中国明对虾Rel/NF-κB家族基因在弧菌刺激下的表达

利用RT-PCR和RACE技术获得了中国明对虾Rel／NF-κB家族成员FcRel基因的部分cDNA片段，并研究了该基因在弧菌刺激条件下的转录表达变化。结果表明，该cDNA编码320个氨基酸，包含一个完整的RHD结构域和部分IPT-NFkappaB结构域。FcRel基因的RHD结构域与其它物种的RHD结构域的分子系统学分析表明，中国明对虾的FcRel与果蝇的Relish聚在一起，然后与疟蚊、烟草天蛾等其它节肢动物的Relish聚为一类。在弧菌刺激时，FcRel在血细胞和淋巴器官中的转录表达显示出不同的变化模式。在弧菌注射后3h和5h，血细胞中FcRel的转录表达出现明显下调；而弧菌注射引起淋巴器官中FcRel基因明显的上调表达。说明FcRel基因的表达与弧菌刺激密切相关，提示Relish可能参与了对虾抗菌反应的信号转导通路。     

脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)组织蛋白酶D基因的克隆及其表达分析

采用RACE技术获得了总长为1853bp的脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)组织蛋白酶D基因全长cDNA序列。该基因5′和3′非编码区分别为120bp和572bp,开放阅读框为1161bp,推测编码386个氨基酸,预测分子量为42.36kDa,理论等电点为7.54,命名为EcCatD基因。同源性和系统进化分析表明,EcCatD基因与斑节对虾、美洲螯龙虾的相似性分别为86%和80%,与斑节对虾和美洲螯龙虾紧密聚为一支。荧光定量RT-PCR结果表明,EcCatD基因在血细胞中的相对表达量最高,其次为肝胰腺。该基因在鳗弧菌和WSSV感染后的脊尾白虾血细胞和肝胰腺中的表达量显著增加,并具有不同的时空表达趋势。结果表明EcCatD基因在脊尾白虾免疫反应中具有重要作用。     

致病性鳗弧菌W-1外膜蛋白ompU基因克隆及在大肠杆菌中的表达

从致病性鳗弧菌W-1基因组DNA扩增并克隆了1 156bp的特异性片段,含有完整的外膜蛋白ompU基因阅读框,由993个核苷酸组成,编码330个氨基酸残基的蛋白质。与国外已发表的鳗弧菌外膜蛋白基因的序列同源性为100%,与创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、费氏弧菌(Vibrio fischeri)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的序列同源性分别为72%,69%,68%和64%。将该外膜蛋白基因克隆于pBV220表达质粒,在大肠杆菌中得到了表达,SDS-PAGE分析表明表达蛋白分子量约38kDa,Western blot分析发现表达蛋白能与鳗弧菌外膜蛋白抗体很好的反应。     

短蛸(Octopus ocellatus)酪氨酸蛋白激酶Btk基因的克隆及其mRNA在细菌刺激后的表达规律*

本研究从前期构建的短蛸cDNA文库中克隆获得了一个短蛸(Octopus ocellatus)酪氨酸蛋白激酶(OoBtk)基因的cDNA全长,其cDNA全长1191 bp,包括5’非编码区(UTR)259 bp,3’UTR 227 bp,开放阅读框(ORF)705 bp,编码234个氨基酸,预测理论等电点为8.50,分子量为27.7 kD。运用实时荧光定量PCR法分析了OoBtk在健康短蛸不同组织及鳗弧菌、藤黄微球菌刺激后短蛸血细胞中的表达规律,结果表明：OoBtk在健康短蛸肌肉、外套膜、鳃、鳃心、系统心脏、肝胰脏、肾囊、胃、性腺和血细胞等各检测组织中均有表达,其中在肝胰脏的表达量最高;短蛸经鳗弧菌和藤黄微球菌刺激后,OoBtk在血细胞中的表达量呈现出了明显的被诱导表达趋势,在鳗弧菌和藤黄微球菌刺激后6 h后表达即增强,并分别在鳗弧菌刺激后48 h和藤黄微球菌刺激后12 h达到最高。OoBtk参与短蛸对于鳗弧菌和藤黄微球菌刺激的应答过程。     

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)Akt/PKB 基因在病原刺激下的表达和功能分析

本文在对中国明对虾转录组数据进行生物信息学分析的基础上,克隆获得了其Akt/PKB基因(FcAkt)的开放阅读框(ORF)的cDNA序列,分析了对虾FcAkt基因的结构特征,并利用实时定量RT-PCR技术分析了FcAkt基因在鳗弧菌、溶壁微球菌和白斑综合征病毒(WSSV)注射后的转录表达变化。结果表明,中国明对虾FcAkt基因的ORF全长为1536bp,编码511个氨基酸,预测蛋白分子量为58.9kDa,理论等电点pI为5.60。同源比对显示该基因的氨基酸序列在不同物种之间具有较高的保守性。进化分析发现FcAkt与地蟹、果蝇、埃及伊蚊、家蚕等节肢动物的蛋白激酶B(Akt/PKB)亲缘关系较近。FcAkt的转录表达在不同细菌或WSSV刺激后具有明显的变化,提示对虾FcAkt基因可能在对虾的免疫防御中发挥了重要作用。     

短蛸(Octopus ocellatus)酪氨酸蛋白激酶基因的克隆及其mRNA在细菌刺激后的表达规律

从前期构建的短蛸(Octopus ocellatus)c DNA文库中克隆获得了一个短蛸酪氨酸蛋白激酶(Oo Btk)基因的c DNA全长,其c DNA全长1191 bp,包括5’非编码区(UTR)259 bp,3’UTR 227 bp,开放阅读框(ORF)705 bp,编码234个氨基酸,预测理论等电点为8.50,分子量为27.7 k Da。运用实时荧光定量PCR法分析了在健康短蛸的不同组织以及鳗弧菌和藤黄微球菌刺激后血细胞中Oo Btk的表达规律,结果表明:Oo Btk在肌肉、外套膜、鳃、鳃心、系统心脏、肝胰脏、肾囊、胃、性腺和血细胞等各检测组织中均有表达,其中在肝胰脏的表达量最高;短蛸经鳗弧菌和藤黄微球菌刺激后,Oo Btk在血细胞中的表达量呈现出了明显的被诱导表达趋势,在鳗弧菌和藤黄微球菌刺激后6 h表达即增强,并分别在鳗弧菌刺激后48 h和藤黄微球菌刺激后12 h达到最高。Oo Btk参与短蛸对于鳗弧菌和藤黄微球菌刺激的应答过程。     

一种低密度脂蛋白受体相关蛋白在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)抗弧菌感染中的功能研究

低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)是一类细胞表面蛋白,属于一种内吞性受体,其在调节脊椎动物血脂平衡中的作用已被广泛报道。前期在凡纳滨对虾弧菌抗性家系和敏感家系的比较转录组分析中发现一种低密度脂蛋白受体相关蛋白基因的转录表达存在明显差异,为明确该基因在对虾抗弧菌感染中的作用,我们对该基因进行了全长cDNA克隆、表达特征分析和功能的初步研究。该基因在凡纳滨对虾中存在两个转录本,分别命名为LvLRP1-1和LvLRP1-2。LvLRP1-1的cDNA序列全长为916bp,编码226个氨基酸;LvLRP1-2的cDNA全长为787bp,编码183个氨基酸。两个转录本的cDNA序列高度一致,唯一的差别在于LvLRP1-1的cDNA比LvLRP1-2多129 bp,多编码43个氨基酸。组织表达分析显示LvLRP1-1在对虾的眼柄、表皮、脑和心脏中高表达,而LvLRP1-2仅在眼柄和表皮中呈现高表达。在副溶血弧菌感染对虾后, LvLRP1-1和LvLRP1-2的转录表达变化趋势一致,均在感染后3h其转录水平明显升高,6h之后又恢复到正常水平。利用双链RNA技术对LvLRP1-1和LvLRP1-2同时...     

大菱鲆mIgD重链基因的克隆与表达分析

利用RACE技术克隆获得大菱鲆(Scophthalmus maximus)膜结合型免疫球蛋白D(Membrane-bounded Ig,mIgD)重链基因的cDNA序列全长,该基因全长3 357bp,包含1个2 997bp的开放阅读框,编码999个氨基酸,基因结构为VDJ-μ1-δ1-δ2-δ3-δ4-δ5-δ6-δ7-TM。重链恒定区δ1~δ7氨基酸序列同源比对结果显示,其与庸鲽(78%)、鳜(71%)、牙鲆(68%)具有较高的同源性;多序列比对结果显示,大菱鲆mIgD的每个δ恒定区内均存在色氨酸与半胱氨酸保守位点。利用邻位相连法构建硬骨鱼类免疫球蛋白系统发育树,结果显示,鱼类IgD聚为一大支,大菱鲆IgD与庸鲽及牙鲆聚为一支。利用RT-PCR分析了大菱鲆IgD重链基因的组织差异表达,结果显示,其在外周血白细胞、脾脏、前肾及中肾组织中具有较高的表达。将大菱鲆腹腔注射福尔马林灭活鳗弧菌后,实时荧光定量PCR检测其前肾组织中mIgD重链基因应答表达量,结果显示,mIgD重链基因在注射鳗弧菌后呈显著下调趋势,在注射后8h时降至最低值,其相对表达量约为对照组的1/28,然后呈逐渐恢复上调趋势,在48h时mIgD相对表达量与对照组无显著差异。     

大菱鲆免疫球蛋白轻链IgL全长cDNA的分离、鉴定及表达分析

实验采用末端快速扩增(RACE)技术从大菱鲆脾脏cDNA文库中筛选得到了免疫球蛋白轻链IgL的全长cD-NA片段。该序列包含47 bp的5′末端非编码区(5′UTR),738 bp的开放阅读框(ORF)和202 bp 3′UTR,整个开放阅读框编码246个氨基酸。系统发生分析表明大菱鲆IgL基因与五条鰤的IgL基因起源关系最近。RT-PCR分析表明,大菱鲆IgL基因只在正常脾脏、肾脏和头肾组织中表达;IgL在大菱鲆胚胎发育细胞期就已开始表达,在大菱鲆胚胎尾芽期和体节期表达持续增强;在鳗弧菌感染大菱鲆脾脏和头肾早期均检测到IgL基因强烈表达,后期表达逐渐减弱;大菱鲆胚胎细胞(TEC)在用鳗弧菌感染48h后,IgL开始表达。这些结果均表明IgL基因在大菱鲆免疫应答中起着重要作用。     

哈维氏弧菌FlaA基因的克隆、序列分析及真核表达质粒的构建

哈维氏弧菌是水产病害中常见的致病菌.参照基因库上登录的弧菌鞭毛丝蛋白FlaA基因序列设计简并引物,PCR扩增哈维氏弧菌TS-628株的FlaA全基因,并克隆到pMD 18-T载体中测序,经序列分析该基因全长1 140 bp,编码379个氨基酸.与基因库中其他弧菌的同源基因序列比较显示,哈氏弧菌FlaA基因与霍乱弧菌FlaA基因的同源性最高(79.5%),该基因编码的多肽缺乏半胱氨酸,并在N-,C-两端的氨基酸序列较为保守,中间区域的变异较大.对该蛋白的氨基酸组成及空间结构进行了分析和预测,并推测该蛋白质的平均分子量为40.6 kDa.在该基因末端加上一段编码Flag短肽的核苷酸序列后克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),获得带哈氏弧菌鞭毛丝蛋白FlaA基因的真核表达重组质粒pcDNA-FlaA-tag,为其DNA疫苗的进一步研究奠定了基础.     

新基因功能验证技术及其在微藻基因克隆中的适用性分析

微藻是指1群真核、单细胞、行光合作用的生物。微藻种类多,分布广泛,有关键生态学功能,也有水产、生物能源应用价值。与模式生物和经济动植物一样,新基因克隆是微藻生物学研究的主要内容。基因组注释、转录组分析和基因分离等依据序列和结构同源性,是从已知到已知的过程;而新基因克隆需锁定序列和验证功能,其中,功能验证是基因克隆的最重要内容。已有的基因功能验证方法有基因敲除、基因沉默、插入突变、基因组编辑等。多种微藻已有遗传转化技术,有望直接采用模式生物和经济动植物的基因功能验证技术克隆新基因。本文归纳了已有新基因功能验证技术,并分析了它们在微藻新基因克隆中的适用性,以促进微藻新基因克隆研究。     

海参、海胆养殖水体中多抗性细菌抗性基因的初步研究

抗药性细菌对生态环境、养殖业以及人类健康构成严重威胁。以大连海参、海胆养殖场多抗性细菌筛选为基础,采用分子生物学手段对40株抗性细菌进行了氯霉素、土霉素及氟氯霉素抗性基因检测,探讨抗药性分子遗传机理,从而为控制抗药性细菌的产生和传播提供研究基础。     

基于16S rRNA与COI基因40种石斑鱼亚科鱼类分子系统进化关系

本研究采集了分布在西太平洋的石斑鱼亚科10属共40种鱼类，采用PCR扩增及测序技术获得所有样品16S rRNA、COI基因部分序列，利用最大似然法构建系统进化树并分析。结果表明:40种鱼类COI基因为651 bp，编码227个氨基酸，16S rRNA基因同源序列566 bp，序列存在一定的碱基插入与缺失，各物种16S rRNA基因序列变异比COI要少，序列较为保守。构建的系统进化树上，在本研究的石斑鱼亚科10个属中，鳃棘鲈属分类地位最原始，位于进化树基部，6种鳃棘鲈能聚成一个单系；烟鲈属与九棘鲈属关系较近，两者聚为一支，侧牙鲈属的进化地位介于鳃棘鲈属与九棘鲈属之间；石斑鱼属的进化地位最高，位于进化树顶部，形成两个平行分支，但是石斑鱼属种类未能聚成一个单系；驼背鲈属、鸢鮨属、下美鮨属、光腭鲈属及宽额鲈属均未能形成独立分支，而是与石斑鱼属种类聚在一起，显示其与石斑鱼属有很近的亲缘关系，部分可能是石斑鱼属的特化类群。     

鱼类转基因技术综述

基因转移的研究为鱼类遗传育种开辟了一条全新的途径。自1985年第1例转基因鱼问世至今已获得20～30种转基因鱼,在促进生长,提高鱼类抗逆性、抗病性等方面取得了巨大成绩。本文主要阐述了转基因鱼的构建机理、方法和检测方法以及各自的优缺点。外源基因的定点整合、稳定表达和遗传仍需要深入研究。构建“全鱼”基因则是今后发展的方向,受到越来越多的关注。     

三疣梭子蟹线粒体DNA 16S rRNA和COI基因片段序列的比较研究

本文采用 PCR扩增和序列测定等技术 ,对三疣梭子蟹 (Portunustrituberculatus)线粒体DNA1 6Sr RNA和 COI基因片段进行了初步研究。经 PCR扩增和序列测定 ,分别得到 1 6Sr RNA和 COI2个基因片段的碱基序列 ,其中 1 6Sr RNA基因片段的大小为 566bp,碱基 A,T,G,C的含量分别为 35.1 6% ,34.45% ,1 2 .37%和 1 8.0 2 % ;COI基因片段的大小为 658bp,碱基 A,T,G,C的含量分别为 36.63% ,2 6.44% ,2 0 .52 %和 1 6.41 %。在 2种基因片段中 ,AT含量均明显高于 GC含量 ,这与果蝇、虾类、蟹类等无脊椎动物的 1 6Sr RNA和 COI基因片段研究结果相似。通过对三疣梭子蟹 1 6S r RNA和 COI2个基因片段遗传特征的研究 ,发现其种内变异较低 ,在 3个样本中 1 6Sr RNA基因片段序列完全一样 ,COI基因片段中也只有 2个 T/ C位点转换。另外 ,比较本研究所得序列与 Gen Bank中梭子蟹科 5个属的 1 6Sr RNA基因片段序列后 ,发现其聚类结果与传统分类相一致。     

我国东南沿海坛紫菜遗传多样性研究

利用线粒体COX和叶绿体rbcL基因片段对我国东南沿海坛紫菜(Pyropia haitanensis Chang et Zheng)9个野生群体和2个养殖群体(共125个个体)进行遗传多样性分析。比对分析后得到408 bp的COX基因片断和488 bp的rbcL基因片断。联合分析的基因片断长度为896 bp,其中T、C、A、G的含量分别为34.9%、14.6%、34.2%和16.3%。检测到变异位点128个,其中单碱基变异位点19个,简约信息位点109个。群体的平均核苷酸多样性为0.035 9±0.028 4,单倍型多样性为0.817 0±0.024 0。125个个体共定义了31个单倍型,其中Hap1、Hap10和Hap16是核心单倍型,分别占全部样本的32.8%、12.8%和24.8%。群体遗传距离和地理距离相关性检测显示二者呈线性相关(R²=0.002 2,p=0.735 4),即遗传距离随地理距离的增大而增大,但未形成地理隔离。根据单倍型构建的ML树显示,坛紫菜群体之间没有明显的地理谱系结构,表明各个群体之间存在基因交流。     

3种蛏类线粒体16SrRNA和COI基因片段的序列比较及其系统学初步研究

对3种蛏类大竹蛏（Solen grandis），长竹蛏（Solen strictus）和小刀蛏（Cultellus attenuatus）的线粒体16SrRNA和COI基因片段序列进行了比较并对其系统学进行了初步研究。得到的序列总长度分别为472-481bp（16S）和658bp（COI）。3种蛏序列的碱基组成均显示出较高的A＋T比例（16SrRNA基因62．1％；COI基因62．8％）。对位排序比较表明，16SrRNA片段种内个体间变异较小，3种类间存在128个碱基变异位点（其中包括127个简约信息位点）和5个插入／缺失位点，总共12个碱基长；COI片段有200个碱基存在变异，其中包括191个简约信息位点，不存在任何插入／缺失位点。数据分析结果表明16SrRNA和COI基因片段大竹蛏与长竹蛏两片段的遗传距离分别为0．0856和0．1712，两竹蛏类与小刀蛏的遗传距离分别为0．3054，0．2798和0．2662，0．2933。作者认为小刀蛏与竹蛏之间的遗传距离已达到科之间的水平，结果支持将其提升为刀蛏科的分类观点。3种蛏类线粒体16SrRNA和COI基因在种间明显的多态性，证实了16SrRNA和COI基因序列均普遍适用于蛏类种及以上阶元的系统学分析。     

半滑舌鳎病原鳗利斯顿氏菌表型及分子特征研究

2008年12月,江苏赣榆某渔场养殖半滑舌鳎出现大量死亡,症状主要表现为:头部、鳃盖及鳍基出血,尾鳍腐烂,腹腔膨胀并积有大量腹水,部分病鱼肠管脱出肛外。从病鱼肝脏、腹水中分离出大量优势生长的细菌,人工感染试验证明其对半滑舌鳎有较强的致病性。对3株分离菌进行了形态特征、理化特性、胞外酶及溶血素活性等表型生物学性状检验;测定了代表菌株的16S rRNA和gyrB基因序列,分析了16S rRNA和gyrB两种基因序列的同源性,并构建了系统发生树,比较了两种基因对分离菌的鉴定能力;结果表明gyrB基因用于细菌种间鉴定更具优越性;基于16S rRNA和gyrB基因的系统发育学分析表明分离菌与鳗利斯顿氏菌具有高同源性,根据分离菌的表型及分子特征,判定分离菌为利斯顿氏菌属(Listonella MacDonell and Colwell 1986)的鳗利斯顿氏菌[Listonella anguillarum (Bergeman 1909) MacDonell and Colwell 1986]。胞外酶活性及溶血活性检测表明3株分离菌均具有淀粉酶、蛋白酶、卵磷脂酶等胞外酶活性,在含7%家兔脱纤血液营养琼脂培养基上呈β型溶血,PCR检测3株供试菌均可扩增出大小约493 bp的溶血素基因和大小约248bp的金属蛋白酶基因。分离菌的耐药谱测定结果显示,对供试49种抗菌药物中的青霉素G等13种药物耐药,对羧苄青霉素等6种药物存在敏感与耐药的株间差异。     

虾夷扇贝Smad基因家族的鉴定及表达分析

Smad基因介导的细胞信号在调节动物发育和细胞干性方面起着至关重要的作用。由于其功能的多样性和重要性,Smad基因家族一直受到广泛的研究。然而,双壳贝类Smad基因家族缺乏系统的鉴定和分析。为了理解双壳贝类Smad基因家族的进化和生物学功能,本文在虾夷扇贝基因组鉴定出4个Smad基因,并对其遗传和表达特征进行了分析。时空表达谱显示,Smad3基因在虾夷扇贝受精卵和2~8细胞时期有较高的表达量,而在胚胎及幼虫阶段该基因表达量迅速降低,推测其在胚胎早期细胞分裂和分化过程中发挥重要作用。Smad6在胚胎发育早期表达量较低,在囊胚期及原肠胚时期表达量显著升高,可能与母源调控向合子型调控过渡的“中期囊胚转换”有关。Smads基因在各组织中也呈现了独特的表达模式,其中Smad3、Smad5和Smad6分别在肌肉、血细胞和鳃中表达量最高。而Smad4在各个组织内均有表达且表达量相似。实验结果暗示了Smad基因在虾夷扇贝中不仅参与协调了早期胚胎的发育,也与组织器官的形成和稳态有关。本研究有助于理解贝类Smad基因的进化及功能,为深入研究该基因家族在贝类中的生物学功能和调控机制奠定基础。     

基于线粒体COI和16S rRNA基因的中国沿海相手蟹系统发育研究

相手蟹科的诸多种类因其形态极其相似成为方蟹总科分类中疑问较多的一个类群。通过对中国沿海相手蟹线粒体COI和16S rRNA基因序列进行分子系统发育分析，结果表明14种相手蟹COI和16S rRNA基因序列之间差异分别为5.7%～14.5%和1.5%～12.1%，均达到了种间差异水平。构建的系统发育树显示，14种相手蟹分别为独立有效物种，但分属于拟相手蟹属和近相手蟹属的4种拟相手蟹和3种近相手蟹，没有分别形成2个独立的支系，而是混合聚成一大支系。而属于螳臂相手蟹属的无齿螳臂相手蟹则首先与属于中相手蟹属的中华中相手蟹聚成一支，再与红螯螳臂相手蟹聚为一大支，表现出与形态分类的不一致。错综复杂的分子系统关系预示着相手蟹类为多系起源，也表明它们之间的种间关系乃至于属间关系尚有诸多问题有待进一步厘定。