热带海洋珍珠贝类立克次体(RLO)病研究 Ⅷ.养殖大珠母贝贝苗养成期群体RLO病流行病学研究

大珠母贝人工养殖过程中,幼贝死亡是一个严重的问题。1993年11月至1995年5月,采用现场调查、实验室研究和数理分析相结合的方法,在海南省临高县新盈珍珠贝养殖场自然海区吊养的A,B,C3批养殖贝和陵水新村珍珠贝养殖场养殖池吊养的D批养殖贝的发病和死亡情况进行了流行病学凋查.结果显示,大珠母贝幼贝群体的死亡是以暴发性方式发生,幼贝群体的大批量死亡高峰一般发生在4～6月龄期,8个月以后随着龄期的延长,死亡率显著降低.幼贝群体死亡率与贝体平均体长的关系是4cm以下的贝体死亡率较高,1～3cm阶段处于死亡高峰期内,5cm以上的贝体死亡率显著降低.大珠母贝幼贝群体的死亡率与类立克次体感染(即RLO平均感染严重度指数SI)之间存在显著的相关性,在RLO感染的高峰之后或当中部相应伴随贝群体死亡率的高峰,随着RLO感染的降低,贝群体的死亡率也明显降低。在4批养殖贝群体中,仅在A批养殖贝群体样本中发现有少量纤毛虫寄生(感染率为87.5%,感染强度为3.56个/10倍物镜).这几批幼贝群体的死亡与海水温度、盐度之间均无相关性。     

培育密度对大珠母贝受精卵的孵化率及不同期幼虫生长率、成活率与变态率的影响

为了确定大珠母贝(Pinctada maxima)人工繁育过程中受精卵适宜孵化密度和不同发育期幼虫适宜培育密度,设立四组实验比较了培育密度对大珠母贝育苗效果的影响。实验I,比较了受精卵培育密度对孵化率与幼虫大小的影响,受精卵密度设为10个/mL、20个/mL、30个/mL与40个/mL;实验II,比较了D形幼虫培育密度对生长率与成活率的影响,幼虫密度设为1.0个/mL、2.0个/mL、3.0个/mL与4.0个/mL;实验III,比较了壳顶初期幼虫培育密度对生长率与成活率的影响,幼虫密度为1.0个/mL、1.5个/mL、2.0个/mL与2.5个/mL;实验IV,比较了眼点期幼虫密度对变态率与生长率的影响,眼点幼虫密度设为0.4个/mL、0.8个/mL、1.2个/mL与1.6个/mL。结果表明,大珠母贝受精卵培育密度对孵化率存在显著影响(P0.05),对幼虫大小影响不显著(P0.05)。培育密度对D形幼虫与壳顶幼虫的生长率和成活率均存在显著影响(P0.05),生长率与成活率随着密度增加而降低。培育密度对眼点幼虫的变态率和附着幼苗的生长存在显著影响(P0.05)。大珠母贝苗种繁育阶段,合适的受精卵培育密度为10-30个/mL,D形幼虫培育密度为1-3个/mL,壳顶初期幼虫为1.0-1.5个/mL,眼点幼虫为0.4-0.8个/mL。     

热带海洋珍珠贝类立克次体病研究 Ⅳ.组织细胞病理学研究

类立克次体(RLO)对大珠母贝和合浦珠母贝具有强烈的致病性,引起基本一致的病理变化.在急性坏死破坏期内,RLO导致外套膜、鳃、消化管、肝胰腺、生殖腺腺管及全身血管内皮系统等多器官组织的变性坏死,使器官组织结构的完整性遭到破坏,破坏程度与RLO包涵体的数目密切相关,而细胞的破坏与细胞内RLO的生长发育及繁殖到大量数目密切相关.鉴于此,将RLO引起的珍珠贝病称为类立克次体病(RLO病).RLO病呈急性变质性炎症和慢性增生性炎症病理,在前者细胞呈现崩解性坏死、溶解性坏死和退变性坏死;在后者存在实质细胞增生和纤维母细胞增生为纤维细胞并形成纤维化.根据炎症病理的发展过程,RLO病可分为急性坏死破坏期和慢性增生修复期.     

热带海洋珍珠贝类立克次体病研究 Ⅳ.组织细胞病理学研究

类立克次体（RLO）对大珠母贝和合浦珠母贝具有强烈的致病性,引起基本一致的病理变化．在急性坏死破坏期内,RLO导致外套膜、鳃、消化管、肝胰腺、生殖腺腺管及全身血管内皮系统等多器官组织的变性坏死,使器官组织结构的完整性遭到破坏,破坏程度与RLO包涵体的数目密切相关,而细胞的破坏与细胞内RLO的生长发育及繁殖到大量数目密切相关．鉴于此,将RLO引起的珍珠贝病称为类立克次体病（RLO病）．RLO病呈急性变质性炎症和慢性增生性炎症病理,在前者细胞呈现崩解性坏死、溶解性坏死和退变性坏死;在后者存在实质细胞增生和纤维母细胞增生为纤维细胞并形成纤维化．根据炎症病理的发展过程,RLO病可分为急性坏死破坏期和慢性增生修复期．     

热带海洋珍珠贝类立克次体病研究──大珠母贝病原类立克次体包涵体的组织学及超微结构研究

于1993年11月和1994年11月在海南省临高县新盈珍珠贝养殖场采集患病或濒死的大珠母贝幼贝,采用组织切片和扫描电镜技术对其病原类立克次体（Rickettsia-likeorganism,RLO）的包涵体进行组织学和超微结构研究,以期找出RLO包涵体在宿主细胞内形态发生的内在规律。结果表明,RLO包涵体寄生在宿主多处内脏组织,但RLO具有明显的嗜细胞特异性,感染的靶细胞为上皮（或表皮）、结缔组织和血管内皮细胞;包涵体存在不同的发育时期,可分为颗粒前期和颗粒期,后者又可分为颗粒Ⅰ—Ⅲ期;包涵体是由两种颗粒外包一界膜而形成,其中小而纤细的颗粒可能为游离的RLO,大而圆形的颗粒可能是吞噬溶酶体内RLO繁殖形成的微克隆。     

大珠母贝人工苗养成的研究

大珠母贝Ｐｉｎｃｔａｄａｍａｘｉｍａ（Ｊａｍｅｓｏｎ)主要分布在热带海区 ,栖息在低潮线至水深１００ｍ或更深处 ,其栖息地多为石砾海底或砂质底 ,全年环境因子 ,如水温、盐度和底质等变化很小［２］。大珠母贝个体大、生长快 ,能生产大型优质珍珠 ,贝壳可做贝雕和药用 ,经济价值高 ,是我国重点开发的珍贵品种。但大珠母贝人工苗在海区养成过程中成活率很低 ,特别是下海２～５个月 ,壳高２～４ｃｍ时大量死亡 ,严重制约大珠母贝养殖业的发展。国内有关单位对此进行了研究 ,但至今对大珠母贝苗在海区养殖大量死亡的原因还不明了。为了在…     

栉孔扇贝大量死亡的流行病学调查研究

2001~2003年,对养殖的栉孔扇贝进行了较系统地流行病学调查研究.以栉孔扇贝养殖集中海区长岛县亚美扇贝养殖场为定点调查和样品采集点.调查内容主要包括栉孔扇贝各养殖期的死亡率和可疑病原生物检测,同时对pH、溶解氧、温度、盐度等环境理化因子进行连续监测.调查结果显示:栉孔扇贝在养殖初期幼贝阶段死亡率较低,随后死亡率逐渐升高,至8月24日月死亡率达最高点71%.9月份以后死亡率开始下降.至10月份累积死亡率达90%以上.对环境理化因子的调查显示,pH、溶解氧、盐度的变化幅度不大,与扇贝死亡率无明显相关性;温度变化与死亡率似有一定的相关性,即高温(月平均23℃以上)可能是养殖栉孔扇贝重要的环境胁迫因子.通过对可疑致病性生物因子的调查研究及病理学观察表明,栉孔扇贝在养殖过程中可感染多种微生物,其中原核微生物类立克次体(RLO)在养殖过程各生长阶段均可检出,其感染率和感染强度与扇贝死亡率呈现一致的趋势.在病原病理检测中,发现RLO的大量感染与组织细胞严重病理损伤密切相关.在病原生物检测过程中,除RLO以外还发现有类枝原体原核生物(MLO)和类病毒(VLP)寄生.RLO的人工感染实验结果说明RLO是栉孔扇贝重要的病原菌.结合感染率和死亡率、感染强度和组织病理学的相关性以及感染实验的结果分析,认为类立克次体(RLO)可能是栉孔扇贝养殖过程中大量死亡的主要致病因子.     

热带海洋珍珠贝类立克次体病研究 Ⅴ.超微病理学及致病机理研究

对海水养殖大珠母贝和合浦珠母贝类立克次体(Rickettsia-like organism,RLO)病(简称RLO病)的超微病理学进行了研究.结果显示细胞及亚细胞结构经历由变性发展到坏死的病变过程,如胞核由核浓缩、核碎裂发展为核溶解;线粒体出现肿胀,嵴和基质改变及内质网脱颗粒、扩张和囊泡变等一系列混浊肿胀和水泡变性的基本特征;最终,细胞器完全溶解消失使胞质疏松,呈崩解或溶解状.结合先前组织细胞病理学和本文超微病理学研究的结果认为,RLO导致宿主细胞变性坏死的机制有:(1)直接损伤细胞的质膜;(2)直接干扰或破坏细胞的正常代谢;(3)对肝胰腺的广泛破坏可能通过破坏血管内皮系统间接造成肝胰腺上皮细胞的血供障碍,进而引起营养和呼吸代谢障碍或(和)与菌体释放的内毒素有关.     

皱肋文蛤胚胎、幼虫及稚贝的发育

在水温28.5～30℃、盐度23.6～25.4 条件下, 观察了皱肋文蛤(Meretrix lyrata)胚胎、幼虫和稚贝的发育过程。结果表明, 皱肋文蛤的胚胎经历桑椹期、囊胚期、原肠胚期等阶段, 形成担轮幼虫。根据行为方式和形态特征, 其幼虫阶段可分为D 形幼虫、壳顶初期幼虫、壳顶中期幼虫、壳顶后期幼虫、变态期幼虫、附着期幼虫。稚贝发育可分为无管期稚贝、单管期稚贝和双管期稚贝。皱肋文蛤幼虫在不同阶段的生活习性逐渐改变, 从担轮幼虫至壳顶后期幼虫营浮游生活, 变态期和附着期幼虫分别营匍匐生活和附着生活。壳顶初期幼虫出现足原基, 壳顶中期和壳顶后期幼虫分别形成平衡囊和鳃丝。稚贝阶段开始从附着生活向埋栖生活过渡。稚贝出现明显的次生壳, 无管期稚贝和单管期稚贝的次生壳为红褐色, 而双管期稚贝的次生壳为白色。皱肋文蛤从D 形幼虫发育到附着期幼虫, 后者的壳长和壳高分别增至前者的1.77 倍和2.10 倍; 稚贝阶段从无管期发育到双管期, 后者的壳长和壳高分别增至前者的3.13 倍和3.28 倍, 显示皱肋文蛤幼虫阶段缓慢生长, 稚贝阶段快速生长的特征。     

两个大珠母贝群体遗传多样性的ISSR分析

用ISSR标记技术对我国两个大珠母贝Pinctada maxima群体的遗传多样性进行分析.7条ISSR引物在两个群体中共得到91个清晰的扩增位点.总多态位点百分率为100%,H= 0.2832, I = 0.4372,总的遗传变异中有21.54%的变异存在于两个群体之间,而78.46%的遗传变异是发生在群体内.海南群体的遗传多样性水平(PPB＝91.21%,I=0.414 4±0.236 4,H=0.271 5±0.179 0)高于广西群体(PPB＝82.42%,I=0.362 1±0.253 4,H=0.235 6±0.1837),广西群体的单态位点数(15个)明显高于海南群体(8个).NJ聚类分析表明两群体各自聚类成一簇.研究结果表明我国大珠母贝的遗传多样性水平较高,两群体间存在较明显的遗传差异     

海湾扇贝养殖过程中的流行病学调查研究

2001~2002年,对莱州湾养殖海湾扇贝进行了较系统地流行病学调查研究.以海湾扇贝养殖集中海区莱州市金城镇扇贝养殖场为定点调查和样品采集点.调查内容主要包括海湾扇贝各养殖期的死亡率和可疑病原生物检测,同时对pH,溶解氧,温度,盐度等理化环境因子进行连续监测.调查结果显示:海湾扇贝在0.5~1.3cm的幼贝阶段死亡率较高,达50%;随后死亡率降低,1.3~2.2cm的幼贝阶段死亡率约为20%,以后各阶段死亡率平稳,均在7%以下,累积死亡率约为60%.对环境理化因子的调查显示,pH,溶解氧、盐度的变化幅度不大,与扇贝死亡率无明显相关性;温度变化与死亡率有一定的相关性,即低温(20℃以下)可能是养殖海湾扇贝幼贝重要的环境胁迫因子,而高温(27℃左右)对海湾扇贝成贝生长无不良影响.通过对可疑致病性生物因子的调查研究及病理学观察表明,海湾扇贝在养殖过程中可感染多种微生物,其中原核微生物类立克次体(RLO)在养殖过程各生长阶段均可检出,即0.5,1.5,3.0,3.6和5.0cm的海湾扇贝RLO的感染率分别为15%,35%,80%,50%和20%;RLO的感染强度分别为1.0,1.5,16.0,11.5和5.0.在病原生物检查过程中,除RLO以外还发现有类支原体原核生物(MLO)寄生.结合感染强度和组织病理学的相关性分析,初步认为类立克次体(RLO)可能是海湾扇贝在海上吊养的幼贝阶段发病死亡的致病因子.     

大珠母贝游离珍珠培育研究

2008~2010年,在广西涠洲岛进行了大珠母贝(Pinctada maxima Jameson)游离珍珠培育实验。实验过程中采用解剖法优选植核核位、几种术前处理方法和低温处理小片贝制备外套膜小片等技术,旨在提高育珠贝留核率、成珠率和优珠率。结果表明,在大珠母贝内脏囊缩足肌左右两侧各有一个适合培育游离珍珠的核位,分别称为左袋和右袋,实际操作中只有左袋可以植入珠核培育游离珍珠;不同术前处理实验组的植核贝休养期成活率差异不显著(P>0.05),但留核率、成珠率显著差异(P<0.05),其中采用传统术前处理和低温处理相结合的综合术前处理方法可有效提高留核率、成珠率平均达78.2%和80.1%;低温处理小片贝与传统方法制备的大珠母贝外套膜小片的育珠效果(成珠率、优珠率、正圆珠比例)存在显著差异(P<0.05),且在实验温度范围内,成珠率、优珠率、正圆珠比例随处理温度的降低而增高,在4~8℃达到最好育珠效果,成珠率、优珠率和正圆珠比例分别达到98%、53%和30%左右;在术后休养期,植核贝吐核高峰出现植核后5~15 d,手术伤口愈合时间为15~20 d,育珠贝的死亡高峰出现在术后的第20~30天。在水温25~30℃条件下,珠核表面形成珍珠层的时间为45 d左右。     

魁蚶母源大防御素在子代发育早期的动态变化

母源免疫因子能够通过卵细胞、母乳等方式转移给子代,在免疫系统发育成熟之前发挥重要的免疫保护作用,但贝类中的相关报道较少。为探索贝类非特异性免疫因子在子代发育早期的表达规律,本研究以魁蚶(Scapharca broughtonii)为研究对象,通过qRT-PCR和ELISA分析了大防御素在魁蚶胚胎及幼虫早期发育过程中mRNA和蛋白质的动态变化特征。结果显示,魁蚶卵子受精后发育至壳顶幼虫期,大防御素mRNA和蛋白质的表达变化趋势基本相同,即从受精卵期开始下降,至囊胚期最低,自担轮幼虫期表达量开始上升;与对照组相比,幼虫发育至担轮幼虫期,鳗弧菌(Vibrio anguillarum)处理组的大防御素升高更为显著,mRNA和蛋白的表达水平都基本高于对照组,说明鳗弧菌刺激能够上调担轮幼虫期后魁蚶幼体体内大防御素的表达量。总的来说,研究结果表明魁蚶母源性大防御素能够通过卵子传递给后代,从卵细胞受精后开始被消耗,当幼虫发育至担轮幼虫可能开始自身合成。     

象拔蚌人工育苗技术研究

通过对亲贝促熟、人工催产、幼虫培育和采苗等技术环节的研究,建立了象拔蚌(Panopea gen-erosa)的人工繁育技术。研究表明,在盐度28~30条件下,受精卵在水温11、13、16oC时发育至D形幼虫所需时间分别为83、60和46 h;在水温16~18oC,经20 d发育至壳长约380μm的壳顶幼虫时出现足和水管原基,进入附着变态阶段。投放附着基后培育约70 d,可生长至壳长5 mm的幼贝。壳长日增长量在D形幼虫阶段为6.2μm,在壳顶幼虫阶段为16.8μm,附着变态后生长速度加快,外形具成体形态。不同附着基的采苗率依次为：细砂>卵石>聚乙烯网片>波纹板。     

大珠母贝Pinctada maxima(Jameson)亲贝人工促熟培育与诱导排放精卵的研究

用亚心形扁藻Platymonassubcoriformis,湛江等鞭藻Isochrysiszhanjiangensis及某些配合饲料培育大珠母贝pinctadamaxima(Jameson)亲贝,可以促进性腺发育成熟并保持易于诱导排放状态。在需要进行人工育苗时,给亲贝以一定的刺激,即可诱导产卵排精。采用这种方法进行大珠母贝人工育苗,受精率和活率都比剖贝取卵授精的方法高。而且不用杀死大珠母贝亲贝。     

水产饲料添加剂--多糖肽对珍珠贝生长的影响

利用光度法测定法分别测定了水产饲料添加剂多糖肽(简称多糖肽)的氨基酸、多糖和维生素的含量;利用平行对照试验法,观察了多糖肽对珍珠贝生长发育的影响。实验结果表明,多糖肽的氨基酸、多糖和维生素含量分别为40％～48％,12％～19％和9％～10％;多糖肤具有显著促进合浦珠母贝(Pinctada functa Gould)后期幼虫、幼龄贝和大珠母贝(Pinctada maxima Jameson )幼龄贝生长发育的作用、同时能够提高大珠母贝幼龄贝的存活率。     

大珠母贝Pinctada maxima（Jameson）亲贝人工促熟培养与诱导排放精？…

用亚心形扁藻Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ ｓｕｂｃｏｒｄｉｆｏｒｍｉｓ,湛江等鞭藻Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｚｈａｎｊｉａｎｇｅｎｓｉｓ及某些配合饲料培育大珠母贝ｐｉｎｃｔａｄａ ｍａｘｉｍａ（Ｊａｍｅｓｏｎ）亲贝,可以促进性尕发育成熟并保持易于诱导排放状态。在需要进行人工育苗时,给亲贝以一定的刺激,即可诱导产卵精。彩这种方法进行大珠母贝人工育苗,受精率和成活率都比剖贝取卵授精的方法高。而且不用杀死大珠母贝亲     

大珠母贝游离有核养殖珍珠研究取得重要成果并通过鉴定

利用大珠母贝(Pinctada maxima J.)培育大型珍珠,是当今国内外研究的重要课题之一。 中国科学院南海海洋研究所和海南行政区水产研究所经过八年的协力合作,在大珠母贝的生物学、游离有核养殖珍珠、人工苗培育、病虫害防治以及新型珠核等几方面都取得重要阶段成果。如在游离有核养殖珍珠的试验研究中,由于解决了插核前期处理和     

合浦珠母贝、长耳珠母贝和大珠母贝种间人工杂交的研究——Ⅲ.同工酶谱的比较研究

为了进一步从分子水平验证前文所述的形态学和细胞学的观察结果,并了解杂交后代基因表达的调控机理,我们进行了同工酶谱的比较研究。 一、材料和方法 1.实验材料 合浦珠母贝、长耳珠母贝和大珠母贝是野生贝。大珠母贝采自海南岛西部海域,其他二种采自广西合浦海区。杂交贝(图1:2,4,6)是1976—1980年间在徐闻珍珠场用人工杂交授精方法育成。活贝运回实验室后,置-30℃低温冰箱内贮存备用。     

热带海洋珍珠贝类立克次体病研究——大珠母贝病原类立克次体 …

于１９９３年１１月和１９９４年１１月在海南省临高县新盈珍珠贝养殖场采集患病或濒死的大珠母贝幼母,采用组织切片和扫描电镜技术对其原类立克次体的包涵体进行组织学和超微结构研究,以期找出ＲＬＯ包涵体在宿主细胞内形态发生的内在规律。结果表明,ＲＬＯ包涵体寄主在宿主多处内脏组织,但ＲＬＯ具有明显的嗜细胞特异性,感染的靶细胞为上皮（或表皮）、结缔组织和血管内皮细胞,包涵体存在不同的发育时期,可分为颗粒前期和颗