养殖牙鲆鳗弧菌疫苗的研究

以牙鲆病原性鳗弧菌M3为抗原,制备了细胞（CV）、细胞－胞外产物（CEV）、脂多糖（LPS）三种疫苗,通过浸泡和注射两种途径对牙鲆进行两次免疫,检测疫苗的免疫保护效果。免疫后4周可检测到免疫组牙鲆具有明显的凝集抗体效价,其中注射组效价显著高于浸泡组,而对照组变化不明显。与对照组相比,免疫组牙鲆获得良好的免疫保护力,其中注射免疫组高于浸泡组。在注射免疫途径中,以CEV的免疫保护效果最好;在浸泡免疫途径中,以CEV和LPS的免疫保护效果最好。结果表明鳗弧菌M3的细胞－胞外产物苗有显著的免疫保护作用。     

副溶血弧菌胶体金快速检测试纸的研制及应用

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是海水养殖动物弧菌病的主要病原菌之一。为实现对该菌的现场快速检测,本文以制备的兔抗副溶血弧菌多克隆抗体作为金标抗体,提取副溶血弧菌的外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外产物和全菌蛋白,以不同浓度的4种抗原蛋白作为4条检测线(T1~T4),特别在T4线设置全菌蛋白,基于竞争免疫层析原理研制出副溶血弧菌胶体金快速检测试纸。使用该试纸检测了副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、鳗弧菌(V.anguillarum)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、哈维氏弧菌(V.harveyi)和鱼肠道弧菌(V.ichthyoenteri),检测结果表明其能够准确鉴别副溶血弧菌感染,排除其他菌的交叉反应干扰。副溶血弧菌快速检测试纸的最低检测限为5×105 cfu·mL^-1,感染副溶血弧菌的牙鲆组织的检测结果与ELISA结果一致。本文研制的试纸具有较高的特异性与准确性且操作简单,为现场快速检测副溶血弧菌提供了有力工具。     

鲈鱼鳗弧菌病疫苗的制备及免疫防治效果

以从患出血、烂尾病的鲈鱼 ( L ateolabrax japonicus)中分离的 1株致病性鳗弧菌 W- 1( Vibrio anguillarum)为材料 ,进行了鳗弧菌全细胞灭活疫苗研制 ,比较了福尔马林、苯酚、氯仿等不同灭活剂在不同温度下的灭活效果。最终确定以 0 .5 % ( v/ v)的福尔马林溶液在 2 8℃下处理 4 8h为最佳灭活条件 ,所用的菌悬液浓度为 2 .5× 10 9cfu/ m L。用福尔马林灭活的 W- 1( Vibrio anguil-larum)疫苗 ,分别浸泡免疫鲈鱼苗和注射成鱼 ,并检测了疫苗对鱼体的免疫保护力。结果表明 ,经疫苗浸泡免疫 4周后的鲈鱼苗免疫保护力达 64.7% ,90 d后同批次的鲈鱼再注射免疫 ,其免疫保护力为 78.9% ,血清中抗体凝集效价为 1∶ 192。仅进行注射免疫组 ,其免疫保护力为 5 7.9% ,血清中抗体凝集效价为 1∶ 2 2 4。     

大黄鱼病原副溶血弧菌单克隆抗体制备及其应用

用甲醛灭活副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和溶藻弧菌(V.alginolyticus)制成免疫原免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,获得1株特异的针对副溶血弧菌的单克隆抗体,命名为D6F3H5。腹水及培养上清液抗体的ELISA效价分别为:1∶5 120和1∶1 280,该单克隆抗体与其它细菌没有明显的交叉反应。利用该单克隆抗体和兔抗副溶血弧菌多克隆抗体,建立了检测副溶血弧菌的双抗体夹心ELISA方法。该方法对副溶血弧菌的最小检出量为5×104个/mL。用双抗体夹心ELISA检测大黄鱼(Pseudosciaena crocea)样品,14尾患病大黄鱼中有11尾检出副溶血弧菌,而10尾健康大黄鱼都没有检出副溶血弧菌。由此可见,本试验制备的高特异性的抗副溶血弧菌单克隆抗体,可以用于患病大黄鱼副溶血弧菌的快速诊断。     

大黄鱼溶藻弧菌LPS的间接ELISA检测

用酚 水法从20dm3溶藻弧菌培养液中分离得到脂多糖(LPS)97.6mg,以0.5mg cm3的LPS溶液通过耳缘静脉注射免疫实验兔,经过3次加强注射后从颈动脉放血制备抗血清.该抗血清的效价为1∶2560,对副溶血弧菌等10株细菌的交叉反应效价都较低.用免疫吸附过滤法去除血清中的非特异性成分.用吸附后的抗血清进行溶藻弧菌间接ELISA检测,其检测限为97×104个 cm3.以ELISA进行大黄鱼体内溶藻弧菌检测.结果表明:用LPS抗血清可以较为灵敏地检测大黄鱼体内的溶藻弧菌,该方法不仅可以用于诊断大黄鱼的溶藻弧菌病,也可以检测无病症带菌大黄鱼.     

应用荧光抗体技术检测牙鲆体内的河流弧菌

用灭活的河流弧菌(Vibrio fluvialis)抗原,注射免疫实验兔,制得凝集价为1∶5 120的抗血清。用试管凝集法检测了抗血清的特异性,再用免疫吸附法去除交叉反应,从而得到高效价、高特异性的抗河流弧菌血清。用所制备的抗血清在实验室中建立起河流弧菌荧光抗体检测技术(FAT),在荧光显微镜下可清楚地看到被标记的病原菌,整个检测过程只需3h。用河流弧菌感染牙鲆(Paralichthys olivaceus),24 h后,用FAT测定牙鲆的血液、肾脏和肝脏中的河流弧菌,在血液中河流弧菌的检出率最高,其次是肾脏,肝脏的检出率最低。以上结果表明:荧光抗体技术可以快速、灵敏、准确地检测出牙鲆体内的河流弧菌。     

三种致病弧菌感染对大黄鱼非特异性免疫功能的影响

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolytic-us)是引起大黄鱼(Pseudosciaena crocea)溃疡病的3种主要致病菌.将试验大黄鱼随机分成4组,分别腹腔注射哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和灭菌生理盐水,在感染后的不同时间采样,通过白细胞数量、白细胞分类计数、NBT阳性细胞数量以及溶菌酶活力的变化趋势来探讨3种致病弧菌感染对大黄鱼非特异性免疫功能的影响.结果表明,大黄鱼各项血液指标的变化主要发生在感染后的1～7 d.在人工感染的初期,各实验组大黄鱼外周血的白细胞数量、NBT阳性细胞数量呈现先增加后降低的趋势,淋巴细胞、嗜中性粒细胞百分比显著降低(p<0.05),单核细胞百分比显著提高(p<0.05);随着时间的延长,白细胞数量开始下降;淋巴细胞、嗜中性粒细胞百分比有所上升,7 d以后各类血细胞数量变化不显著.其中哈氏弧菌感染组在白细胞数量、NBT阳性细胞数量等多个指标上的变化最为明显.血清中溶菌酶活性显著高于脾组织,鱼体受感染后两者溶菌酶活性均较对照组有显著提高,不同致病菌与大黄鱼非特异性免疫功能之间呈现一定的时效差异.研究认为反映鱼体受感染后从应激反应发生至非特异性免疫功能的发挥主要发生在病原菌感染前期,不同致病菌与大黄鱼非特异性免疫功能之间呈现一定的时效差异.     

4 种病原弧菌外膜蛋白的提取及抗原性初步分析

利用十二烷基磺酸钠抽提并结合超速离心的方法提取了鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、河口弧菌(V.aestuarianus)、霍乱弧菌(V.cholerae)和副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)4种致病性弧菌的主要外膜蛋白,通过SDS-PAGE分析比较4种弧菌主要外膜蛋白的组分。结果表明:4株弧菌的外膜蛋白电泳图谱一般可得到5～10条蛋白带,分子量多数集中在26~40 kD和48~85 kD。对所提取的4种弧菌主要外膜蛋白进行SDS-PAGE后,分别与自制的兔抗鳗弧菌血清、抗河口弧菌血清、抗副溶血弧菌血清进行Western-blotting印迹分析。结果显示每种全菌抗血清可与相应菌的外膜蛋白部分组分发生免疫反应,并与其他3种弧菌外膜蛋白的部分组分产生交叉免疫反应,这些反应条带分子量主要集中于30~48 kD之间。本研究为进一步研究致病性弧菌外膜蛋白免疫学特性提供参考。     

养殖大黄鱼副溶血弧菌的酶联免疫吸附法研究

本文建立了网箱养殖大黄鱼病原菌--副溶血弧菌酶联免疫吸附法,也即间接ELISA快速检测方法.用0.5×10-3(V/V)甲醛、30℃作用8h灭活病原菌制成菌苗.用该菌苗免疫新西兰兔获得特异性抗血清,以辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG为标记第二抗体,对副溶血弧菌进行间接ELISA快速检测,其最低检测极限为5×104CFU/cm3.现埸检测养殖水体中没有副溶血弧菌检出,患病大黄鱼肝脏副溶血弧菌的检出率为70%,外观健康大黄鱼肝脏副溶血弧菌的检出率为20%.现埸检测结果表明间接ELISA检测法不仅可以用于患病大黄鱼病原菌的快速检测,而且能够检测出无病症带菌大黄鱼.     

微生态制剂对牙鲆非特异性免疫因子影响的研究

以牙鲆为试验材料,在基础饲料中分别添加5种不同配伍的微生态制剂,以基础饲料为对照,饲喂60 d。定期测定牙鲆血细胞吞噬活性及血清中的抗菌活力、溶菌活力、超氧化物歧化酶活力。结果表明,添加0.4%N3 E5微生态制剂对吞噬活性促进作用最为显著;添加N3微生态制剂对血清中抗菌活力和溶菌活力的促进作用尤为显著;第40天,添加了N3、E5、N3 E5和枯草芽孢杆菌组,溶菌活力分别比对照组提高了195.2%,222.7%,153.0%,113.6%;此外,几种微生态制剂对超氧化物歧化酶也有一定的促进作用。60 d后,用鳗弧菌进行攻毒试验,试验组的免疫保护率分别达到43.4%,71.6%,40%,62.2%,20%,表明所用微生态制剂可以促进牙鲆的非特异性免疫功能。     

牙鲆、石鲽和川鲽的线粒体16S rRNA基因片段的序列比较研究

以相应引物对牙鲆(Paralichthysolivaceus)和石鲽(K.areiusbicoloratus)的线粒体16SrRNA基因片段进行了PCR扩增,PCR产物经T载体连接之后进行了克隆、测序,均得到了590bp的碱基序列,并将其与GenBank中牙鲆线粒体全序列相应片段和川鲽(Platichthysflesus)相应片段进行比较,结果表明,川鲽和石鲽序列差异很小(核苷酸差异数为7,同源性为98.8%);而牙鲆与川鲽和石鲽的序列差异明显(核苷酸差异数为90～93,同源性约为84%),且大多数核苷酸变异位点集中在序列中部大约200bp的区域.     

应用单克隆抗体检测牙鲆血清中抗淋巴囊肿病毒的特异性抗体

应用杂交瘤单克隆抗体技术制备10株分泌抗牙鲆免疫球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。利用单抗2H4,通过间接酶联免疫法(ELISA)对牙鲆血清中抗淋巴囊肿病毒(LCDV)特异性抗体进行了检测。结果表明:无外观症状的牙鲆血清中特异性抗体水平很低(平均OD值为0.092),个别鱼体偏高,证明已感染LCDV,处于潜伏期;患淋巴囊肿病且症状显现的牙鲆血清中特异性抗体水平升高(平均OD值为0.165),患淋巴囊肿病后处于恢复期的牙鲆抗体水平最高(平均OD值为0.231);健康牙鲆接种LCDV灭活疫苗后,特异性抗体水平显著升高。     

牙鲆的疾病

综述当前国内外报道的养殖牙鲆危害严重的主要疾病及其防治方法。按牙鲆的病毒病、细菌病、寄生原虫病、吸虫病等顺序分别叙述了各主要病害，尤其对危害严重的病害种类如：牙鲆弹状病毒病、肠道白浊病、鳗弧菌病、腹胀病、腹水病、牙鲆出血性败血病等进行了较为详细的记述，以期对牙鲆疾病的研究提供参考材料     

工厂化养殖杂色鲍致病菌副溶血弧菌的分离鉴定及其生理特性

从广东汕尾地区工厂化养殖的患病和死亡的杂色鲍(Haliotis diversicolor)及养殖海水中分离到3株优势菌,经回归感染试验,证实所分离的细菌为杂色鲍的致病菌。经形态、生理、生化等多项指标鉴定,该菌株为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus),并经ATB微生物自动鉴定系统证实鉴定结果。在中国大陆,由副溶血弧菌使杂色鲍致病并大量死亡的事件,本文属首次报道。     

南极超微细菌ANT52(Alteromonas stellipolaris)外膜蛋白和脂多糖的提取物对黑鲷的免疫活性研究

从南极超微细菌ANT52(Alteromonas stellipolaris)提取粗外膜蛋白(Outer membrane protein,OMP)和粗脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),分不同处理(OMP、LPS、OMP+LPS)免疫注射黑鲷,在免疫后的第1、7、14、21、28、35天时检测试验鱼的白细胞吞噬活性、溶菌酶活力、抗菌活力以及酚氧化酶活力等非特异性免疫指标的变化.结果表明,自南极超微细菌ANT52提取的LPS及OMP 均能够显著提高黑鲷的白细胞吞噬活性(P<0.05),增强黑鲷血清中的抗菌活力、溶菌酶的活力和酚氧化酶活力(P<0.05).各免疫处理对黑鲷免疫活性的影响效果不同,LPS、OMP单独注射的免疫促进效果优于组合注射(LPS+OMP);且LPS、OMP单独注射的黑鲷各免疫指标基本上在接种后的第28天时最高,而组合注射LPS+OMP在接种后的第21天最高.上述物质表现的免疫作用机理有待于进一步研究.     

气质联用技术分析鉴定海洋琼胶液化弧菌脂多糖的脂肪酸

利用气质联用技术 (GC- MS)对海洋琼胶液化弧菌脂多糖的脂肪酸组成和结构进行了分析鉴定。结果表明 ,该脂多糖的脂质 A部分含有 7种脂肪酸。其中饱和脂肪酸 3种 :正十二碳烷酸 ,正十四碳烷酸和正十六碳烷酸 ;不饱和脂肪酸 4种 ,分别为 9-十六碳烯酸 ,9-十七碳烯酸 ,11-十八碳烯酸和 9,12 -十八碳二烯酸     

养殖牙鲆鱼苗腹水症病原菌的鉴定及系统发育学分析

从患腹水症养殖牙鲆鱼苗分离到一株细菌B17，人工感染实验证实春具有致病性。用Biolog-GN细菌鉴定系统对B17进行测试，发现其与参考菌株的相似性较低，不能进行鉴定。常规生化测试表明，B17具有弧菌属的特征，其表型特征与Vibrio splendidus非常相似。为了进一步明确菌株B17的分类学地位，测定了其16SrRNA基因序列，分析了相关细菌相应序列的同源性，构建了系统发生树，结果表明菌株B17与V. splendidus的亲缘关系最近。综合上述结果，菌株B17可鉴定为V.splendidus。     

养殖石斑鱼溃疡病病原哈维氏弧菌胞外产物的研究

以网箱养殖的患溃疡病青石斑鱼(Epinephlus awoara)和斜带石斑鱼(Epinephlus co-ioides)分离的哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)TS-628菌株为研究对象,采用平板玻璃纸覆盖技术,获得该菌株的胞外产物(ECP),并对其成分进行分析。利用杯碟法研究表明,哈维氏弧菌TS-628菌株的胞外产物具有酪蛋白酶、明胶蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、卵磷脂酶等多种酶活性和溶血活性,且溶血性物质具有热不稳定性。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及考马斯亮蓝R-250染色分析表明,ECP蛋白条带主要集中在分子质量范围25.0~66.2 ku之间,经不同时间培养所获得的ECP在凝胶上显示出的蛋白条带几乎一致。采用复性电泳方法(G-PAGE)分析了哈维氏弧菌及其它4种弧菌属细菌的ECP蛋白酶活性,结果发现哈维氏弧菌ECP在酸性条件下,蛋白酶活性较强,在碱性条件下,蛋白酶带明显减少,活性很弱。在相同的pH条件下,5种弧菌中以副溶血弧菌的ECP蛋白酶活性最强,种类多,分子质量范围宽;而哈维氏弧菌的蛋白酶带较少,活性也稍弱。     

基于有限元方法对鲆鲽网箱耐流特性的数值模拟

鲆鲽网箱结构在海中受到水流的冲击作用会发生运动与变形,针对鲆鲽鱼特有的栖底习性,为确保网底结构的稳定有必要对其进行动力分析。为此利用有限元方法建立了流场中网箱受力和变形的数学计算模型,运用该数学模型对底框中加有支撑管结构并装配方形网目网衣的鲆鲽网箱整体位移进行了数值模拟。数值模拟结果表明,网箱的网衣部分在水流作用下形态变化比较大,网底的水平位移与垂直位移随流速的增加而增大,而网箱的底框架在不同流速条件下均能保持在水平位置,且未发生明显的倾斜。由此可见,此类鲆鲽网箱具有较好的耐流性能。