染地下水中细菌分子生态学研究

采集了某废弃炼油厂的石油污染地下水样品,提取水中微生物总DNA,构建细菌16S rDNA克隆文库,并通过16S rDNA序列的系统发育分析,对样品中的细菌种群多样性以及群落结构进行了研究。结果表明,文库中阳性克隆的16S rDNA序列分属11个细菌类群,分别为Betaproteobacteria(381％),Alphaproteobacteria(353％),Gamaproteobacteria(51％),Deltaroteobacteria(52％),Bacteroidetes(40％),Verrucomicrobia(25％),Epsilonproteobacteria(19％),Nitrospira(13％),Planctomycetes(13％),Candidate Division OD1(13％),Unclassified Bacteria(38％)。在这一生态系统中,Betaproteobacteria和Alphaproteobacteria类细菌占据主导地位,二者所占比例均在三分之一以上。群落中最主要的降解菌是噬氢菌属(Hydrogenophaga)和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)细菌,它们在文库中所占比例达239％和195％。该石油污染地下水样品中细菌与许多其他已知的降解菌亲缘关系较近,如Sulfuricurvum kujiense、Trichlorobacter thiogenes、Rhodoferax ferrireducens以及红细菌属(Rhodobacter)、甲基单胞菌属(Methylomonas)和涅瓦菌属(Nevskia)细菌等。此外,文库中克隆的16S rDNA序列与许多类似的污染场地中发现的环境克隆相似性很高,如煤焦油污染的地下水、苯污染的地下水、原油污染的土壤、溴甲烷和氯甲烷污染的土壤、抗生素生产废水以及活性污泥等,证明该石油污染地下水中有大量降解菌群的存在。石油污染物的种类对降解菌群的组成有一定的选择作用。     

Antibiotic resistance and genetic diversity in water-borne Enterobacteriaceae isolates from recreational and drinking water sources

A total of 240 water-borne bacteria including 72 Escherichia coli, 83 Enterobacter, 30 Klebsiella, 36 Salmonella and 19 Shigella spp. isolates from drinking and recreational water sources were assessed for antibiotic resistance and genetic diversity. Escherichia coli (88.89 %) and species of Enterobacter (86.75 %), Klebsiella (83.33 %) and Salmonella (100 %) were resistant to cefadroxil, while >94 % Shigella spp. were resistant to cefaclor and cefuroxime. Ofloxacin was the most effective antibiotic against isolates of all the genera. Multiple antibiotic resistance index identified dug well, pond and piped water supplies as high risk sources of enteric pathogens. Random amplified polymorphic DNA analysis and restriction fragment length polymorphism of amplified 16S rRNA gene were studied for genetic relatedness of Enterobacteriaceae isolates. Primer P1254 identified 10, 16, 4, 4 and 1 distinct random amplified polymorphic DNA group(s) of E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Salmonella and Shigella species, respectively. Unlike random amplified polymorphic DNA, restriction fragment length polymorphism using AluI and HaeIII could not segregate isolates in different genetic profiles. 16S rRNA gene of three Enterobacter spp. strains from different sources with similar restriction fragment length polymorphism but different random amplified polymorphic DNA patterns was sequenced, and identified as Enterobacter hormaechei strains skg0061, 0062 and 0063. The sequence information has been submitted to GenBank (HQ322393-95). Biochemically similar but genetically diverse Enterobacteriaceae members from drinking and recreational water sources exhibited varying antibiotic sensitivity. Contamination of water sources with such multiple antibiotic-resistant enteric pathogens poses threat to human health.     

淡水湖泊中类蛭弧菌的分离方法

从贵州阿哈湖、百花湖及云南滇池不同深度的湖水中筛选出2株宿主菌株。经16SrRNA基因序列分析,这2株宿主菌分别鉴定为肠杆菌(Enterobacteriales)和黄色单胞菌(Xanthomonadales)。分别利用这2株宿主菌,从湖水样品中获得到了类蛭弧菌噬菌斑。通过吸光度分析、用淡水类蛭弧菌的特异性引物进行基因扩增、DNA序列分析等一系列方法,证实了所分离的菌株为类蛭弧菌。建立了用同一生长环境中的宿主菌来分离类蛭弧菌的方法,并用该方法从淡水湖泊中分离出了不同类群的类蛭弧菌菌株。     

湖泊沉积物中DNA提取与PCR扩增

对湖泊沉积物中保存的生物大分子—DNA进行研究分析,以探讨湖泊生态系统随环境改变而演变的过程。根据前人对土壤和海洋沉积物DNA的提取方法,针对湖泊沉积物的特点进行改进,在此基础上对太湖梅梁湾湖泊沉积岩芯进行DNA提取和扩增。结果表明：不同深度湖泊沉积物均能获得DNA,且纯度较高,OD²⁶⁰/ OD²⁸⁰均大于1.4、OD²⁶⁰/ OD²³⁰大于1.1,可直接用于PCR（polymerase chain reaction ）扩增。对微囊藻的16S rRNA基因进行PCR扩增,结果发现在前5个沉积物样品中,均得到了200 bp左右的微囊藻16S rRNA基因片段,表明微囊藻或已降解的微囊藻基因片段存在于这5个层位的湖泊沉积物中。这为利用湖泊沉积物中的生物分子来推断历史湖泊生物群落结构,判断湖泊生态演变的历史提供了新的研究思路。     

安徽铜陵狮子山硫化物矿山酸矿水中微生物功能群的研究

从安徽铜陵狮子山硫化物矿山酸矿水溪流获得样品,采用YE、Feo、FeSo、FeTo 4种选择性培养基,利用overlay分离技术,获得7株细菌菌株.利用16S rRNA基因序列同源性分析,与目前已分离得到的酸矿水微生物进行了比较.利用分离菌株16S rRNA基因序列构建系统进化树,结果表明获得的菌株可分为3个功能群:嗜酸性异养菌、嗜酸性自养菌、中度嗜酸性铁氧化细菌.嗜酸性异养菌主要与酸矿水中三价铁的异化还原和寡营养状态的维持有关;嗜酸性自养菌与酸矿水中铁、硫元素的氧化有关,是酸水中的生产者;中度嗜酸性铁氧化细菌能将二价铁氧化成三价铁,并产生难溶性的矿物,可实现酸矿水与酸矿水底泥之间铁元素的动态平衡.