金钱鱼肾细胞系的建立及生长特性研究

金钱鱼(Scatophagus argus)是一种重要的广盐性海水养殖鱼类,可直接在海水、淡水、咸淡水等不同环境中正常生长。为研究金钱鱼独特的渗透调节机制,本文研究了金钱鱼肾细胞的原代和传代条件及其生长特性,结果表明:原代肾细胞在含有20%胎牛血清(FBS)的L-15培养基里贴壁和生长较好,添加10ng/mL的碱性成纤维细胞因子(basic fibroblast growth factor)bFGF能明显促进细胞增殖,传代细胞采用含有10%胎牛血清的L-15培养基,细胞生长迅速,3—4d即可传代。金钱鱼肾细胞为成纤维样细胞,命名为SK细胞,目前已传至22代。扩增第11代SK细胞的细胞色素氧化酶I(COI)基因,比对结果证明此细胞系来源于金钱鱼。采用CCK-8法检测第12代细胞在低渗(95,137,200mmol/kg),等渗(330mmol/kg)和高渗(430,550mmol/kg)中的增殖情况,结果发现肾细胞在137—430mm/kg的渗透压范围内均可增殖,说明金钱鱼肾细胞对渗透压的耐受性较强。本试验首次建立了金钱鱼肾细胞系,并初步证明了肾细胞对盐度有较强的耐受性,为今后渗透压调节的深入研究奠定了基础。     

广盐性鱼类渗透压适应性与生理可塑性机制研究

拥有强大的渗透压调节能力对广盐性鱼类的生存至关重要。目前,关于鱼类渗透压调节机制已有不少研究,但均存在较大的局限性。本文从广盐性鱼类渗透压信号转导机制、渗透胁迫的细胞调控机制、渗透调控的内分泌调节机制和无机离子通道和转运蛋白介导的渗透调控等方面对广盐性鱼类的渗透压适应性和生理可塑性机制进行分析,以期从分子、细胞、通路和生理等层次初步探索广盐性鱼类盐度胁迫后的可塑性表型变化和不同盐度条件下的应答机制,为广盐性鱼类的渗透压调节机制的深入研究奠定基础。对广盐性鱼类渗透压适应性与生理可塑性机制研究,有助于研究其环境适应机理,促进野生鱼种的人工化养殖以及新品种的育种从而提高经济效益、社会效益和生态效益,对促进水产养殖学进步以及养殖业的发展具有重要意义,同时,为研究广盐性鱼类的渗透压调节机制开辟新的研究方向。     

急性盐度胁迫对卵形鲳鲹幼鱼Na~+-K~+-ATP酶活性和渗透压的影响

研究了水环境急性盐度胁迫对卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)幼鱼鳃Na+-K+-ATP(NKA)酶活力,血清、鳃丝和肾脏渗透压的影响.结果表明:将幼鱼从盐度30(对照)中直接转移至盐度5、10、15、20、25、35水体中,96 h后无死亡.各盐度处理组的鳃NKA酶活性和血清渗透压在最初72 h内出现一定波动,随后变化平稳.试验结束时(96 h),NKA活性随盐度梯度呈"U"型分布,盐度35处理的酶活高于其他处理,盐度20处理活性最低.各处理的血清渗透压大小在96 h时,随着盐度的变化,以盐度15、20为中心,呈对称变化,在盐度20后随盐度上升呈先上升后下降的趋势.相同盐度的鳃渗透压随时间变化呈先上升后下降逐渐稳定的趋势.肾渗透压除盐度5、10处理外,其他盐度组随时间没有显著变化,维持一定的稳定性.说明卵形鲳鲹幼鱼在生理上具有广盐性鱼类的"高渗环境高NKA活性"特征,有较强的渗透压调节与平衡能力.     

近江牡蛎鳃细胞的原代培养

采用改良的DMEM(HG)培养基,建立了近江牡蛎(Crassostrea hongkongensis)鳃细胞体外培养技术,包括鳃组织块培养法和胰酶消化培养法。结果表明,组织块培养法接种6 h后,细胞开始从组织块中迁出,细胞形态较小,呈圆形、椭圆形或多边形,直径3～6μm。培养至3 d时,细胞在组织块周围形成生长晕。培养至6 d时可进行细胞传代,本次实验细胞已传至第6代。胰酶消化法接种约2 h后,细胞逐渐贴壁,从形态上主要分为两类,一类为小型细胞,形态为圆形、椭圆形或多边形,直径3～6μm,数量多,增殖速度较快;另一类为大型细胞,形态为圆形、椭圆形或多边形,直径10～20μm,部分细胞内部含有颗粒,数量较少,增殖速度较慢。培养至2 d时可进行细胞传代,传代培养物中的优势细胞皆为小型细胞。本次实验细胞已传至第6代。     

海水和淡水适应过程中广盐性鱼类鳃氯细胞的形态与功能变化及其激素调节

广盐性硬骨鱼能够在盐度变化很大的环境中生存。淡水渗透压约为０．１×１０-３渗ｍｏｌ／ｋｇ,海水的渗透压约为１０００×１０ -３渗ｍｏｌ／ｋｇ［７］,而硬骨鱼体内的渗透压为２５０×１０-３～５００×１０-３渗ｍｏｌ／ｋｇ，因此 ,在高渗环境下 ,鱼会丢失水分 ,而当通过肠道大量吸收水分的同时又会有许多盐分随之进入体内 ,此外 ,高渗环境中各种离子也会通过鳃和皮肤被动地扩散到体内。鱼体内过多的盐分会被鳃等渗透调节器官排出体外 ,从而达到水和离子的平衡。相反 ,在低渗环境中 ,鱼会丢失盐分 ,同时又有水分扩散到体内 ,此时除了…     

大连湾牡蛎的组织培养

用MEM培养基对大连湾牡蛎的血细胞，鳃和外套膜者了组织培养，共培养了7批，血细胞培养20min后即开始贴壁，2h后细胞呈分枝状和圆形，鳃细胞呈圆形，生长旺盛，易获得传代细胞，其中有三株分别传至第7，第10和第11代，外套膜细胞圆形，细胞较大，生长速率慢，传代周期长，有5株传至第4代，并比较了3种组织在不同浓度NaCl的培养基中的生长情况。     

盐度变化对黑鲷生长激素及其受体的影响

将海水鱼类黑鲷Sparusmacrocephalus从盐度为26.6的海水直接转入淡水,考察渗透压的急剧降低对黑鲷的生长激素(growthhormone,GH)及其受体(growthhormonereceptor,GHR)等生理指标的影响。研究发现:(1)黑鲷从海水直接转入淡水后48h有33%的鱼死亡,对照组无死亡现象;(2)黑鲷在转入淡水48h内其血清生长激素(GH)含量、肝脏及鳃中GHR及GHRmRNA含量与对照组均无显著差异;(3)黑鲷在转入淡水48h后其肾脏中GHR含量较对照组显著升高(p<0.05),肾脏中GHRmRNA含量在24h及48h显著高于对照组(p<0.05)。结果表明,从GH含量看,黑鲷从海水环境到淡水低渗环境与鲑鳟鱼类从淡水到海水环境的适应性调节机制有差异,而黑鲷肾脏中GHR的含量变化可能参与黑鲷对外界环境渗透压的这种急剧降低的适应性调节。     

不同盐度下鲈鱼稚鱼鳃的显微结构观察

采用石蜡切片和显微摄影技术,研究了不同盐度下鲈鱼(Lateolabrax japonicus)稚鱼鳃的显微结构.结果显示,在15.00盐度组,稚鱼鳃的鳃丝和鳃小片上泌氯细胞数量较多,泌氯细胞集中分布在鳃小片基部,且黏液细胞较多.与15.00盐度组和淡水组相比,7.50盐度组稚鱼鳃的鳃小片较窄,泌氯细胞的分布、结构及数量变化均不明显.在0.00盐度组,稚鱼鳃中鳃小片较宽,排列紧密,泌氯细胞数量较少,且主要分布在近鳃小片基部.鲈鱼稚鱼鳃的结构能够适应外界水体盐度的变化,其中泌氯细胞的结构和数量变化是与鲈鱼稚鱼所处的环境相适应的.     

温度和手术对扁额原细首纽虫渗透压调节的影响

研究3个温度下(5℃、15℃、25℃),扁额原细首纽虫在外界渗透压变化时体内渗透压的的变化以及手术(切头和中切)对其渗透压调节能力的影响。结果显示,温度对扁额原细首纽虫的渗透压调节具有较大影响。在25℃、96 h内,当纽虫处于低渗环境(盐度10和20)时,其体内渗透压先降后升,当其处于高渗环境(盐度40)时,其体内渗透压先升后降,表现为1个渗透压调节者。在15℃和5℃,纽虫的体内渗透压基本上是随着环境的渗透压变化而变化,表现为1个渗透压随变者。手术对扁额原细首纽虫的渗透压调节能力具有明显的影响。去头纽虫丧失了调节渗透压的能力,其体内渗透压随着环境渗透压变化而变化。当纽虫被中切为两段时,具有头部的身体前部能像完整纽虫一样调节其体内渗透压,而身体后段的渗透压随环境的渗透压变化而变化,没有明显的调节能力。结果显示头部器官(脑神经节)对这种纽虫维持渗透压调节能力是必要的,该纽虫可能通过神经内分泌来调控其渗透压调节。     

高浓度钙离子胁迫对褐牙鲆幼鱼鳃黏液细胞数量、超微结构及分泌方式的影响

利用光学显微镜和透射电子显微镜,研究了高浓度钙离子(37.5±0.1)mmol/L胁迫对褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)幼鱼鳃黏液细胞数量、超微结构及分泌方式的影响。结果表明,高浓度钙离子组实验鱼鳃弓黏液细胞的数量与对照组无显著差异(P0.05);高浓度钙离子组和对照组实验鱼鳃丝黏液细胞的超微结构相同,未成熟黏液细胞呈棒状,具发达的高尔基体和粗面内质网,细胞核近圆形,位于细胞底部,细胞顶膜在鳃上皮组织表面凹陷形成分泌腔,成熟黏液细胞体积较大,呈圆形,黏液颗粒排列紧密,充满整个细胞,基质密度大,细胞器位于细胞底部,细胞核形状不规则;高浓度钙离子组和对照组实验鱼鳃丝黏液细胞的分泌方式相同,均为顶浆分泌,但高浓度钙离子组实验鱼黏液细胞分泌活动旺盛,大量黏液正在向胞外排放,而对照组黏液细胞的黏液分泌量较少。研究认为,褐牙鲆幼鱼对高浓度钙离子胁迫具有较强的耐受能力。     

Development and characterization of a cell line from the embryos of half smooth tongue sole (Cynoglossus semilaevis)

A new cell line,CSEC,has been successfully established from embryos at gastrula stage of a cultured marine fish,half smooth tongue sole(Cynoglossus semilaevis).CSEC cells grow actively and stably more than 50 passages for over 200 d in DMEM medium supplemented with 15% FBS(fetal bovine serum),2.5 ng/cm 3 bFGF(basic fibroblast growth factor),1 ng/cm 3 LIF(leukemia inhibitory factor) and 50 mmol/dm 3 2-ME(2-mecaptoethanol).The cells grew well in the temperature range of 24-30 ℃ and the optimal growth temperature was 24℃.FBS and bFGF concentrations are the two key components for CSEC cells proliferation.Chromosome analysis reveals that CSEC cells have a normal diploid karyotype with 2n=42t.The significant fluorescent signals were observed in CSEC after transfection with the GFP reporter gene,suggesting that the CSEC cell line can be used as a useful tool for transgenic and genetic manipulation studies.CSEC cells showed the cytopathic effect(CPE) after infection with lymphosystis disease virus(LCDV) in 2 d.Moreover,the LCDV particles can be observed in the cytoplasm of virus-infected cells by electron microscopy.It suggests that CSEC could be potentially used for the study of aquatic virus.     

褐菖鲉仔、稚鱼消化系统发育的组织学观察

为探究卵胎生鱼类褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)的仔、稚鱼消化系统组织学特点, 采用常规组织切片技术, 并用HE染色和组织化学染色, 比较分析了产出后0~50d的褐菖鲉仔、稚鱼消化系统发育的组织学变化。结果显示: 褐菖鲉初产仔鱼已分化出口咽腔, 并具有初始的食道、胃、肠、肝脏和胰脏; 2日仔鱼肛门与外界相通, 食道扩大, 开始摄食, 进入混合性营养期; 3~4日仔鱼幽门盲囊出现, 食道内壁出现黏膜皱褶5~6个, 胃黏膜皱褶5个, 肝细胞团区域扩大; 5~6日仔鱼卵黄囊和油球耗尽, 进入外源性营养期, 食道黏膜上皮出现杯状细胞, 肠道弯曲, 可区分前中肠和后肠两部分; 10~14日仔鱼食道环肌层明显, 黏膜皱褶增加到7~12个, 胃壁四层结构基本形成, 肠道黏膜皱褶加深, 纹状缘清晰可见, 肝细胞分裂迅速, 数量显著增加, 体积增大, 出现肝血窦和胰岛; 28~30日稚鱼出现胃腺和胃小凹, 已具功能性胃, 标志着稚鱼期的开始, 此时胰岛细胞数量和酶原颗粒增多, 消化能力显著提高; 47~50日稚鱼已基本具有成鱼胃的特征, 肠道纹状缘发达, 肝细胞呈多边形, 细胞内含大量脂肪颗粒, 消化系统从结构和功能上已趋于完善。由此可见, 褐菖鲉仔鱼和稚鱼消化系统的发育具有卵胎生鱼类发育较早的特点, 与其消化功能的完善密切相关。     

红海榄肉桂酸-4-羟基化酶基因的克隆与表达分析

肉桂酸-4-羟基化酶是木质素合成反应中的关键酶, 木质素合成反应对于植物耐受重金属胁迫有重要作用。本研究利用同源克隆和cDNA末端快速扩增方法(rapid amplification of cDNA ends, RACE)从红海榄叶片中克隆得到一条肉桂酸-4-羟基化酶基因, 命名为RsC4H, 生物信息学分析结果显示RsC4H基因的cDNA全长为2006bp, 开放阅读框长1572bp, 共编码523个氨基酸。该基因编码蛋白的相对分子质量为60.18kD, 是亲水性的不稳定蛋白, 二级结构以α螺旋(47.42%)和无规则卷曲(32.70%)为主, 该蛋白在N端和C端分别包含一个跨膜结构, 不含有信号肽, 主要在膜结构或内质网上发挥功能, 属于p450超家族。RsC4H蛋白与其他植物的C4H蛋白相似性较高, 系统发育树结果显示其与笋瓜(Cucurbita maxima, XP_023007159.1)、南瓜(Cucurbita moschata, XP_022947682.1)的亲缘关系更近。qRT-PCR结果显示, 红海榄能快速响应重金属胁迫, 提高RsC4H基因的表达量, 促进木质素生成并增加细胞壁厚度以阻止金属离子进入细胞。此研究结果丰富了红树植物抗重金属胁迫基因库, 为从分子水平揭示红海榄耐受重金属胁迫机制提供了基础资料。     

盐度对广盐型聚球藻K1生长及转录组的影响*

聚球藻是一类分布广泛、数量巨大的微微型浮游植物, 作为蓝藻的代表类群之一, 广泛分布于海洋以及河口区域, 并且具有丰富的色素多样性和遗传多样性。聚球藻根据盐度适应能力可划分为严格海洋型聚球藻和广盐型聚球藻。文章对分离自珠江口的聚球藻K1和南海寡营养海域的聚球藻YX02-1在不同盐度条件下的生长状况进行对比, 并根据ropC1标记基因分析K1和YX02-1的分类地位, 发现K1为广盐型聚球藻, 其在不同盐度下(10‰、13‰、18‰、25‰、33‰)均能生长; 而YX02-1为严格海洋型聚球藻, 在低于13‰的盐度下无法存活, 与其在河口的分布特征相一致。转录组分析显示, 低盐条件下广盐型聚球藻中合成渗透压调节分子的基因(ggpS、SPS、stpA)表达量明显下调, 而膜通道蛋白glzT基因的表达显著上调, 说明广盐型聚球藻耐低盐机制主要是通过减少细胞内渗透压相关小分子合成和增加膜通道蛋白, 提高小分子物质外排来达到细胞内外渗透压平衡。此外, 盐度也会影响广盐型聚球藻的光合作用和代谢水平, 其中参与光合作用的产能基因(ATPF0B、ATPF0A、ATPF1D、ATPF1A)和色素蛋白基因(cpcA、cpcB)表达量在低盐条件下均显著下降, 同时无机氮利用相关基因表达上调。低盐条件下, 渗透压相关小分子的需求减少, 可以使更多的碳源用于支持生长, 同时无机氮的吸收增强, 这两者可能是低盐条件下广盐型聚球藻具有较高生长的原因。     

中国南海软珊瑚附生真菌Acremonium sp. SCSIO41216的次级代谢产物研究

采用硅胶柱层析色谱法、中压正相柱层析色谱法、中压反相柱层析色谱法以及半制备高效液相色谱法对中国南海软珊瑚来源真菌Acremonium sp. SCSIO41216的大米发酵产物进行分离纯化, 并使用核磁共振、质谱等波谱学方法, 结合其理化性质及文献数据鉴定了7个单体化合物结构: fischexanthone(1)、sydowinin A (2)、(22E)-5α,8α-epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol (3)、16-O-去乙酰基夫西地酸内酯(4)、环-(S)-脯氨酸-(R)-亮氨酸(5)、环-(S)-脯氨酸-8-羟基-(R)-异亮氨酸(6)和环(L)-脯氨酸-(L)-苯丙氨酸(7)。化合物1—7均首次从海洋软珊瑚来源的枝顶孢属真菌(Acremonium sp.)中分离获得。     

牙鲆(Paralichthys olivaceus)红细胞单克隆抗体与五种养殖鱼类血细胞的交叉反应

以牙鲆血细胞为抗原免疫Balb／c小鼠，选用聚乙二醇(PEG)作为细胞融合剂，将免疫的小鼠脾细胞与P3 X63 Ag8U1骨髓瘤细胞融合，筛选、克隆出3株生产抗牙鲆红细胞单克隆抗体(Mabs)的杂交瘤细胞(1C7、286、3A1)。应用免疫荧光抗体法(IFAT)研究3株单抗与5种常见养殖鱼类(大菱鲆、花鲈、真鲷、许氏平鲉、鲫鱼)红细胞的交叉反应，结果显示，3株单抗与5种鱼类红细胞有不同程度的阳性反应；应用Western blotting法分析单抗识别的蛋白分子量，结果显示，单抗1C7与大菱鲆血细胞结合的蛋白分子量为52kD、47kD、45kD、32kD、29kD、27kD，与花鲈、许氏平 结合的蛋白分子量是52kD、29kD，与真鲷结合的为29kD，与鲫鱼结合的为44kD、29kD、28kD；单抗286与大菱鲆、花鲈血细胞结合的蛋白带分子量是30kD、28kD，与真鲷结合的为30kD，与许氏平 结合的为29kD、28kD；单抗3A1没有Western blotting反应。结果表明，这6种鱼红细胞存在相同或相似的抗原决定簇，蛋白成分具有相似性。     

Effect of cortisol and urea on flavin monooxygenase activity and expression in rainbow trout,Oncorhynchus mykiss

Expression of flavin-containing monooxygenase(s) (FMO) correlates with salinity exposure in certain species of euryhaline fish, such as the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. The mechanism(s) by which salinity regulates FMO is unclear. Adult rainbow trout were infused through the dorsal aorta with either cortisol or urea. At 500 ng/ml, cortisol caused a significant increase in FMO-catalyzed thiourea oxidase activity in gill and liver microsomes. FMOI expression, however, was significantly increased by the high cortisol dose only in gill microsomes. The levels of TMAO and urea were not altered by cortisol. In the liver, urea infusion caused an increase in hepatic FMO activity. FMO expression and activity correlated with elevated tissue urea levels, but TMAO concentrations were not related. These results indicate that FMO expression and activity may be partially controlled by the osmoregulatory/stress hormone. cortisol, and concentrations of the organic osmolyte, urea, in the rainbow trout.     

锦鲤组织细胞体外培养的初步研究

为建立来源于锦鲤的细胞系,本文采用组织块法,对来源于锦鲤(Cyprinus carpio)鳍条、吻端、肌肉、心脏、鳔、肠道、卵巢等组织的细胞进行原代培养和传代培养.在25℃下,添加20％胎牛血清、0.2μg/mL表皮生长因子(EGF)和25ng/mL成纤维生长因子(FGF)的L-15培养基中进行培养.结果显示,鳍条、心脏、鳔、吻端、肌肉、肠道、卵巢分别在原代培养第3、6、12、13、15、3、3天,有细胞从组织块迁出;对长至单层的鳍条、心脏、肌肉细胞进行传代培养,鳍条细胞已传至第39代,心脏和肌肉细胞分别传到第2代和第4代;鳍条、心脏和肌肉细胞分别呈现上皮细胞样、上皮细胞样和上皮细胞样与成纤维状混合型.第6代锦鲤鳍细胞的染色体计数,结果显示,细胞染色体数目分布范围为55～154条,2n=100.病毒敏感性实验,发现锦鲤鳍条细胞对草鱼出血病病毒(GCRV)和鲤春病毒血症病毒(SVCV)都敏感,且在24h内出现细胞病变(CPE);但对斑点叉尾鮰病毒(CCV)不敏感.锦鲤鳍条细胞系的建立为后期建立更多的锦鲤细胞系和鱼类病毒研究奠定了基础.