浒苔脂肪酸前处理方法优化及GC/MS 分析

针对绿潮藻的快速化学溯源及资源化利用,以浒苔为对象,对其脂肪酸测定过程进行了研究;同时,通过对浒苔脂肪酸的皂化和甲酯化试剂、水浴温度和水浴时间等反应条件的优化,建立了绿潮藻脂肪酸前处理新方法。该方法的精密度在0.38%~3.25%之间,重现性在0.65%~5.80%之间;采用该方法测定福建、江苏和青岛的浒苔脂肪酸含量分别为0.10~5.69 mg/g、0.16~8.59 mg/g、0.10~4.76 mg/g。此方法可适用于浒苔等绿潮藻脂肪酸的实际测定。     

4种不同来源浒苔中多糖的提取分离及理化性质

为探讨不同季节以及不同地点采集的浒苔其多糖理化性质差异,采用水提醇沉法对黄海海域青岛沿海春(原料1)秋(原料3)两季采集的浒苔、2008年夏季爆发浒苔(原料2)以及东海海域福建沿海采集的浒苔(原料4)的多糖进行了提取,得到了4种冷水提取多糖PC1-4和4种热水提取多糖PH1-4。分别对8种浒苔多糖利用Q-Sepharose Fast Flow离子交换色谱法纯化后得到了12个组分。对各组分的总糖含量、糖醛酸含量、硫酸根含量以及蛋白含量进行了测定,利用气相色谱法测定了单糖组成,结果显示不同季节不同海域采集样品的化学组成及单糖组成不同。     

不同盐度、温度及光照对漂浮浒苔生理生态的影响

为研究不同盐度、温度及光照对漂浮浒苔生理生态的影响,我们将实验室内培养的浒苔置于不同盐度、不同温度及不同光照强度条件下培养,测定藻体光合参数。不同盐度条件下,对浒苔叶绿素荧光参数测定结果表明,在盐度为0的条件下,浒苔样品实际量子效率Fv/Fm快速降低,随后Fv/Fm维持在较低水平,在盐度10‰~40‰范围内,在前5天各处理样品Fv/Fm没有明显变化,之后样品Fv/Fm有不同程度的降低。不同实验温度条件下,对浒苔叶绿素荧光参数测定结果表明,在5℃~25℃,浒苔Fv/Fm呈现先上升后下降趋势。不同光照条件下,对浒苔叶绿素荧光参数Fv/Fm进行测定,其数值都在第一天发生了显著降低,之后稍有波动。藻体Fv/Fm变化有所不同,处理的前2天中,所有条件下样品都有相同幅度的降低,处理第三天时,光强400μmol/(m²·s)下比其他光强下的要显著低14%~16%;到培养后期,则以160μmol/(m²·s)下要明显较高,即160μmol/(m²·s)下藻体Fv/Fm的降低总体较为平缓。光照实验表明,浒苔在低光照条件下的实际量子效率要高于高光照条件,且最大量子效率的测定也进一步证实了该结果,表明高光照条件会引起浒苔光合作用能力下降。     

黄、渤海漂移浒苔(Enteromorpha prolifera)脂肪酸组成及聚类分析的研究

于2008年7月在黄、渤海区域采集了17个漂移浒苔样品,结合3个本地种,对其脂肪酸组成进行了GC-MS分析。结果表明,所有浒苔中优势脂肪酸为十六碳酸,相对含量在27.82%—43.27%之间。藻体中还含有丰富的PUFA,主要为9,12,15-十八碳三烯酸、6,9,12-十八碳三烯酸、9,12-十八碳二烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸,另外还含有EPA不饱和脂肪酸。以欧式距离平方为距离测量技术,类间距用平均链锁法,对20个不同地理位置的浒苔样品进行聚类分析,结果分为4大类,所有漂浮浒苔聚为第一类,青岛和连云港的本地种分别聚为另三类,说明青岛近海漂浮的浒苔不是青岛本地生浒苔,而是从外海漂移过来的,第一类的聚类结果显示了浒苔的漂移路径。结果表明,藻类脂肪酸的系统聚类分析为海洋绿藻分类与量化评价提供了一种好方法。     

绿潮藻浒苔对赤潮藻中肋骨条藻化感抑制作用初探

研究了绿潮藻浒苔Ulva prolifera对赤潮藻中肋骨条藻Skeletonema costatum生长的化感抑制作用。分别测定了不同浒苔新鲜藻体密度、不同浒苔藻体干粉末含量、不同浒苔新鲜藻体培养过滤液体积对中肋骨条藻生长的抑制效果。结果发现,第12天共培养系统中,各浒苔新鲜藻体密度组对中肋骨条藻生长抑制率均高达100%,其中5g·L-1密度组第8天对中肋骨条藻生长的抑制已达到100%;第12天1.2g·L-1浒苔藻体干粉末含量组对中肋骨条藻生长抑制率也可达到50%左右,表明绿潮藻浒苔对中肋骨条藻生长抑制作用具有量效关系,且对中肋骨条藻生长不仅存在营养竞争抑制作用,而且还具有化感物质抑制作用。进一步采用添加浒苔新鲜藻体培养过滤液实验发现,一次性添加浒苔培养过滤液对中肋骨条藻生长抑制作用不十分明显,而半连续添加浒苔培养过滤液对中肋骨条藻生长抑制效果十分明显,其中第12天对中肋骨条藻生长抑制可达75%左右,可见浒苔藻体内的化感物质是逐步向环境中分泌的。该研究为进一步研究绿潮藻对赤潮藻化感抑制效应量效关系奠定了基础。     

南黄海绿潮暴发与硝酸盐及水文环境因子的关系

为了解浒苔绿潮的发展态势、马尾藻分布区与漂移状况,本文基于2016—2017年浒苔暴发季(春末夏初)在黄海绿潮潜在起源区获取的多航次及参考2015年布放定点潜标的环境因子资料,通过高频的精细化硝酸盐监测,对影响黄海浒苔绿潮的起源和发生发展过程中的重要环境要素进行了分析。结果表明:不同年份,黄海浒苔绿潮具有相似的发生发展过程,两个年度的黄海表层硝酸盐分布趋势有差异;年际变化上, 2017年绿潮规模较上一年度显著偏小,该年度出现的黄海赤潮、金潮对绿潮规模有一定抑制作用。     

利用18S rDNA分子方法分析浒苔绿潮过境期间长牡蛎摄食情况的变化

近年来,我国海州湾浒苔暴发呈常态化趋势发展,日益威胁到该海域生态系统的健康。浒苔每年都会由南向北漂移经过平岛海域,在平岛海洋牧场中牡蛎是其重要的经济贝类,具有数量多、分布广、生态种群稳定等特点,浒苔对海洋牧场中这种滤食性经济贝类的影响亟待了解。使用传统的显微镜检测方法并不能准确鉴定出胃含物中有机物碎片成分,而应用DNA条形码技术则可以快速有效的判断这类摄食者的食物碎片来源。在本研究中,采集了浒苔发生前后不同时间的海州湾平岛海域特定区域的牡蛎。通过高通量DNA测序技术研究了其真核食物成分。扩增18S r DNA V4区共得到53347个有效序列短片段,聚类后得到105个类别,主要属于链形植物门(包括轮藻门和有胚植物(现存的陆生植物:苔藓维管植物)两大类)、绿藻门、囊泡虫门、子囊菌门等。其中,5月(WH1)、6月(WH2)、7月(WH3)、10月(WH4)的胃含物样品中分别发现了11、12、11和14个门的生物种类。进一步对WH1—WH4样品属水平进行聚类分析发现真核生物成分表现出显著的季节性差异,但在所有组当中并未发现石莼属或浒苔属成分。WH1样品中梨属和四胞藻纲含量最多。WH2样品中的子囊菌属和稻属含量均为4个样品中的最高值。WH3中共甲藻目的含量达到最高。WH4样品中沟鞭藻属的含量达到最高值。研究表明,牡蛎并没有直接摄食浒苔或石莼属成分,因此推断浒苔并不直接影响牡蛎的摄食情况。另外本研究首次发现被子植物在牡蛎胃含物中占有很高的比重,表明牡蛎食物源除来源于海洋外还有陆源有机质。     

不同状态浒苔对东海原甲藻生长的影响

近年来富营养化等海洋污染现象日益加重，我国近海每年都会暴发浒苔绿潮和微藻赤潮现象。本文在实验室模拟条件下，研究了不同状态不同含量的浒苔（Ulva prolifera），即浒苔新鲜藻体、浒苔培养液和浒苔干粉末与东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）共培养时产生的竞争抑制作用。结果表明，浒苔新鲜藻体、浒苔培养液和浒苔干粉末在初始质量含量大于1 g/L的条件下都会对东海原甲藻产生抑制作用，浒苔干粉末的抑制强度远远超过浒苔培养滤液和浒苔新鲜藻体。在二者共培养时，出现了“低促高抑”的现象，即浒苔含量较低时会促进东海原甲藻的生长，而高含量的浒苔则抑制东海原甲藻的生长，且抑制作用随浒苔含量的升高而增大。浒苔对东海原甲藻的这种抑制作用，一方面可能来自于营养物质的竞争和消耗，另一方面可能来自于浒苔释放的化感物质对东海原甲藻产生的影响。利用浒苔对东海原甲藻的抑制作用，可为东海原甲藻赤潮的生物防治提供一种思路与方法。     

福建沿岸海域浒苔藻类的营养成分含量与食用安全

对福建沿岸海域浒苔（Enteromorpha）样品的主要组成成分、氨基酸、脂肪酸、矿物质含量的研究表明,浒苔属高膳食纤维（49．0％～59．1％）、高蛋白质（19．60％～38．24％）、低脂肪（0．20％～0．55％）的藻类．浒苔中17种氨基酸总量（Ctaa）与蛋白质含量的比值为74．1％～91．0％;其必需氨基酸含量（Ctaa）占C11从的35．4％～40．0％,CⅢ与非必需氨基酸含量（C。Ⅲ）之比为0．55～0．67,且呈味氨基酸的含量丰富（47．1％）,氨基酸组成均衡．浒苔油脂中脂肪酸组成丰富,n一3PUFA含量达油脂总量的20．0％～26．4％,其中含有EPA、DHA．浒苔中矿物质含量较高,尤其富含镁、钙、铁、锌、硒、钾等人体必需矿物元素．有害元素测定结果表明,中、低潮区浒苔的铅、汞、镉、砷含量均能够符合《无公害食品海藻》安全指标的限量要求,养殖区、高潮区部分浒苔的Pb含量超标．研究结果认为,在低污染海区生长的浒苔是一种高蛋白质、高膳食纤维、低脂肪、矿物元素丰富且安全的海洋食品．     

不同温度与营养盐条件对浒苔（Ulva prolifera） 和肠浒苔（Ulva intestinalis） 的生长影响

2010 年4 月采集了江苏省南通市如东县紫菜养殖筏架上的浒苔（Ulva prolifera） 和肠浒苔（Ulva intestinalis） 样品, 对两种浒苔在不同温度和营养盐环境下的生长情况进行了研究,分析了其不同生长特点及对环境变化的响应。结果表明,浒 苔（U. prolifera）在15 益~25 益范围内,在浓度相对较高的营养盐组相对生长率较高。肠浒苔（U. intestinalis）在温度为10 益~ 20 益范围内,在浓度较低的营养盐组相对生长率较高。在两种浒苔相对生长率达到最大的同时,其对于营养盐的消耗量也达 到最大。据此,推测两种浒苔自身的生理生态特征及其对环境变化的响应是影响其生物量的重要因素。     

绿潮生物学机制研究

绿潮发生机制极其复杂,但其核心机理是绿潮暴发时漂浮"藻席"中的浒苔快速形成巨大生物量,涉及浒苔生物学过程对环境的响应及其生理生化基础。为此,本文在已有研究报道的基础上,对浒苔生活史研究进行了充分的理论补遗;分析了漂浮"藻席"中浒苔生长与繁殖过程,认为该过程是绿潮生物量形成的关键;阐述了浒苔孢子囊形成是对富营养化背景下海水溶解无机氮(DIN)中硝态氮高占比的响应,认为一氧化氮分子可促进浒苔营养细胞向孢子囊的转化;解析了浒苔细胞对逆境因子的响应途径与机制。基于已有的研究成果,本文对浒苔引发绿潮的生物学过程进行了理论推定。人为或自然因素使固着浒苔处于漂浮状态,形成小规模"藻席";富营养化背景下海水DIN中硝态氮占比的升高赋予了浒苔巨大的繁殖潜能,漂浮过程溶解无机碳(DIC)"充裕"和"不足"两个阶段的交替以及食藻动物啃食产生的藻片段使孢子囊形成比例大幅提升;孢子原位萌发等使释放的孢子在"藻席"中获得了附着基,个体数目随之指数增长;结合漂浮浒苔的高生长速率,"藻席"规模不断扩大,短时间内形成巨大生物量。同时,本文还对今后的绿潮研究提出一些建议,认为啃食动物在浒苔生物量消长过程中发挥重要作用,在漂浮"藻席"系统中扮演着"生态引擎"的功能,同时系统阐明浒苔孢子的原位萌发等现象的生物学机理应该是未来绿潮的重要研究内容。     

24-表油菜素内酯对浒苔(Ulva prolifera)内源植物激素及相关生理影响

采用植物激素的微量LC-MS检测等方法,研究了24-表油菜素内酯(EBR)对宁波浒苔(Ulva prolifera)内源植物激素含量及其叶绿素荧光参数、可溶性蛋白和糖含量、抗氧化酶活性等的影响。结果表明,浒苔体内含有吲哚乙酸、赤霉素、玉米素、反式玉米素核苷、异戊烯腺嘌呤核苷、茉莉酸等多种促生长性内源植物激素,但不含有异戊烯腺嘌呤。内源植物激素对24-表油菜素内酯的响应程度不同,大多数植物激素在处理第1天含量变化最快。低浓度24-表油菜素内酯处理时,各种内源植物激素的含量增高,均呈现先升高后降低的趋势。0.2 mg/L 24-表油菜素内酯处理组的效果最明显。在该浓度下,24-表油菜素内酯对生长相关激素含量、最大光能转化效率(Fv/Fm)和相对电子传递速率(ETR)、可溶性蛋白和可溶性糖含量、POD活性等均有较大的促进作用;在0.1 mg/L 24-表油菜素内酯处理组中,浒苔的体外抗氧化能力最强。     

基于无人机遥感的黄海绿潮搁浅生物量估算

浒苔在近岸搁浅后会破坏海岸景观,干扰水上运动,给滨海旅游业造成严重影响。本文使用无人机搭载的多光谱和可见光传感器对山东半岛的海阳、乳山和文登的三个海滩搁浅的浒苔进行航拍监测,并结合地物光谱测量数据,分别选择归一化植被指数（NDVI）、差值植被指数（DVI）和虚拟基线高度浮藻指数（VB-FAH）对海滩搁浅浒苔与岸边植被及非植被（海水、沙滩）进行识别评估,并分别估算了三个研究区搁浅浒苔的生物量。研究结果表明：NDVI可以识别植被和非植被,但无法区分潮间带上部和潮间带下部分布的浒苔;DVI和VB-FAH对植被和非植被的区分度不高,但对不同分布的搁浅浒苔具有一定的区分度,其中,DVI对潮间带上部和潮间带下部分布浒苔的识别能力优于VB-FAH。因此,通过对岸边植被进行腌膜,利用DVI构建海滩搁浅浒苔生物量估算模型,实现了海滩搁浅浒苔生物量的估算。海阳、乳山和文登三个海滩搁浅浒苔的生物量分别为1 468 t、745 t和5 034 t,本文提出的方法可以为搁浅浒苔的清理和资源合理分配提供技术支持。     

抗生素对浒苔形态及共附生细菌多样性的影响

本文研究了3种抗生素联合处理黄海绿潮浒苔(Ulva prolifera)形态及共附生细菌多样性的影响。将浒苔放散的配子加入到含有3种广谱抗生素(青霉素G、硫酸新霉素、多黏菌素B)的培养液中进行培养, 与对照组相比, 发现浒苔幼苗生长速度缓慢, 且细胞变小, 藻体无法形成正常形态。进一步采用16S rDNA高通量测序分析抗生素处理藻体前后的共附生细菌多样性, 发现抗生素处理后浒苔共附生细菌丰富度和多样性降低, 其中Maribacter丰度降低。将藻体与形态发生化合物thallusin(Maribacter spp. 提取物)共培养, 发现thallusin可促进藻体形态恢复和生长, 推测抗生素可通过抑制Maribacter等细菌从而影响浒苔形态和生长, 这将为浒苔共附生细菌功能的深入研究奠定一定基础。     

江苏海区浒苔的营养与食品安全性分析与评价

通过对不同海区浒苔及其与紫菜之间的比较,分析评价了江苏海区定生浒苔和漂浮浒苔的营养特性。通过主成分分析可以将江苏浒苔与其他浒苔和紫菜明显区分开,说明江苏浒苔的营养具有区域一致性。江苏浒苔具有高蛋白、低膳食纤维的特点,浒苔中钙、镁含量高于紫菜,磷含量低于紫菜。江苏浒苔的必需氨基酸含量组成适合人体需要,是良好的蛋白质来源。第一限制氨基酸为甲硫氨酸,呈味氨基酸含量达到氨基酸总量的33.6%—42.9%,具有较好的呈味特性。江苏浒苔的铅、铬离子含量较高,食用风险不容忽视。     

苏北浅滩筏架附生绿藻群落结构变化及与环境因子的相关性探究

苏北浅滩是研究浒苔绿潮早期形成机制的重要区域,该区域紫菜养殖筏架上附生绿藻的群落结构变化对浒苔绿潮的发生具有重要影响,环境因素在其中发挥了重要作用。为了探明导致苏北浅滩绿藻群落结构变化的主要环境因素,本文通过分子生物学和种群生态学方法对筏架附生绿藻群落结构进行了研究,结果表明:(1)苏北浅滩筏架附生绿藻群落主要由浒苔(Ulva prolifera)、盘苔(Blidingia sp.)、缘管浒苔(Ulva linza)、曲浒苔(Ulva flexuosa)和其他绿藻5个类群构成;(2)绿藻群落具有明显的演替现象,环境温度是导致绿藻群落结构变化的关键环境因素,适低温性的绿藻逐渐被浒苔等适应较高温度的绿藻取代;(3)浒苔的生物量从3月的1.65 g/m增加到了5月的31.78 g/m,所占比例也从低于5%达到接近40%,生物量的大量积累为绿潮早期漂浮斑块的形成提供了物质基础。本文研究结果为黄海绿潮的早期预警和防控提供了生态学依据。     

浒苔(Ulva prolifera)共附生细菌群落结构分析的引物优化

海藻共附生细菌密切参与宿主的生长发育、营养吸收等重要过程,浒苔(Ulva prolifera)是构成黄海绿潮的唯一优势种,对其共附生细菌开展群落结构分析,有望为成灾机制研究提供重要线索。由于植物叶绿体基因组同时具备原核特征和高拷贝数,会严重干扰共附生细菌基于16S rDNA的序列扩增。高等植物中开发了通用引物799F,利用其3′末端与植物同源区的非配对双碱基,可实现对细菌来源序列的特异性扩增。本文针对多个浒苔群体样本,首次评价了引物799F在藻类中的适用性,发现799F的3′末端与浒苔叶绿体同源区仅存在非配对单碱基,其扩增仍会受到浒苔叶绿体严重干扰。在引物799F的基础上,设计了新引物800F,与通用反向引物1492R配对扩增细菌16S rDNA中具高分辨率的V5-V9可变区,配合使用具热启动功能、同时不具校对功能的DNA聚合酶,可基本完全避免浒苔叶绿体来源序列的扩增,并阐明了方法的原理。优化的引物扩增方案可用于浒苔共附生细菌群落结构分析。     

浒苔光照和盐度胁迫响应基因UpMYB44的克隆与表达分析

为证明R2R3-MYB转录因子在浒苔响应非生物胁迫例如盐度和光照的过程中发挥的重要调控作用,利用实时荧光定量PCR、酵母双杂交系统、亚细胞定位等技术,研究获得了浒苔UpMYB44基因1 437 bp的开放阅读框(ORF)全长序列,编码478个氨基酸,属于典型的R2R3-MYB转录因子并通过烟草叶片转化确定其定位于细胞核,UpMYB44参与浒苔响应光照和盐度的胁迫过程,其中在低光和高盐胁迫下UpMYB44基因的相对表达量升高。筛选出了与UpMYB44互作的UpCPP5蛋白,该蛋白与浒苔的生长和细胞分裂有关,推测UpMYB44可能通过与UpCPP5互作,形成蛋白复合体参与浒苔的增殖过程。研究为日后深入探究MYB类转录因子家族调控藻类生长发育的过程奠定了基础,同时为研究浒苔快速繁殖的机制提供了思路。     

苏北浅滩沉积物中的大型绿藻微观繁殖体的垂直分布和物种多样性

本研究通过在2017年秋冬季组织实施的2个绿潮种源调查航次,研究苏北浅滩紫菜养殖区沉积物中的大型绿藻微观繁殖体的垂直分布和物种多样性。对沉积物中的微观繁殖体的定量实验结果表明:表层泥样中绿藻微观繁殖体的丰度最高,随着深度的增加迅速降低。在9月份表层沉积物中丰度为9±2ind./g,而在11月份表层丰度达到98±25ind./g;与9月份相比, 11月份浅滩沉积物中绿藻繁殖体数量呈现出显著升高的趋势。通过对51个绿藻样品的分子鉴定发现:沉积物中存在石莼属(Ulva)、尾孢藻属(Urospora)、盘苔属(Blidingia)等大型绿藻的微观繁殖体;数量占优是石莼属繁殖体,主要包括曲浒苔(Ulva flexuosa)、浒苔(Ulva prolifera)、扁浒苔(Ulva compressa)、缘管浒苔(Ulva linza);其中曲浒苔占据的比例最高,在9和11月份分别达到80.94%和73.33%。在2个调查航次中,都从沉积物中发现了绿潮浒苔的微观繁殖体,这些微观繁殖体是绿潮浒苔在苏北浅滩种源维持的重要方式和关键阶段,也构成了黄海浒苔绿潮连年暴发的"种子库"。     

2013年春季苏北浅滩紫菜养殖区绿藻和微观繁殖体的分布现状

为了揭示苏北浅滩紫菜养殖区附着绿藻和绿藻微观繁殖体的分布现状,从2013年三月到五月份对苏北浅滩紫菜养殖区及附近海域进行航次调查。结果表明, 绿藻微观繁殖体在水体和沉积物中广泛分布,水体中的平均值为267株/L,沉积物中的平均值为43株/g。调查期间,紫菜养殖区筏架上附着绿藻的生物量持续增长。在紫菜筏架上发现有浒苔,缘管浒苔,盒管藻三种绿藻,其优势种为盒管藻,其次是浒苔。研究表明,绿潮发生早期在苏北浅滩海域存在绿藻微观繁殖体和附着绿藻,这将为中国绿潮治理提供理论支撑。