非可培养状态哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)复苏后生理特征及毒力相关基因表达

将哈维氏弧菌SF1接种在自然海水中低温诱导进入活的非可培养状态,用添加营养物质后升温培养的方法进行复苏。用透射电镜观察不同状态哈维氏弧菌细胞形态和结构,研究哈维氏弧菌复苏后对不良环境的抵抗力,用RT-PCR检测丝氨酸蛋白酶基因Ser和rpoS基因的表达。结果表明,进入VBNC状态的哈维氏弧菌由杆状变为球状,体积比正常细胞小,复苏后恢复正常形态且对紫外辐射,热激的抵抗能力没有明显改变,对高渗透压的抵抗力减弱,而对冷激的抵抗力增强。复苏后的哈维氏弧菌对抗生素的敏感性没有改变。用RT-PCR未检测到在VBNC状态时Ser和rpoS基因的表达,而在复苏后的细胞均检测到该基因的表达,可能是其保持致病性的重要原因之一。     

副溶血弧菌一种糖蛋白酶(复苏促进因子)在大肠杆菌中的表达及性质

用PCR方法从副溶血弧菌8621.4基因组中扩增出1种细胞复苏促进因子家族的糖蛋白酶(Glycoprotease,Gcp)基因,核酸序列分析表明其含有完整的gcp基因开放阅读框,编码233个氨基酸组成的蛋白质.核酸序列与副溶血弧菌糖蛋白酶家族基因的序列相似性为100％.其氨基酸序列与哈维氏弧菌HY01、弧菌Ex25、溶珊瑚弧菌、拟态弧菌和杀鲑弧菌LFI1238等糖蛋白酶的序列相似性为67％～92％.将该基因克隆到表达载体pET28a,在大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达,用Ni琼脂糖亲和柱层析纯化的蛋白为单一条带,利用纯化的Gcp免疫新西兰大白兔制备特异性抗体,Western-Blotting分析发现正常生长及活的非可培养状态(VBNC)诱导过程中的副溶血弧菌细胞内表达的Gcp蛋白为1条带,分子量约为27 kDa,而在VBNC状态的菌体中检测到2条蛋白带.研究结果为进一步探索海洋弧菌活VBNC的形成和复苏机制奠定基础.     

日本对虾(Penaeus japonicus)病原需钠弧菌(Vibrio natriegens)表型与分子特征及LAMP检测方法的建立

采用常规表观生物学特性及16S rRNA、gyrB及rpoA基因同源性检索与系统发育学分析等方法,对分离自江苏连云港某育苗场的大批死亡日本对虾蚤状幼体的优势生长菌进行了综合鉴定。结果表明,其形态和生理生化特征与弧菌属的需钠弧菌相近;16S rRNA、gyrB及rpoA基因同源性检索也均与需钠弧菌相似性最高,分别为98%、89%和95%,且三种基因的NJ系统发育树也均与需钠弧菌聚为一个分支;分离菌的致病性试验表明其半数致死量LD50为1.8×106CFU/ml。综合分离菌的致病性、形态与生理生化特征及基因同源性与系统发育分析结果,认为引起日本对虾蚤状幼体大批死亡的病原为需钠弧菌。基于gyrB基因序列设计1套LAMP特异性引物,建立了需钠弧菌的快速特异性检测方法,可用于由需钠弧菌引起的水产动物疾病的诊断及分子流行病学的调查研究。     

4株长牡蛎(Crassostrea gigas)致病性哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)鉴定及其毒力基因检测

为明确江苏连云港养殖长牡蛎大规模死亡病因,对分离自长牡蛎的4株病原菌开展了致病性、表型特征、分子特征等研究,结果表明4株病原菌均具致病性,4株病原菌ML1、ML2、ML3、ML4对长牡蛎的半数致死量LD50分别为2.8×105、1.1×105、1.8×105和1.6×105 CFU/mL;4株病原菌均为呈短杆状革兰氏阴性细菌,氧化酶阳性,还原硝酸盐,能利用甘露醇、纤维二糖,形态及理化特性结果表明4株分离菌与弧菌属的哈维氏弧菌亲缘关系最近;16SrRNA、gyrB、rpoA基因同源性检索及系统发育学分析结果表明4株分离菌与GenBank数据库中哈维氏弧菌的基因序列相似性最高且在系统发育树中聚为1个分支;根据4株分离菌的致病性、表型与分子特征,表明引起长牡蛎大规模死亡的病原为哈维氏弧菌。为进一步明确分离菌株毒力基因的携带情况,检测了分离鉴定的4株病原菌的9种毒力基因,结果表明,4株病原菌均可检测到luxR、toxR、vhhA和vhhB 4种毒力基因,扩增片段大小分别为679bp、390bp、1324bp和216bp,其他5种毒力基因未检测到,且分离鉴定的4株病原哈维氏弧菌携带相同的毒力基因,这些毒力基因可作为检测致病性哈维氏弧菌的分子标记。     

用16S rRNA基因的内切酶图谱快速鉴别几种对虾病原菌

坎普氏弧菌是青岛海洋大学生物系微生物实验室于１９８９－１９９０年自对虾养殖场中国对虾红腿病心脏及血淋巴中分离并鉴定的菌株，副溶血菌和溶藻胶弧菌两菌株于１９９４年９月得自中国科学院微生物研究所，为建立快速、准确的中国对虾病原菌的诊断技术，根据几种细菌的１６ＳｒＲＮＡ基因的序列，设计并合成该基因的多聚酶反应的引物ＰＬ１和ＰＬ２。并用该对引物分别从坎普氏弧菌、副溶血弧菌和溶藻胶弧菌的ＤＮＡ要品中扩增出分     

应用LAMP-LFD技术可视化检测河流弧菌(Vibrio fluvialis)的研究

以河流弧菌(Vibrio fluvialis)为检测对象,将环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)与横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)联合应用,建立了快速便捷的LAMP-LFD方法。该方法以河流弧菌的外膜蛋白omp U基因作为检测靶标,在其保守区域设计6条特异性引物(上游内引物由生物素标记),并在两条外引物的有效扩增区段内设计1条特异性探针,由异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记。使用引物进行有生物素标记的LAMP反应,产物与FITC标记的探针完成杂交,杂交产物在LFD上进行结果展示。结果表明,LAMP-LFD方法可特异性地检出河流弧菌,对近似物种如创伤弧菌等弧菌病原以及迟缓爱德华菌等其他水产养殖病原的检测均呈阴性。经优化,LAMP的反应条件为63°C反应25min,加上5min的探针杂交和3—5min的LFD显色,整个检测时程约35min。利用该方法最低可检测到1.0×10~2 CFU/m L的河流弧菌纯培养物,能够从污染强度为5.0×10~2 CFU/m L的组织样品中检测到该病原。该方法设备依赖性更低,仅需简单的恒温加热设备即可完成。因此,本研究建立的河流弧菌LAMP-LFD方法,具有操作便捷,设备依赖性低、灵敏度高和检测快速等优点,在河流弧菌的基层检测中具有良好的应用前景。     

一株副溶血弧菌D3112致病性和抗药性的表征

副溶血弧菌广泛分布于海洋环境中,虽然大多数环境菌株并非致病菌,但它们常常携有毒力基因,从而具有潜在的致病性。本文从黄海(山东青岛)海水中分离到一株副溶血弧菌D3112,对其进行了全基因组测序、溶血实验和人工感染实验等。基因组测序分析发现D3112并不含有副溶血弧菌的致病性标志溶血素基因tdh和trh,这与PCR检测结果一致,但含有其他溶血素基因以及多种毒力相关基因。生物学实验显示,该菌可产生明显的溶血现象,而且具有蛋白酶、明胶酶、脂酶和淀粉酶活性,但是缺少卵磷脂酶活性。人工感染实验表明副溶血弧菌D3112具有致病性,感染斑马鱼的半致死剂量约为5×105CFU。药物敏感实验证明了D3112具有多重耐药性。本文对海洋环境中的副溶血弧菌D3112同时开展了基因型和表型研究,为准确评价环境细菌的潜在致病性提供了有用的数据信息。     

刺参肠道与养殖池塘环境中异养细菌和弧菌数量周年变化

2008年9月~2009年10月,对刺参肠道与养殖环境中异养细菌和弧菌周年变化进行了初步研究。结果表明:刺参肠道与养殖环境中(水体、底泥、附着基)异养细菌数(HPC)、弧菌数(VBC)均呈现出明显的季节变化,肠道中HPC、VBC分别为1.85×105~2.17×109CFU/g、4.1×104~2.2×108CFU/g,水体中HPC、VBC分别为90~4.67×105CFU/mL、0~5.3×103CFU/mL,底泥中HPC、VBC分别为9.80×104~6.72×106CFU/g、1.01×104~5.75×105CFU/g,附着基中HPC、VBC分别为2.78×105~2.57×107CFU/g、4.6×104~1.31×107CFU/g,夏、秋两季细菌总数较高,冬、春低温季节细菌数量显著下降。通过VBC与HPC的比值可以看出,在冬、春季细菌总数较低的季节,弧菌与异养细菌数量比例较高,最高值达到:43.8%、43.2%,通过对优势菌的分离鉴定,冬、春两季灿烂弧菌(Vibrio splendidus)均占优势,这可能是造成冬、春两季刺参发病的诱因之一。本文通过研究刺参肠道与养殖环境中异养细菌和弧菌的变化规律,以期为刺参的健康养殖提供有益参考。     

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)源美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)的分离鉴定及致病性研究

于2010年从宁德患病大黄鱼中分离得到一株优势菌NPL1006,经鉴定该菌株为美人鱼发光杆菌。人工感染实验结果显示该菌对大黄鱼的半致死浓度(LD50)为7.96×103CFU/g体重。药敏性实验结果显示NPL1006对头孢唑啉、头孢噻吩和诺氟沙星等9种药物高度敏感。采用纸片法检测得到NPL1006的胞外产物具有蛋白酶、明胶酶和淀粉酶活性。胞外产物感染斑马鱼研究结果显示其LD50为1.20mg蛋白/kg体重。以上结果表明大黄鱼源美人鱼发光杆菌NPL1006胞外产物含有多种毒力因子,与该菌对大黄鱼的致病性密切相关。     

中国对虾成虾肠道微生物区系

对野生健康中国对虾成虾肠道微生物区系进行了研究.从其肠道中分离出47株菌,它们分别属于弧菌属、发光杆菌属、不动杆菌属、假单胞菌属、黄杆菌属、气单胞菌属、屈挠杆菌属和色杆菌属8个属.其中弧菌属和发光杆菌属在整个肠道中为优势菌属,不动杆菌属和假单胞菌属为次优势菌属,黄杆菌属、气单胞菌属、屈挠杆菌属和色杆菌属为非优势菌属.在对虾的整个肠道中,前肠和中肠的优势菌属为弧菌属,而后肠的优势菌属为发光杆菌属.在弧菌属中溶藻胶弧菌、漂浮弧菌和坎贝氏弧菌为优势菌,哈唯氏弧菌为非优势菌.前肠、中肠和后肠的菌量分别为1.3×105、2.8×105和1.1×104cfu/虾体.     

弗尼斯弧菌PCR检测方法的建立及应用

弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)是近年来国内外学者公认的新食源性致病菌,对全球公共卫生和食品安全造成潜在威胁。本研究根据弗尼斯弧菌的toxS基因分别设计了普通PCR引物和实时荧光PCR引物、探针,建立了用于弗尼斯弧菌快速检测的普通PCR方法和实时荧光PCR方法,对这2种方法的特异性和灵敏度进行比较分析。研究表明,建立的普通PCR方法和实时荧光PCR方法特异性良好,检测灵敏度分别为2 400和24CFU/mL,2种方法的检测灵敏度分别是传统培养方法的10和1 000倍,同时对384份水产品和食品样品进行检测,共检出6株阳性菌株。本研究建立的基于弗尼斯弧菌toxs基因的2种PCR方法特异性均为100%,灵敏度分别为2 400和24CFU/mL,完全满足了弗尼斯弧菌的检测标准,可应用于食品样品中弗尼斯弧菌的检测。     

臭氧化海水对于弧菌DNA的损伤作用

用琼脂糖电泳法分别检测了臭氧化海水对溶藻胶弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、飘浮弧菌(Vibrio natriegen)菌体内DNA和经碱性裂解法抽提后得到的裸露DNA的损伤作用。结果表明,臭氧化海水对DNA有很强的损伤和降解作用,在电泳图谱上表现为DNA带的加宽和弥散;臭氧化海水对裸露DNA的损伤作用,在电泳图谱上表现为DNA带荧光强度的增强和出现长长的拖尾。     

杜氏鰤的一种细菌病病原菌研究

从患病的杜氏（鱼师）肾脏分离出Y-1菌.人工感染试验,当注射9.0×107CFU/尾时,Y-1菌可致试验鱼100%死亡;注射9.0×106CFU/尾时,死亡率为50%,症状与自然发病相似,结果表明该分离菌为致病菌.Y-1菌为革兰氏阴性,有动力,杆状,极生单鞭毛;发酵葡萄糖,还原硝酸盐,氧化酶、触酶阳性,赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶阴性.根据形态及生理生化特性,Y-1菌应为弧菌Vibriosp..药敏试验结果表明,该菌对氨基糖甙类、呋喃类、喹诺酮类及大环内脂类药物敏感.     

大黄鱼病原副溶血弧菌单克隆抗体制备及其应用

用甲醛灭活副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和溶藻弧菌(V.alginolyticus)制成免疫原免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,获得1株特异的针对副溶血弧菌的单克隆抗体,命名为D6F3H5。腹水及培养上清液抗体的ELISA效价分别为:1∶5 120和1∶1 280,该单克隆抗体与其它细菌没有明显的交叉反应。利用该单克隆抗体和兔抗副溶血弧菌多克隆抗体,建立了检测副溶血弧菌的双抗体夹心ELISA方法。该方法对副溶血弧菌的最小检出量为5×104个/mL。用双抗体夹心ELISA检测大黄鱼(Pseudosciaena crocea)样品,14尾患病大黄鱼中有11尾检出副溶血弧菌,而10尾健康大黄鱼都没有检出副溶血弧菌。由此可见,本试验制备的高特异性的抗副溶血弧菌单克隆抗体,可以用于患病大黄鱼副溶血弧菌的快速诊断。     

水产动物致病性副溶血弧菌双重PCR 检测方法的研究

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是多种水产养殖动物的主要病原菌,尤其是可引起凡纳滨对虾幼虾呈毁灭性死亡。本研究基于gyrB和toxR两种基因序列设计2对特异性引物,建立一种副溶血弧菌快速、准确的双重PCR检测方法,扩增目的片段大小分别为285 bp和368 bp。结果表明在同一PCR反应体系中副溶血弧菌可同时扩增大小分别为285 bp和368 bp的2种基因片段,两种引物对4种其他水产动物病原菌无交叉反应;敏感性检测结果显示,该双重PCR最低能检测8.867 2×103 CFU/mL菌体浓度的副溶血弧菌,对副溶血弧菌模板DNA的检出极限为0.029 3 mg/L;对发病中国对虾糠虾幼体、水产品及虾池养殖用水进行双重PCR检测,呈阳性反应的样品可分离出优势生长的副溶血弧菌。该实验所建立的基于gyrB和toxR两种基因的双重PCR检测方法可用于副溶血弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及分子流行病学的调查研究。     

枯草芽孢杆菌对泥蚶及养殖底泥中细菌总数和弧菌总数的影响

以平板计数法,研究了不同浓度枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)对泥蚶(Tegillarca granosa)及养殖底泥中细菌总数和弧菌总数的影响.试验分为1×10~6,5×10~6和10×10~6CFU/L 3个浓度试验组和对照组,试验共进行28 d,在第0、7、14、21和28天时采底泥和泥蚶,采用平板计数法检测细菌总数和弧菌总数.结果显示,在投施枯草芽孢杆菌后7 d内,养殖底泥和泥蚶体内细菌总数均呈明显上升趋势(P<0.05),7～28 d内缓慢下降,但差异不显著(P<0.05);投施枯草芽孢杆菌后,各试验组底泥和泥蚶体内弧菌总数显著低于对照组(P<0.05),5×10~6CFU/L和10×10~6 CFU/L试验组弧菌总数显著低于1×10~6CFU/L试验组(P<0.05).结果表明枯草芽孢杆菌具有抑制弧菌增殖的作用,枯草芽孢杆菌可应用于泥蚶池塘养殖.     

泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)病原霍乱弧菌(Vibrio cholerae)PCR 与LAMP检测方法的比较研究

采用分子生物学方法,以霍乱弧菌lolB为靶基因设计特异性引物,进行了霍乱弧菌的PCR和环介导等温核酸扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测技术研究,并对它们的特异性、灵敏性和实际应用进行了比较.结果表明,所建立的PCR检测霍乱弧菌的方法最低检测限为4.0× 103 CFU/ml; LAMP检测方法在65℃下恒温扩增60min,检测限为4.0×101 CFU/ml,反应产物加入荧光染料SYBR Green Ⅰ后反应液呈现明显的绿色;以温和气单胞菌、副溶血弧菌、鳗弧菌及美人鱼弧菌为对照菌株,检测结果均为阴性;霍乱弧菌人工染菌的8种水产品进行PCR及LAMP检测,结果均为阳性,而未染菌组均为阴性;PCR及LAMP检测霍乱弧菌的方法均具有灵敏度较高、特异性强等优点,且LAMP检测霍乱弧菌的方法灵敏度是PCR方法的100倍,更适合于养殖现场检测的推广使用.     

副溶血弧菌菌株1211U的活的非可培养状态

将副溶血弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）菌株１２１１培养于低温贫养条件下,以平板菌落计数法（ＰＣ）和最大近似数法（ＭＰＮ）检测可培养细菌数,５０￣６０ｄ后表明可培养数下降为零。吖啶橙荧光显微镜直接计数法（ＡＯＤＣ）检测细菌总数,表明细菌总数始终变化不大,而活菌直接计数法（ＤＶＣ）检测到的活菌数保持在１０＾５个／ｍｌ。本实验证明了副溶血弧菌１２１１Ｕ株在一定的条件下或进入活的非     

养殖刺参腐皮综合征两种致病菌Dot-ELISA快速检测

以养殖刺参(Apostichopus japonicus)腐皮综合征两种主要致病原灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)为抗原,分别制备兔抗血清,建立了两种病原菌的点酶ELISA(Dot-ELISA)检测方法。根据方正试验,确定检测用一抗、二抗最佳工作稀释度:灿烂弧菌抗血清稀释度320,酶标二抗稀释度3 000;假交替单胞菌抗血清稀释度160,酶标二抗稀释度2 000。阻断试验结果表明两种抗血清特异性均较高。灿烂弧菌抗血清在稀释度为40时与溶藻胶弧菌、河流弧菌、创伤弧菌等弧菌发生微弱交叉反应,提高稀释度到160时,不发生交叉反应。假交替单胞菌抗血清基本不与常见海水致病弧菌发生交叉反应。人工感染试验检测结果表明该方法能从患病海参溃烂组织、未发病海参组织和感染水体检测到相应致病菌,检测灵敏度为9.4×103个/mL。人工感染试验检测结果经直接凝集反应验证。该方法操作简便、灵敏度高,不需复杂仪器设备,适合在基层推广。     

用PCR方法快速检测水产品中的副溶血弧菌

建立了水产品中副溶血弧菌快速,敏感,特异的PCR检测方法;选择的引物具有良好的副溶血弧菌的种特异性,对人工污染在冷冻水产品中副溶血弧菌的检测低限是12-21CFU/10g,对其增菌液的检测低限是7600-9100GFU/ml。每PCR反应体系的检测低限为91-109CFU,对400份自然污染样品的检测结果显示,PCR方法的检测结果同常规培养法的结果完全相符。