凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)感染白斑症病毒(WSSV)后大颗粒血细胞的变化

采用抗凡纳滨对虾大颗粒细胞的单克隆抗体，应用免疫细胞化学方法，分析了凡纳滨对虾人工感染白斑症病毒(WSSV)后血细胞中大颗粒细胞的变化。研究表明，凡纳滨对虾感染WSSV后，大颗粒细胞的细胞质较正常细胞的多；从WSSV感染凡纳滨对虾的第1天至第3天，大颗粒细胞的数量增加幅度较大。同时，大颗粒细胞占血细胞总数的比例也增加较大：第1天为15．2％，第2天为18％，第3天增大到45．9％，而后大颗粒细胞的比例稍有下降，到第8天下降到43．3％，但仍明显高于对照组(健康虾的大颗粒细胞比例为15．2％)。     

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)血细胞中一氧化氮合成酶的鉴定及其在白斑综合症病毒感染过程中的变化

诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)在生物机体免疫，特别在无脊椎动物免疫中的作用近来得到了广泛的关注，由其催化产生的一氧化氯(NO)除具有已知的神经传导、松弛平滑肌等功能外，还具有抗菌、抗病毒、抗寄生虫等作用。作者通过硝基四氯唑蓝(NBT)法和血细胞形态观察等方法，对中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)血细胞中存在的诱导型一氧化氮合成酶进行了初步鉴定。在此基础上，通过亚硝酸盐法和L-瓜氨酸法对比，研究了感染白斑综合症病毒(WSSV)后中国明对虾血细胞中一氧化氯合成酶的变化情况。结果显示，中国明对虾在感染WSSV后，iNOS活性在12h内有上升趋势，实验36h后酶活性显著下降，至60h后酶活性降至对照组的一半左右。同时，被脂多糖(LPS)诱导的一氧化氮合成酶活性与对照相比也有显著下降。与此对应的是，核酸探针斑点杂交法检测病毒的结果显示：实验36h后在对虾体内能够检测到白斑综合症病毒。对照组中国明对虾血细胞的iNOS在实验过程中基本保持稳定。这说明WSSV在感染中国明对虾初期可以诱导血细胞产生iNOS，但随着WSSV在中国明对虾体内的大量增殖及其对血细胞的破坏，使得iNOS活性显著降低，对虾也趋于死亡。因此，iNOS能够作为反映对虾在病毒感染过程中健康状况的有效指标。     

白斑综合症病毒膜蛋白VP124参与病毒的感染

白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是对虾的最主要病毒病原之一,给对虾养殖造成了巨大的经济损失。WSSV分别与三种该病毒膜蛋白VP39,VP124和VP187的特异性抗血清在体外作用后,再注射到螯虾体内,进行中和试验。结果显示,注射同或未同VP124抗血清作用的WSSV,8 d后螯虾的死亡率分别是100%和60%,WSSV的感染能够被抗VP124抗体中和。进一步利用定量PCR分析上述三种特异性抗血清对病毒感染的影响,结果显示,VP124抗血清可抑制WSSV在螯虾体内的增殖。所有结果表明,VP124在病毒的感染中起作用。     

White spot syndrome virus envelope protein VP124 involved in the virus infection

White spot syndrome virus （WSSV） is one of the major shrimp pathogens causing large economic losses to shrimp farming. In an attempt to identify the envelope proteins involved in the virus infection, purified WSSV virions were mixed with three antisera against WSSV envelope proteins （VP39, VP124 and VP187 ）, individually. And then they were injected intramuscularly into crayfish （Procambarus clarkii） to conduct in vivo neutralization assays. The results showed that for groups injected with virions only and groups injected with the mixture of virions and antiserum against VP124, the crayfish mortalities were 100% and 60% on the 8th day postinfection, individually. The virus infection could be delayed or neutralized by antibody against the envelope protein VP124. Quantitative PCR was used to further investigate the influence of three antisera described above on the virus infection. The results showed that the antiserum against VP124 could restrain the propagation of WSSV in crayfish. All of the results suggested that the viral envelope protein VP124 played a role in WSSV infection.     

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)丝氨酸蛋白酶同源物基因(Fc-SPH)的重组表达及活性分析

以实验室前期克隆到的中国明对虾丝氨酸蛋白酶同源物基因(Fc-SPH)(GenBank登录号:DQ318859)为基础,利用原核表达系统对Fc-SPH基因成熟肽区域进行了重组表达和纯化复性分析,并对获得的重组目的蛋白开展了抑菌活性及微生物清除功能研究。结果表明:在体外成功获得了大量有活性的对虾Fc-SPH蛋白(rFc-SPH),活性研究显示rFc-SPH对大多数受试菌种都有明显的抑制效果,并可以加速中国明对虾清除体内外源微生物的速度。作者推断Fc-SPH即可以作为一线防御应答效应物直接参与虾类的先天免疫活动而发挥作用,也可以通过调理作用促进血细胞对病原微生物的吞噬和杀灭。     

白斑综合症病毒囊膜蛋白VP28单链抗体的酵母表面展示及其抗病毒特性的初步研究

白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是对虾养殖业中危害最大的病原微生物之一,对对虾养殖业造成了巨大的经济损失,但目前尚无有效防治手段.本研究从WSSV囊膜蛋白VP28免疫的小鼠细胞中分别扩增到重链可变区基因和轻链可变区基因,大小为351 bp和342 bp.两基因序列通过Linker序列连接后,构建到酵母表面载体pYD1中,得到重组质粒pYD1-vp28scfv.将该重组质粒在酿酒酵母EBY100中诱导表达,通过免疫荧光实验发现,重组蛋白VP28scFv在酿酒酵母EBY100表面实现展示.进一步通过结合实验表明该展示蛋白具有WSSV的结合活性.本研究在结合酿酒酵母可作为饲料添加剂的特性基础上,对WSSV囊膜蛋白VP28单链抗体的抗病毒特性进行了应用,从而为WSSV的防治提供了新思路.     

对虾白斑综合症病毒膜蛋白VP41A的功能研究

对虾白斑综合症病毒（WSSV）是对虾养殖的主要病害之一,在虾养殖业中造成了严重的损失．本研究从WSSV基因组中克隆到vp41a基因,大小约为900bp,发现该基因编码蛋白VP41A．通过构建重组质粒pET．His一卅J0表达了重组蛋白VP41A,大小约为43kDa．并通过Ni一琼脂糖珠交联下拉实验,在虾血细胞中找到一个能与VP41A相互作用蛋白,质谱分析发现该蛋白为细胞粘连蛋白,说明在WSSV感染宿主细胞的过程中蛋白VP41A可能发挥重要作用．本研究结果推动了WSSV与宿主对虾相互作用的研究,有利于探索病毒复制或转录的关键蛋白,为最终的病毒防治及快诛诊断提供科学依据．     

养殖期中国对虾抗菌肽的表达

利用半定量RT-PCR方法,根据中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)抗菌肽的cDNA序列,设计一对特异引物,首次对中国对虾养殖期(PL11期仔虾～稚虾)抗菌肽的表达进行了研究。结果在各时期样本所提取的总RNA中,均扩增出一条长度约为200bp的特异性条带,表明中国对虾养殖期不同阶段均有抗菌肽的表达,提示中国对虾抗菌肽基因为组成型表达,并可能是中国对虾抵抗微生物感染的一个重要分子基础。     

二温式多重PCR检测鉴别对虾白斑综合征病毒(WSSV)和传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)的研究与应用

建立了一种同时检测对虾白斑综合征病毒（WSSV）、传染性皮下和造血器官坏死病毒（IHHNV）的二温式多重PCR技术。根据基因库中WSSV（AF369029）和IHHNV（NC002190）基因序列，设计了两对分别与WSSV和IHHNV某段保守基因序列互补的引物，用这两对引物对同一样品中的WSSV和IHHNVDNA模板进行多重PCR扩增，结果均同时得到了两条大小与实验设计相符的593bp（WSSV）和356bp（1HHNV）特异性多重PCR扩增条带，而对其他对虾疾病病原的PCR扩增结果均为阴性；敏感性测定结果表明，该多重PCR技术最低能检测到WSSV和IHHNVDNA各100pg。用该多重PCR对400份临床病料进行检测，结果230份检出WSSV，阳性率57．5％；96份检出IHHNV，阳性率24％；56份同时检出WSSV和IHHNV，阳性率14％。18份为阴性，阴性率为4．5％。结果提示了WSSV和IHHNV广泛存在于中国南方的养殖对虾中，作者建立的二温式多重PCR可以用于这两种病毒的临床快速检测和鉴别诊断。     

对虾白斑综合症病毒vp15基因的RNA干扰研究

VP15是对虾白斑综合症病毒(WSSV)的一种核衣壳蛋白,以往的研究表明VP15属DNA结合蛋白,具有潜在的浓缩包装病毒基因组的功能.利用RNAi技术将vp15基因沉默,来研究vp15基因沉默后对WSSV增殖及结构的影响.体外合成了vp15基因的特异双链RNA(vp15-dsRNA)和非特异双链RNA(gfp-dsRNA),分别与WSSV混合共注射淡水原克氏螯虾.在感染后24、36、48 h,每个实验组分别取病虾步足肌肉,样品用Trizol试剂盒提取RNA用于RT-PCR检测、用病毒检测试剂盒提取DNA模板用于荧光定量PCR分析.另外每组随机选取1只虾,取中肠,用于树脂包埋组织超薄切片分析.逆转录PCR分析结果显示vp15-dsRNA能特异性敲除vp15基因转录表达,实时荧光定量PCR分析结果显示vp15-dsRNA干扰vp15基因的表达能有效抑制WSSV病毒粒子的增值.此外,利用树脂包埋组织超薄切片电子显微镜技术观察发现vp15基因被干扰后病毒粒子数量上明显降低并且引起病毒粒子包装异常.通过vp15基因特异dsRNA干扰,有效抑制了WSSV病毒增殖,此外进一步阐明VP15蛋白的功能及其在病毒组装方面的重要作用,对进一步了解病毒组装以及病毒防治具有重要的意义.     

脊尾白虾白斑综合征病毒耐受群体重要免疫相关酶的活性分析

白斑综合征(white spot syndrome,WSS)的爆发已给虾类养殖业造成了严重经济损失,寻找能够指示虾类群体抗白斑病能力的指标对虾类养殖业具有重要意义。本研究以脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda Holthuis)为实验材料,以人工注射白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)攻毒后稳定存活的脊尾白虾作为WSSV耐受群体(命名为Rm),以注射PBS的虾作为对照群体(命名为Vm),分析比较了Rm群体和Vm群体的酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)活性差异以探讨筛选对虾抗病免疫指标的可行性。Rm群体的ACP和AKP活性均显著低于Vm群体(P0.05),而两群体在SOD活性上无显著差异。为进一步检验WSSV耐受群体是否比未经历过病毒感染的虾具有更高的抗WSSV的能力,作者以实验室养殖过程中经过WSSV自然感染后存活的脊尾白虾作为抗性群体(命名为Rn),以未经历过WSSV感染的脊尾白虾作为普通群体(Vn),进行WSSV人工注射攻毒,观察它们在WSSV感染后的存活率,结果显示Rn群体攻毒后存活率为33.2%,显著高于Vn群体的存活率15.1%(P0.05),说明ACP和AKP有可能作为虾类抗WSSV能力的评价指标。     

Molecular cloning and expression analysis of Crustin-like gene from Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis

A new member of antimicrobial protein genes of the Crustin family was cloned from haemocytes of the Chinese shrimp Fennero- penaeus chinensis by 3 ′and 5′ RACE. The full-length cDNA of Crustin-like gene contains a 390 bp open reading frame, encoding 130 amino acids. The deduced peptide contains a putative signal peptide of 17 amino acids and mature peptide of 113 amino acids. The molecular mass of the deduced mature peptide is 12. 3 ku. It is highly cationic with a theoretical isoelectric point of 8.5. The deduced amino acids sequence of this Crustin showed high homology with those of Penaeus （ Litopenaeus ） setferus. Northern blotting showed that the cloned Crustin gene was mainly expressed in haemocytes, gill, intestine, and RNA in situ hybridization indicated that the Crustin gene was constitutively expressed exclusively in haemocytes of these tissues. Capillary elec- trophoresis RT-PCR analysis showed that Crustin was up-regulated dramatically from 12 to 48 h after a brief decrease of mRNA during first 6 h in response to microbe infection. The level of Crustin mRNA began to restore at 72 h post-challenge. This indicated that Crustin gene might play an important role when shrimps are infected by bacterial pathogen.     

Enhanced resistance of marine shrimp Exopalamon carincauda Holthuis to WSSV by injecting live VP28-recombinant bacteria

Recombinant bacteria secreting the transmembrane-truncated region of white spot syndrome virus (WSSV) envelope protein VP28 named DhpVB were constructed, using live Escherichia coli as a deliverer and a constitutive secretory expression plasmid as the expression vector. With the ability to deliver recombinant protein products outside, DhpVB could make VP28 directly interact with the shrimp when injected into shrimp. In order to test the protection potential, live DhpVB were injected into the marine shrimp Exopalamon carincauda Holthuis for three times and WSSV challenge was performed twice simultaneously at the last two injections of the bacteria. The results showed that DhpVB displayed statistically significant advantage over bacteria without VP28 after the second challenge with an average RI (Resistance index) of 0.67 ± 0.08, compared with 0.41 ± 0.09 of bacteria without VP28 (P <0.05). The data suggested that a quasi-immune response may exist in E. carincauda and live bacteria carrying VP28 could enhance the shrimp resistance against WSSV.     

饲料中添加芽孢杆菌组分对凡纳滨对虾幼虾生长、能量代谢和抗WSSV能力的影响

以凡纳滨对虾(Litopnnaus vannamei)幼虾为实验动物,在其基础饲料中分别添加芽孢杆菌(Bacillus sp.)胞外蛋白粗提物(1.0%,胞外蛋白组)、胞内多糖粗提物(1.0%,胞内多糖组),以基础饲料为对照组饲料,进行为期28d的养殖实验,探讨芽孢杆菌胞外蛋白和胞内多糖粗提物对幼虾生长、能量代谢及抗病能力的影响。研究表明,芽孢杆菌2种粗提物对凡纳滨对虾的生长和成活率影响不显著(P>0.05)。饲喂2种粗提物影响了凡纳滨对虾肝胰腺和肌肉中能量代谢相关酶活力。胞外蛋白组肝胰腺中磷酸果糖激酶(PFK)、乳酸脱氢酶(LDH)活力在养殖实验前期显著高于对照组(P<0.05),而肌肉中PFK、LDH活力显著低于对照组(P<0.05);胞内多糖组肝胰腺中己糖激酶(HK)活力及肌肉中PFK、LDH活力显著低于对照组(P<0.05)。饲喂2种粗提物均显著提高了凡纳滨对虾肌肉中琥珀酸脱氢酶(SDH)活力和肝胰腺中电子传递系统(ETS)活力(P<0.05),胞外蛋白粗提物对肝胰腺中的SDH活力也有显著的提高作用(P<0.05)。饲喂2种粗提物显著降低了凡纳滨对虾肝胰腺及肌肉组织中脂肪酸合酶(FAS)含量(P<0.05)。此外,饲喂2种粗提物均会显著提高凡纳滨对虾肠道蛋白酶活力(P<0.05),而胞外蛋白粗提物使凡纳滨对虾肠道脂肪酶活力显著降低(P<0.05)。白斑综合征病毒(WSSV)感染后,与对照组相比,胞外蛋白组和胞内多糖组凡纳滨对虾半致死时间分别延长了26.19%和7.14%。根据以上结果推测,芽苞杆菌2种粗提物能够影响凡纳滨对虾能量代谢水平并提高其抗WSSV能力,且二者之间密切相关。     

In vivo neutralization assays by monoclonal antibodies against white spot syndrome virus in crayfish(Cambarus proclarkii)

The neutralizing activities of eight monoclonal antibodies （MAbs） against white spot syndrome virus （WSSV） （2D2, 2B2,1D2, 1D5, 1C2, 4A1, 6A4 and 6B4） were analyzed by in vivo experiments. Gills from WSSV-infected shrimp were homogenized and ten-fold serially diluted by PBS, and then incubated with MAbs （hybridoma culture supernatant）, respectively. The mixture of WSSV and MAbs were injected into crayfish （Procambarus clarkii）. After challenge, the death rates of crayfish were counted to determine the neutralizing activities of MAbs. At the same time, the mixture of myeloma culture supernatant and WSSV or PBS was served as positive or negative control, respectively. The results showed that, at each virus dilution, the mean time to death of the crayfish injected with MAb-treated virus was significantly longer than that in the positive control, though they all showed 100% mortality within 25 d, and meanwhile, few crayfish died in the negative control. Among the eight MAbs, 2D2, 2B2, 1D2 and 1D5, especially the former two, delayed the mortality significantly, and 1 C2, 4A1 and 6A4 delayed the mortality as well but not so efficiently, while MAb 6IM was efficient only when the virus concentration increased. The results indicated that the anti-WSSV MAbs can neutralize WSSV in different virus dilutions.     

3种水产病原菌简型基因芯片检测技术的建立

根据水产养殖中常见的3种病原菌鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)及迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)的研究资料,筛选3个毒力相关基因toxR、aerA、evpA设计引物和探针,构建简型基因芯片,并使用对虾白斑病综合征病毒(WSSV)variable region的PCR荧光标记产物作为表面化学质控。通过已构建和优化的多重PCR反应条件,获得了3个目的基因的PCR产物;经过芯片制作过程的优化,将探针以终浓度20μmol/L溶于50%DMSO,在室温、相对湿度45%的条件下点印于醛基基片表面。扩增的PCR产物与杂交液混合后,在42℃杂交2 h就可检测到理想的杂交信号。芯片的灵敏度试验结果表明,可以检测到的3种水产病原菌的最低模板DNA为:鳗弧菌3×102拷贝、嗜水气单胞菌5×103拷贝、迟缓爱德华氏菌6×101拷贝。该芯片可成功应用于患病大菱鲆内脏的细菌分离物的鉴定。     

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)Akt/PKB 基因在病原刺激下的表达和功能分析

本文在对中国明对虾转录组数据进行生物信息学分析的基础上,克隆获得了其Akt/PKB基因(FcAkt)的开放阅读框(ORF)的cDNA序列,分析了对虾FcAkt基因的结构特征,并利用实时定量RT-PCR技术分析了FcAkt基因在鳗弧菌、溶壁微球菌和白斑综合征病毒(WSSV)注射后的转录表达变化。结果表明,中国明对虾FcAkt基因的ORF全长为1536bp,编码511个氨基酸,预测蛋白分子量为58.9kDa,理论等电点pI为5.60。同源比对显示该基因的氨基酸序列在不同物种之间具有较高的保守性。进化分析发现FcAkt与地蟹、果蝇、埃及伊蚊、家蚕等节肢动物的蛋白激酶B(Akt/PKB)亲缘关系较近。FcAkt的转录表达在不同细菌或WSSV刺激后具有明显的变化,提示对虾FcAkt基因可能在对虾的免疫防御中发挥了重要作用。     

对虾白斑综合征病毒(WSSV)宿主研究进展

对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)自1992年暴发以来,已在世界范围内传播开来,每年给对虾养殖业造成巨大经济损失,至今仍未得到完全控制。本文根据1995～2005年的有关文献资料,综述了对虾白斑综合征病毒宿主方面的研究进展。     

对虾WSSV人工感染螯虾及其检测

用对虾白斑综合症病毒（WSSV）人工感染淡水克氏原螯虾（Procambarus clarkii),感染组螯虾3-6d内全部死亡,核酸探针点杂交两次检测感染螯虾的鳃、胃、血淋巴,阳性检出率分别为92%（92%）,89%（86%）,81%（75%）,对照为11%（3%）,3%（5%）,0（0）;光镜下可观察到感染螯虾的胃、鳃组织的靶细胞核肿大,嗜酸性着染,电镜下病变组织细胞核可见形态大小与WSSV一致的病毒粒子;病毒核酸原位杂交两次检测感染螯虾的胃、鳃、阳性检出率均为100%,对照阳性检出率均为0。结果表明：对虾WSSV可感染淡水克氏原螯虾,病毒核酸原位杂交是一种敏感特异的病毒检测方法。