栉孔扇贝对氮杂螺环酸毒素代谢解毒的生理应激响应

将栉孔扇贝（Chlamys farreri）暴露于分离自我国近海的一株氮杂螺环酸毒素（azaspiracids，AZAs）产毒藻——腹孔环胺藻（Azadinium poporum，AZDY06株，主产AZA2），研究了栉孔扇贝对AZAs的代谢解毒效应以及代谢过程中血细胞数量、抗氧化酶活性及细胞超微结构变化等生理应急响应。结果发现，栉孔扇贝对AZDY06所产的AZA2具有一定的代谢解毒能力，可将AZA2转化成AZA6、AZA12、AZA19和AZA23等4种极性较强且毒性较低的代谢产物。代谢解毒过程中，栉孔扇贝血细胞数量、关键抗氧化酶活性及靶器官细胞超微结构均出现一定的应激效应，且总体表现出明显的剂量-效应关系。栉孔扇贝血细胞数量对AZAs表现出较强的应激反应，且随实验过程出现较大波动，最高可达对照组的2—3倍；抗氧化系统酶如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化物酶（POD）和酸性磷酸酶（ACP）活性也出现不同程度的变化：GSH-Px与POD在整个蓄积代谢过程中均表现出持续激活状态，且血液中这两种酶活性最高，可达内脏和鳃中的20倍以上；SOD活性与扇贝中AZAs含量有一定关系，AZAs含量为74.2—168.2μg AZA1 eq/kg时为诱导状态，过高或过低剂量均表现为抑制效果；而ACP对AZAs的应激表现也十分敏感，但代谢过程中大部分时间为被持续抑制状态。此外，AZAs还导致栉孔扇贝内脏和鳃细胞超微结构出现空泡化、核固缩等病理性变化；实验后期，低暴露组细胞结构出现一定的自我修复现象，而高暴露组则无此现象。本研究可为进一步深入探索AZAs的解毒机制，对其进行风险评价并制定限量标准提供科学依据。     

栉孔扇贝精巢组织细胞的体外培养及特征分析

本研究建立了一个栉孔扇贝精巢组织细胞的原代培养体系,鉴定了原代细胞的功能基因表达特征。结果显示,原代培养体系中的精巢细胞以圆形细胞为主,直径为4~11μm,其在体外已存活9个月以上。使用栉孔扇贝vasa基因(生殖细胞标记基因)的地高辛RNA探针和原位杂交技术检测,约98%的原代细胞呈阳性。利用免疫组化技术鉴定了栉孔扇贝SCP3、KLF4、PIWI、C-MYC、SOX9和SOX17在这些细胞中的表达特征,发现这些靶蛋白在精巢原代细胞中的表达特征与栉孔扇贝精巢中的细胞定位基本一致。上述结果表明,本实验所获得的原代细胞以生殖细胞为主,它们保留了栉孔扇贝雄性生殖细胞原有的基因表达特征,可以用于贝类精子发生和性别相关的功能基因研究。     

栉孔扇贝foxl2基因在卵子发生中的必要性

采用RNAi技术研究了栉孔扇贝(Chlamysfarreri)foxl2基因在卵子发生和卵巢功能维持中的作用。使用体外合成的栉孔扇贝foxl2双链RNA(dsRNA),以每只50μg/次的剂量注射进闭壳肌中,连续注射2次(第一次注射后7天,再进行第二次注射);以注射相同体积PBS(相同注射方法)的扇贝作为阴性对照组,以不注射扇贝作为空白对照组。qRT-PCR检测干扰组扇贝卵巢中的foxl2 mRNA表达量较空白对照组下降了62%, Western blotting检测该蛋白在卵巢中的含量也明显下降,显示靶基因的表达水平被有效地敲降。组织学观察发现,栉孔扇贝foxl2干扰后的卵巢中卵母细胞形态异常、细胞核固缩,卵子发生明显受阻。表明该基因在栉孔扇贝卵子发生中起重要作用。     

石油烃暴露对栉孔扇贝组织Wnt4基因表达的影响

采用荧光定量PCR的方法测定了不同浓度石油烃暴露下栉孔扇贝各组织Wnt4基因相对表达量的变化,结果表明,栉孔扇贝各组织Wnt4基因表达量在不同浓度石油烃影响下变化程度具有明显差异,对照组表达量大小顺序为精巢卵巢鳃丝消化盲囊;在浓度为0.1mg·L~(-1)石油烃影响下,除鳃丝Wnt4基因表达量有上升趋势之外,其余各组织均无显著变化(P0.05);而在0.3mg·L~(-1)及以上石油烃浓度组,四种组织Wnt4基因表达量随暴露时间均出现明显上升或者被抑制的现象(P0.05),各组织Wnt4基因被激活和被抑制的时间和程度均有不同,受石油烃暴露影响的程度为鳃丝卵巢精巢消化盲囊。本研究认为0.3mg·L-1及以上浓度石油烃暴露对栉孔扇贝各组织特别是鳃丝Wnt4基因表达量的影响较大,对栉孔扇贝的生长发育影响明显;各组织Wnt4基因表达量在不同浓度石油烃的影响下呈现一定的规律性,其变化跟各组织解毒指标的变化具有一定相似性,是较好的反映栉孔扇贝在石油烃暴露下其生长发育变化程度的生物学指标。     

栉孔扇贝胚胎和幼虫中的17β-HSD8表达分析

17β-羟类固醇脱氢酶8(17β-HSD8)广泛分布在脊椎动物体内的多种组织中,调节类固醇激素代谢和脂肪酸代谢。本文采用荧光定量RT-PCR和原位杂交技术,对栉孔扇贝胚胎和幼虫中17β-HSD8mRNA的时空表达进行了分析。研究结果表明,栉孔扇贝17β-HSD8在未受精卵中高水平表达,受精卵和卵裂期胚胎中表达量显著下降,囊胚中的表达量显著提高。提示栉孔扇贝17β-HSD8是一个母源表达的基因,其合子基因在囊胚时期开始表达。原位杂交结果显示,17β-HSD8mRNA阳性信号在各发育阶段的胚胎和担轮幼虫中均匀分布,在D形幼虫中主要定位在内脏团附近,提示17β-HSD8可能参与起始器官发生。     

栉孔扇贝对镉的富集及释放规律的研究

通过暴露染毒方法研究了栉孔扇贝对镉离子(Cd2+)的35d富集与30d释放规律。结果表明:栉孔扇贝对镉有很强的富集性,体内的镉含量与暴露溶液里的Cd2+浓度呈正相关;栉孔扇贝对镉的释放速率随着暴露水体中镉浓度的增加而减慢。应用双箱动力学模型,通过非线性拟合得到了栉孔扇贝对Cd2+的吸收速率常数k1随着外部水体中镉浓度的增大而减小,生物富集系数BCF则随着外部水体中镉浓度的增大而减少。当镉浓度为0.05mg/L时BCF仅为3 730,而当镉浓度为0.000 5mg/L时BCF达到1.79×1011。平衡状态下栉孔扇贝体内镉含量(CAmax)随着水体中镉浓度增加急剧下降,与水体中镉浓度呈负相关;排出速率常数k2、生物学半衰期B1/2与低浓度镉无明显相关性,随着镉浓度的增大k2显著降低而B1/2显著增大。验证了双箱动力学模型适用于栉孔扇贝对Cd2+的生物富集与释放规律研究。     

栉孔扇贝、虾夷扇贝及其杂交子代线粒体COI和Cytb基因遗传多样性分析

为了解栉孔扇贝(Chlamys farreri)、虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)及其杂交子代(F1)的种群遗传多样性和遗传结构,对3个群体的线粒体COI和Cytb基因的部分序列进行了扩增和分析。经比对分别获得781bp和725bp核苷酸片段,74个样本共检测到47个单倍型;F1群体的单倍型数、单倍型多样性指数、核苷酸多样性及平均核苷酸差异数都是最高的,而双亲的较低;F1和栉孔扇贝间的遗传距离最小,其次为栉孔扇贝和虾夷扇贝群体之间,F1和虾夷扇贝群体之间的遗传距离最大;F1和栉孔扇贝之间的遗传分化系数较小而两者间的基因流比较大,F1和栉孔扇贝与虾夷扇贝之间的遗传分化系数较大而基因流较小,说明栉孔扇贝和虾夷扇贝群体群体很早就发生了遗传分化;采用UPGMA法和简化的中介网络法构建的系统树表明,3个群体的所有个体被分为2个族群,栉孔扇贝和F1交叉聚为一类,虾夷扇贝独自聚为一类,2个分支间没有交叉;使用特异性引物分别对3个群体进行PCR扩增检验,结果栉孔扇贝的特异引物能在杂交子代中扩增,而虾夷扇贝的特异引物不能在子代中扩增出条带,说明栉孔扇贝和虾夷扇贝杂交,其子代的线粒体遗传模式为严格的母系遗传。本研究结果表明杂种优势的形成与线粒体遗传多样性的变化有关。     

体重和温度对华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)耗氧率和排氨率的影响

采用室内实验生态学方法对华贵栉孔扇贝的耗氧率和排氨率进行了研究。旨在为华贵栉孔扇贝养殖容量的调查及生态生理的研究提供参考,并可为海洋生态系统动力学和贝类能量学研究提供科学依据。实验结果表明,在实验温度(13—33℃)范围内,华贵栉孔扇贝的耗氧率(OR)和排氨率(NR)与体重(W)都呈负相关,可以用Y=aW-b表示。华贵栉孔扇贝的耗氧率和温度的关系可以表示为OR=-c+b1T-b2T2。在13—28℃温度范围内,华贵栉孔扇贝的耗氧率随温度的升高而增加,28℃时,耗氧率达到最大值,温度升高到33℃时,耗氧率反而下降。而排氨率与温度的关系可以表示为1NR=c1edT,在实验温度范围内,排氨率随温度的升高则呈持续升高趋势。华贵栉孔扇贝呼吸和排泄Q10值范围分别为0.466—2.471和1.129—2.437。在23—28℃温度范围内,不同规格华贵栉孔扇贝的耗氧率和排氨率的比值(原子数O:N)较高。方差分析表明,体重、温度及二者的交互作用对华贵栉孔扇贝的耗氧率和排氨率均有极显著的影响(P0.01)。华贵栉孔扇贝的日常代谢明显高于标准代谢,耗氧率和排氨率平均值分别提高29.9%和69.4%。     

在栉孔扇贝性腺成熟过程中蓄积毒性效应的研究

研究了(CHR)在栉孔扇贝(Chlamys farreri)性腺成熟过程中累积含量的变化和损伤效应。结果表明:CHR对雌雄栉孔扇贝组织中CHR累积含量、MDA(丙二醛)含量、PC(蛋白质羰基)含量和DNA链断裂(F值)影响显著(P0.05),而对照组无明显差异(P0.05)。各处理组雌、雄栉孔扇贝卵巢、精巢和软体部CHR累积含量的变化趋势基本相同,均在10d内呈逐渐升高趋势,并呈现明显的剂量效应,而且雌、雄栉孔扇贝CHR含量表现为卵巢精巢?软体部。各处理组雌性栉孔扇贝卵巢MDA含量在6d内呈峰值变化,于3d时达到最大值,6d后保持稳定,且显著高于对照组水平,而卵巢PC含量、F值在10d内分别呈升高或下降趋势,其中卵巢PC含量表现出明显的剂量效应;低、中浓度处理组雄性栉孔扇贝精巢MDA含量在10d内逐渐升高,而高浓度组在6d内呈峰值变化,在3d时达到最大值,6d后趋于稳定,且明显高于对照组水平,精巢PC含量、F值在10d内与卵巢的变化趋势类似,但未呈现明显的剂量效应。由此可见,栉孔扇贝在CHR胁迫下性腺累积含量较高,导致性腺脂质、蛋白质和DNA受到严重损伤,产生明显的生殖毒性效应,其中卵巢PC含量可作为栉孔扇贝性腺损伤的潜在指标之一。     

c-Myc基因在栉孔扇贝年周期发育性腺中的表达特征

c-MYC在高等脊椎动物的细胞增殖、细胞分化和癌症发生中具有重要的调控作用。本研究克隆了栉孔扇贝cMyc基因的全长cDNA序列,分析了其在性腺年周期发育和配子发生过程中的表达特征。栉孔扇贝c-Myc cDNA全长2 943bp,可编码397个氨基酸,推导的氨基酸序列中除了包含MYC家族的保守结构域外,还具有c-MYC蛋白所特有的Myc-N转录激活区。qRT-PCR结果显示,栉孔扇贝卵巢中的c-Myc mRNA水平随着卵巢的发育和成熟显著升高;精巢中的表达水平在成熟期之前(休止期至生长期)逐渐升高,但在成熟期精巢中的表达水平显著低于增殖期和生长期。原位杂交和免疫组织化学结果显示,c-Myc mRNA及c-MYC蛋白的阳性信号均可在栉孔扇贝精巢的精原细胞和精母细胞以及卵巢的所有生殖细胞中检测到,推测其可能与栉孔扇贝的性腺发育和配子发生过程有关。     

氟苯尼考浸泡栉孔扇贝后各组织中含量的测定

以栉孔扇贝(Chlamys farreri)为对象,研究了其不同组织对氟苯尼考的蓄积与消除规律。氟苯尼考对栉孔扇贝的96h半致死浓度LC50为213.1mg·L~(-1),安全浓度为21.3mg·L~(-1)。将栉孔扇贝分别暴露于氟苯尼考含量在安全浓度以上(40mg·L~(-1),A组)、安全浓度水平(20mg·L~(-1),B组)和安全浓度以下(10mg·L~(-1),C组)进行8天的蓄积实验,从第9天开始将栉孔扇贝转移至洁净的海水中进行5天的消除实验。研究表明:蓄积阶段,栉孔扇贝各组织中氟苯尼考含量随海水中氟苯尼考浓度的升高而增加;而同一时间的生物蓄积系数(BCF)则随海水中氟苯尼考浓度的升高而逐渐降低,表明在低剂量浓度条件下,栉孔扇贝更容易对氟苯尼考产生富集作用。各组织中氟苯尼考浓度大小顺序为:内脏团外套膜闭壳肌,其中,内脏团与外套膜中氟苯尼考含量大约是闭壳肌的2~7倍,表明氟苯尼考主要富集在栉孔扇贝的内脏团及外套膜中,闭壳肌中含量较少。消除阶段,氟苯尼考的日均消除速率大小顺序为内脏团外套膜闭壳肌,且A组B组C组,说明作为主要食用部位的闭壳肌对氟苯尼考的消除速率相对较慢。在较高浓度氟苯尼考下,闭壳肌需要经过一段时间的净化才能使氟苯尼考含量降至低于0.1mg·kg-1以下。研究结果为在栉孔扇贝养殖中合理施用氟苯尼考提供参考。     

栉孔扇贝NDPK 基因的BAC-FISH 定位研究

栉孔扇贝(Chlamys farreri)是我国北部沿海一个非常重要的养殖种类。核苷二磷酸激酶(NDPK)是一类广泛存在、高度保守,在细胞能量和信息传递中具有重要作用的酶。作者利用BAC-FISH技术将两个包含栉孔扇贝NDPK基因的BAC克隆定位到染色体同一位置上,该结果验证了物理图谱相关contig组装的可靠性,同时NDPK基因的染色体定位将对深入研究该基因的结构、功能以及应用于生产实践提供理论支撑。本研究结果将对栉孔扇贝染色体的深入研究以及染色体鉴别、图谱整合等工作提供重要参考。     

石油烃在栉孔扇贝(Chlamys farreri)体内富集排除规律与氧化损伤效应的研究

为研究栉孔扇贝消化盲囊和鳃丝对石油烃的富集排除规律及氧化损伤效应,在实验室条件下将栉孔扇贝在各浓度石油烃的海水中分别进行染毒和排除实验各15d,测定消化盲囊和鳃丝的石油烃蓄积量、石油烃蓄积排除速度、生物浓缩系数、溶菌酶活性和脂质过氧化水平等指标。结果表明,栉孔扇贝两组织在蓄积期间石油烃含量随时间呈现增加趋势,在9d之后达到蓄积量的平衡,浓度越高,生物浓缩系数BCF越小;0.1mg·L~(-1)和0.3mg·L~(-1)石油烃处理组两组织蓄积和排除速度随石油烃浓度升高而降低,在排除期间最后阶段都能将石油烃完全排除,蓄积期间溶菌酶活力和脂质过氧化(LPO)水平随时间不断上升,排除期间均能恢复到正常水平,而1.0mg·L~(-1)和3.0mg·L~(-1)处理组两组织蓄积期间的溶菌酶活力则呈现明显被抑制的现象,LPO水平明显升高,且在排除期间均不能恢复到对照组水平。结果证实,栉孔扇贝对0.3mg·L~(-1)及以下低浓度石油烃具有较好的应对机制和耐受性,而在1.0mg·L~(-1)浓度以上石油烃处理组其调控能力受到了明显的影响,机体处于较强的氧化损伤状态。本实验各指标均能体现不同浓度石油烃对栉孔扇贝组织的影响规律,且相互之间存在着非常相似的变化和紧密联系,能准确反映机体的解毒调控机制和机体氧化损伤效应规律。     

栉孔扇贝BI-1基因的克隆与表达分析

本研究采用RT-PCR和RACE技术首次获得了栉孔扇贝(Chlamys farreri)BI-1基因(Cf BI-1)c DNA全长序列,长度957bp,5′和3′非编码区长度分别为48bp和195bp,开放阅读框为714bp,预测编码一个含有237个氨基酸的蛋白质,分子量为27k Da;结构预测显示,Cf BI-1蛋白包含6个跨膜结构域。同源和分子进化聚类分析显示,Cf BI-1蛋白序列与其他一些物种中的BI-1蛋白序列相似性很高,表明BI-1具有很高的保守性。通过荧光定量PCR的方法检测了Cf BI-1 m RNA在栉孔扇贝正常组织中和在干露、脂多糖以及扇贝急性病毒性坏死症病毒刺激之后的表达水平的变化。结果表明,Cf BI-1在栉孔扇贝各组织中广泛分布,其中闭壳肌中的表达量最高,血淋巴中的表达量最低。在干露和病毒刺激以后,Cf BI-1基因表达水平较对照组都有显著上调(P0.05),表明Cf BI-1基因可能参与了干露刺激和急性病毒性坏死症病毒感染后的细胞应激响应及其诱导的细胞凋亡过程。综合上述分析,我们认为Cf BI-1基因在栉孔扇贝细胞凋亡调控过程中可能起到重要作用,可为栉孔扇贝凋亡相关基础研究提供参考。     

栉孔扇贝对无机砷的富集与排出特征研究

以栉孔扇贝(Chlamys,farreri)为试验生物,应用生物富集双箱动力学模型,研究了暴露在不同质量浓度的As<'3+>溶液中,栉孔扇贝对无机砷的耐受性;通过对富集与排出过程中栉孔扇贝体内无机砷含量的动态监测及对检测结果的非线性拟合,得出栉孔扇贝富集无机砷的吸收速率常数(k<,1>)、排出速率常数(k<,2>)、生...     

栉孔扇贝骨形态发生蛋白Ⅰ型受体基因的克隆及表达分析

首次在栉孔扇贝(Chlamys farreri)中克隆了骨形态发生蛋白I型受体(Bone morphogenetic protein type Ⅰ receptor,cfBMPR1)基因cDNA全长序列,该基因开放阅读框长1560bp,编码为519个氨基酸。实时荧光定量反转录PCR(real-time qRT-PCR)分析结果显示,cfBMPR1基因在栉孔扇贝受精卵、4细胞期、囊胚、原肠胚、担轮幼虫期、D型幼虫期和壳顶幼虫期等发育时期均有表达,其中胚胎时期表达量高于幼虫期,提示该基因在扇贝早期发育及幼虫形态形成过程中的重要作用;在成体组织,包括外套膜、鳃、性腺、肾、横纹肌和消化腺中也均检测到了cfBMPR1的表达,其中以性腺和横纹肌中表达量最高,暗示其参与了扇贝包括繁殖和肌肉生长发育等在内的多种生物学过程。研究结果为进一步研究TGF-β信号通路在扇贝生长发育中的功能提供了基础数据。     

福建漳州海域麻痹性贝毒的污染状况调查

本文通过对漳州海域的养殖区栉孔扇贝扣僧帽牡蛎为期1a的麻痹性毒素（PSP）污染状况的调查分析，以了解贝类海产品的安全性．贝毒测定按照AOAC小白鼠法进行，利用高效液相色谱（HPLC）进行贝毒成分分析．结果表明：漳州海域的栉孔扇贝为该海域轻微PSP染毒贝类，含量为1．83～3．23MU／g；漳浦古雷和东山铜陵的栉孔扇贝样品检出率分别为66．7％和16．7％．高效液相色谱分析表明，样品中PSP成分为B1、GTX1／4、GTX2／3及STX和C毒素．漳州海域贝类PSP含量很低，未超出安全食用标准；但毒素分布存在季节差异，春季检出率较高．因此有针对性的加强贝毒监测非常必要．     

栉孔扇贝Smad基因家族的表达特征和对鳗弧菌侵染的免疫应答分析

栉孔扇贝是我国海水养殖业的重要品种之一,但养殖扇贝陆续暴发大规模细菌性疾病,造成了巨大的经济损失。深入研究扇贝的免疫防御机制,是改良种质、培育抗病品系的必要措施。近年来研究发现,Smad基因可以通过调控增强子结合蛋白(CEBP/ε)来促进中性粒细胞的成熟和功能极化,在引发脊椎动物的先天免疫调节中发挥着重要的作用。然而目前对于Smad及其在免疫中的作用的研究大都集中于脊椎动物中,在海洋贝类中的研究还较为匮乏。因此,对栉孔扇贝的Smad基因家族进行了系统发生、共表达网络的构建、以及鳗弧菌侵染的免疫应答分析,以解析贝类Smad基因家族的表达调控机制和在免疫应答中的作用。结果表明,Smad3和Smad6可能在两侧对称动物的共同祖先中位于同一染色体上;栉孔扇贝Smad5与Toll样受体信号通路的关键基因协同表达;受鳗弧菌侵染后,血淋巴中的Smad5显著上调,说明Smad5基因可能通过与Toll样受体信号通路相互作用,参与了机体的免疫应答。研究结果可为深入研究贝类Smad基因在天然免疫系统中的作用提供重要参考。     

硒化壳聚糖对栉孔扇贝血细胞中部分免疫因子的影响

取人工养殖栉孔扇贝(Chlamys farreri)的血淋巴,体外加入不同浓度的硒化壳聚糖,作用1h后采用生化方法分别测定栉孔扇贝血细胞中的髓性过氧化物酶(MPO)和非特异性酯酶(NSE)的活力,以及过氧化氢(H2O2)和活性氧的含量。结果表明:加入硒化壳聚糖后,栉孔扇贝血细胞中依赖卤素的MPO、不依赖卤素的MPO、α-醋酸萘酯酶和α-丁酸萘酯酶的活力均为实验组显著高于对照组,过氧化氢和活性氧的含量也为实验组显著高于对照组。说明硒化壳聚糖对栉孔扇贝血淋巴中多种参与免疫防御的酶的活力和具有杀菌作用的免疫因子的含量均具有明显的提高作用,因而硒化壳聚糖对栉孔扇贝的免疫功能具有明显的增强作用。     

栉孔扇贝高多态基因筛查及其表达特征分析

双壳贝类经历了几亿年的进化过程,在复杂多变的海洋环境中展现出了非凡的环境适应能力,而基因组的高多态性被认为与其环境适应性有关。本研究利用栉孔扇贝基因组重测序数据、早期发育及成体转录组数据分析了基因的多态性与表达特征。在栉孔扇贝基因组中共鉴定到了1 186个高多态基因,这些基因在染色体上呈现非均匀分布,并且在胚胎发育时期和成体组织中呈现出独特的表达特征。功能富集分析显示这些多态基因可能为扇贝胚胎发育的可塑性和成体的环境适应性提供了分子基础。研究还发现2个多拷贝基因——mucin和C1qDC具有显著的高多态性,可能在免疫系统防御和清除病原的过程中发挥了重要作用。本研究对高多态基因的表达特征和多态性进行了联合分析,为解析扇贝适应性进化的分子机制提供了线索。