大黄鱼( Larimichthys crocea ) CRFB13 基因的克隆与表达分析

IFN-γ是哺乳动物的一个关键免疫调节因子,通过特异性地结合IFN-γ受体1(IFNGR1)和IFN-γ受体2(IFNGR2)组成的异源四聚受体复合物,来发挥其生物学功能.目前,在鱼类中已经克隆出IFNGR1基因的2个亚型:细胞因子受体家族B 13(CRFB13)和细胞因子受体家族B17(CRFB17).本研究从大黄鱼(Larimichthys crocea)中克隆得到了一个CRFB13基因(Lyc CRFB13),其开放阅读框全长1 158个核苷酸,编码由385个氨基酸组成的1个蛋白.Lyc CRFB13蛋白具有典型的II型细胞因子受体特征,包括1个信号肽、1个胞外的FN III-like结构域,1个单次跨膜结构域,以及胞内的JAK1和STAT1结合位点.氨基酸序列分析表明鱼类的CRFB13都具有JAK1和STAT1结合位点.系统进化分析表明鱼类的2种IFNGR1,CRFB13和CRFB17形成2个独立的分支,Lyc CRFB13和鱼类的CRFB13聚在一起,与雀鲷(Stegastes partitus)CRFB13的亲缘关系最近.组织分布显示Lyc CRFB13为组成型表达,在大黄鱼鳃中的表达量最高,而在小肠中的表达量最低.Poly(I:C)刺激后,大黄鱼鳃和头肾中CRFB13的mRNA转录水平都显著升高.此外,poly(I:C)和LPS还能够诱导大黄鱼头肾白细胞中Lyc CRFB13的表达,这些结果表明Lyc CRFB13可能在大黄鱼抗病毒、抗细菌免疫反应中发挥重要作用.     

大黄鱼(Larimichthys crocea)白细胞介素10(IL-10)基因克隆及溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)侵染后表达变化分析

白细胞介素10(interleukin10,IL-10)是鱼类先天性免疫因子之一,在炎症反应和免疫调节中有着重要作用。本研究获得大黄鱼(Larimichthys crocea)IL-10基因cDNA序列,由899个核苷酸组成,含1个555bp的开放阅读框、编码184个氨基酸,预测编码蛋白分子量为21.24kDa、N端有22个氨基酸组成的信号肽序列。氨基酸序列多重比对表明大黄鱼IL-10具有IL-10家族特征性序列和构成2对二硫键的4个保守性半胱氨酸,与欧洲鲈(Dicentrarchuslabrax)IL-10序列相似性最高(78.5%);系统进化树分析显示大黄鱼IL-10和其他鱼类IL-10形成一个大簇,与欧洲鲈进化关系最近。荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测结果显示健康大黄鱼IL-10基因在鳃和肠中高表达,肝和头肾中低表达;溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)侵染后大黄鱼肠、脑、脾、肝和头肾中IL-10基因表达量均显著上调(P0.05),其中头肾和肝中上调幅度最大(分别为菌侵染前的10.06倍和8.79倍)。综上,大黄鱼IL-10基因表达与病原菌感染密切相关,为深入研究大黄鱼IL-10的生物学功能及免疫机制提供了基础资料。     

大黄鱼cGAS-like基因isofrom X1的克隆鉴定及在感染刺激隐核虫后的表达变化

cGAS(cyclic GMP-AMP synthase)基因是近几年来新发现的先天免疫中一个新型的信号分子。作者基于大黄鱼(Larimichthys crocea)基因组信息,用cDNA末端快速扩增(RACE)技术在鳃组织中克隆鉴定了cGAS基因cDNA全长序列:包含1个231 bp的5′端-非翻译区(5′-UTR)、207 bp的3′-UTR和1 488 bp的开放阅读框(ORF),命名为Lc-cGAS-like X1。该基因编码1个由495个氨基酸残基组成的多肽,预测的分子量(Mw)大小为56.57kDa,理论等电点(pI)为9.45;序列分析表明其预测的蛋白无信号肽,第115～431位氨基酸序列为Mab-21功能域,第470～492位氨基酸序列为跨膜结构域。基因组全长3 153 bp,包含8个外显子和7个内含子,所有内含子的剪切特点都符合GT-AG规则。同源比对结果显示:Lc-cGAS-likeX1与鱼类cGAS的相似性大于66%,与高等脊椎动物的相似性较低。系统进化分析表明Lc-cGAS-like X1与鱼类cGAS聚成一支。荧光定量PCR(qPCR)检测显示Lc-cGAS基因(X1/X2两种剪切体)在大黄鱼9种组织中均有表达,其中在鳃中的表达量最高;刺激隐核虫感染后,大黄鱼免疫器官头肾中Lc-cGASmRNA分别在刺激隐核虫幼虫感染阶段和滋养体脱落阶段出现了极显著上调(P0.01);解毒器官肝脏中分别在滋养体脱落阶段和细菌感染阶段出现极显著上调变化(P0.01)。本研究结果暗示大黄鱼cGAS基因参与了大黄鱼感染刺激隐核虫的免疫防御过程,为进一步了解鱼类cGAS基因的多样化功能提供参考。     

大黄鱼Lcnkl3基因的分子结构、表达特征及多肽片段抗菌活性

作为重要的免疫基因, NK-lysin参与了鱼类非特异性免疫系统对抗病原感染的免疫应答过程。在之前的研究中, 我们已经发现重要经济鱼类大黄鱼(Larimichthys crocea)体内存在2种类型的NK-lysin基因。在本文中我们报道了1种新型大黄鱼NK-lysin基因Lcnkl3, 并对基因序列、表达特征及其多肽片段的抗菌活性进行了分析。Lcnkl3基因的开放阅读框长度为435 bp, 编码144个氨基酸残基, 其多肽序列Lcnkl3中包含Saposin B结构域及6个高度保守的半胱氨酸残基。系统进化分析表明Lcnkl3与大黄鱼Lcnkl2最为相似, 与其他鱼类NK-lysin多肽则差异较大。Lcnkl3基因在未受感染的大黄鱼各组织中具有不同的基础表达量, 表达水平最高的组织为心脏。在病原诱导的免疫应答过程中, Lcnkl3基因在各组织不同感染阶段的表达模式存在差异。源于Lcnkl3成熟肽序列的多肽片段对不同细菌的抑制和杀灭效果差异显著。以上结果表明Lcnkl3属于大黄鱼NK-lysin基因家族, 并参与了大黄鱼对抗病原感染的免疫过程。     

大菱鲆家系选育二代7种免疫因子的分析

为选育高成活率的大菱鲆(Scophthalmus maximus)抗鳗弧菌(Vibrio anguillarum)群体,对30个大菱鲆选育二代家系(F2)和1个普通养殖群体进行鳗弧菌攻毒实验(周期为14 d),统计分析死亡率。选取死亡率不同的6个选育家系和普通养殖群体构成7个实验组,采用半定量-聚合酶链反应(semi-quantitative polymerase Chain reaction,RT-PCR)技术对它们肝脏、脾脏、头肾的相关免疫因子——溶菌酶(Lysozyme)、抗菌肽(Hepcidin)、热激蛋白70(HSP70)、热激蛋白90(HSP90)、免疫球蛋白(Ig M)、C-型凝集素(C-type lectin)、Lily-型凝集素(Lily-type lectin)的表达量开展研究,并应用SPSS 16.0软件对攻毒前后各免疫因子的表达量与攻毒后存活率之间的相关性进行分析。研究结果表明:攻毒前后选育家系幼鱼肝脏、脾脏、头肾中7个免疫因子的表达量普遍高于普通养殖幼鱼,且在7个实验组中,攻毒后的表达量相较攻毒前均呈现下降趋势;攻毒前,肝脏中lysozyme、Ig M的表达量与存活率为极显著性正相关(P0.01),HSP70、HSP90、C-type lectin、Lily-type lectin的表达量与存活率为显著性正相关(P0.05);脾脏中,Hepcidin、HSP70和HSP90的表达量与存活率为极显著性正相关(P0.01);头肾中,HSP70的表达量与存活率为显著正相关(P0.05)。综上,可以推断选育家系相对于普通养殖群体大菱鲆抗鳗弧菌性能更强,且7种免疫因子在鳗弧菌感染鱼体的过程中发挥重要的抗感染作用;从F2中获得一个抗鳗弧菌性能较强的家系(23号),可用于今后大菱鲆抗鳗弧菌品系的选育指导工作,为大菱鲆高成活率群体的选育提供参考资料和理论依据。     

刺参(Apostichopus japonicus)腐皮综合症发生相关蛋白的分离与鉴定

采用比较蛋白质组学的方法,对2011年10月20日取自辽宁省普兰店室内养殖厂腐皮综合症刺参和健康个体肠组织中差异表达蛋白进行了研究。结果表明,在优化的电泳条件(80μg脱盐蛋白、pH4—7[NL,13cm]的IPG预制胶条)下,共检测到约700个蛋白质点;表达量差异两倍以上的蛋白点51个,最大表达差异比率为4.32;对其中重复性一致的30个差异点进行质谱鉴定,成功鉴定了23个差异蛋白,包括铁蛋白,过氧化氢酶,泛素相关修饰子3,细胞色素氧化酶和肌动蛋白等;进一步扫描实验室完成的刺参转录组数据,筛选了过氧化氢酶和泛素相关修饰子3的EST序列。本研究是蛋白层面上刺参腐皮综合症发生机制的有效尝试,研究结果为进一步认识该疾病的发生机制提供了参考。     

大黄鱼IL-7-Rα基因的克隆与表达分析

白细胞介素7受体α链(IL-7Rα,CD127)是一个重要的多效性细胞因子受体.本研究克隆得到大黄鱼(Larimichthys crocea)的IL-7Rα(LycIL-7Rα),其开放阅读框全长1 242 bp,编码413个氨基酸.通过氨基酸序列分析和多序列比对发现,LycIL-7Rα多肽具有I型细胞因子受体的典型特征,包括4个保守的半胱氨酸、1个信号肽、1个单次跨膜结构域、1个胞外的fibronectin type III(FN IIIlike)结构域、1个Trp-Ser-X-Trp-Ser(WSXWS)基序以及胞内Box1结构域.系统进化分析表明,LycIL-7Rα与其他鱼类的IL-7Rα聚在一起,与鲈鱼(Lates calcarifer)IL-7Rα的亲缘关系最近.Realtime PCR结果表明,LycIL-7Rα在健康大黄鱼中为组成型表达,在脾脏中的表达量最高,在心脏中的表达量最低.大黄鱼经聚肌苷酸胞苷酸[Poly(I:C)]或溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)刺激后,其脾脏中LycIL-7Rα的mRNA转录水平均显著上调.这些结果表明LycIL-7Rα可能在大黄鱼免疫反应中发挥重要作用.     

大黄鱼(Larimichthys crocea)补体调节因子CFH 和 CFHR2 基因的分子特征及表达分析

补体是鱼类免疫系统重要的组分, 具有识别和消除外来病原体, 激活免疫细胞, 调控获得 性免疫等功能。在免疫组织中, 补体调节因子大约占据了补体成分的二分之一, 当受到外界病原刺激 时会迅速活化补体成分, 并且进一步聚合形成酶复合物发挥一系列免疫效应。CFH 和CFHR2 是补体 替代途径重要的调节因子, 对于补体系统正常运转必不可少。为此, 本文测定了大黄鱼补体调节因子 CFH 和CFHR2 基因的cDNA 全序列, 并对基因组织特异性表达和溶藻弧菌刺激后基因mRNA 表达 量的变化等方面进行了研究。CFH 和CFHR2 序列全长分别为1332 bp 和1170 bp, 分别编码443 和 389 个氨基酸, N 端信号肽序列分别为24 和32 个氨基酸。推导的氨基酸序列结构分析表明大黄鱼 CFH 和CFHR2 基因具有RCA 蛋白家族的典型特征, 即含有多个保守的CCP 结构(补体控制蛋白). 实时荧光定量PCR 结果显示, CFH 和CFHR2 在健康大黄鱼的肝、脾、肾、肠、脑、胃、心和肌肉 这8 种组织中都有表达, 其中肝脏的表达量显著高于其它几种组织。溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus) 侵染了健康的大黄鱼之后, CFH 和CFHR2 的mRNA 表达量均明显上调, 并且随着感染时间的变化呈 现不同的上升趋势。结果表明补体调节因子mRNA 表达量的变化与溶藻弧菌的侵染密切相关, 表明 了CFH 和CFHR2 可能在大黄鱼自身免疫机制中发挥重要的作用。     

大黄鱼β-actin 抗体的制备与组织表达谱分析

为探讨大黄鱼(Larimichthys crocea)β-actin基因(Lc Actb)作为内参基因进行相关研究的可行性,从转录和翻译水平研究其组织表达谱,作者以大黄鱼肝脏为材料,扩增Lc Actb的开放阅读框序列,并将其亚克隆至原核表达载体p ET32a(+)。酶切、测序结果表明,p ET32a-Lc Actb构建成功。将p ET32a-Lc Actb转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行优化表达,表达蛋白经纯化后进行Western blotting验证;原核表达结果表明,IPTG可诱导一个分子量约45 ku的特异蛋白,且主要以包涵体的形式存在,优化表达条件为:28℃、0.4mmol/L IPTG、200 r/min诱导表达5 h。用表达蛋白作为抗原,免疫新西兰白兔制备抗Lc Actb的多克隆抗体;用纯化的多抗进行Western blotting的结果表明,获得了特异性的Lc Actb抗体;通过实时荧光定量RT-PCR检测大黄鱼多种组织m RNA的表达,其次,制备了多种组织匀浆蛋白,使用纯化的抗体进行Western blotting分析,结果显示,Lc Actb在大黄鱼成体各组织中转录和翻译水平的表达差异均不显著,可做为研究大黄鱼成体组织中其他基因表达和翻译水平的内参标准。     

MS-222对大黄鱼(Larimichthys crocea)麻醉保活运输效果研究

为优化大黄鱼(Larimichthyscrocea)麻醉运输技术,提高保活率,以不同浓度MS-222麻醉剂对其运输存活率、呼吸代谢、鱼体生理生化指标的影响展开研究。结果显示:(1) 12 h模拟运输后,10mg/L麻醉组大黄鱼存活率显著高于其他实验组(P<0.05),30mg/L麻醉组积累死亡率已高于50%;(2)呼吸频率随麻醉剂浓度的升高显著降低(P<0.05),各组水体溶解氧含量随运输时长增加均呈下降趋势;(3) 10和20 mg/L麻醉组大黄鱼复苏率分别为89%±10%和63%±19%,且均显著高于30 mg/L麻醉组(P<0.05);(4)随麻醉剂浓度的升高,大黄鱼血清中皮质醇、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸酶水平逐渐降低,其肌肉乳酸水平显著降低(P<0.05),其肌糖原水平显著升高(P<0.05)。结果表明:高浓度(30mg/L)MS-222处理会引起大黄鱼呼吸抑制,造成运输存活率下降,不适合应用于大黄鱼的保活运输;低浓度(10mg/L)MS-222处理可以达到降低鱼体拥挤胁迫、应激反应及呼吸代谢的效果,并可以有效降低大黄鱼死亡率,保活...     

光照强度对番红砗磲外套膜颜色变化的影响

以蓝色、棕黄色和绿色三种不同外套膜颜色的番红砗磲(Tridacna crocea)为实验对象,设置5000 lx、10000 lx和15000 lx三组光照强度,探究了番红砗磲外套膜颜色变化与光照强度的相关性。结果表明:(1)在不同光照强度下,蓝色个体外套膜颜色加深,棕黄色个体颜色变化不大,而绿色个体外套膜颜色变浅。(2)蓝色个体在光照刺激2周后外套膜颜色即出现显著变化,0~2周色差为13.81~21.59;在不同光照强度刺激下,棕黄色和绿色个体的外套膜颜色的色差随时间延长而逐渐增强,4~6周外套膜颜色色差最大。(3)番红砗磲原外套膜颜色类别对其外套膜颜色红绿特征数值(a)和黄蓝特征数值(b)影响显著(P<0.05);光照强度对番红砗磲外套膜颜色黄蓝特征数值(b)影响显著(P<0.05);光照强度和番红砗磲原外套膜颜色类别的交互作用对红绿特征数值(a)的影响显著。上述结果可为定向培育外套膜颜色鲜艳的番红砗磲以及解析砗磲环境适应机制提供参考。     

岱衢族大黄鱼(Pseudosciaena crocea) 线粒体基因组全序列的扩增及其特异鉴别引物的开发

采用PCR扩增、克隆获得了岱衢族和闽-粤东族大黄鱼(Pseudosciaena crocea)线粒体基因全长序列,并扩增了各25条样本的高变区域,测序结果可分成3个操作分类单元(Operational Taxonomic Unit,OTU);闽-粤东族含3个类型:D1-N1、D1-N2和D2型;而岱衢族样品均为D1-N1型;设计出能区分不同分型的鉴别引物J1和J2,且优化了鉴别条件。结果表明:根据凝胶电泳的图片,如果样品分型为D1-N2和D2型,则100%为闽-粤东族;如果样品分型为D1-N1型,则该样品为岱衢族的概率为86.2%,为闽-粤东族的概率为13.8%。研究结果为岱衢族大黄鱼的种质资源保护、良种选育和市场销售等方面提供技术支持。     

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)致病性维氏气单胞菌的分离鉴定与药敏特性研究

本研究从自然发病的养殖大黄鱼(Pseudosciaena crocea)肝脏处分离得到1株优势菌9L2,经形态学观察和传统生理生化鉴定,显示该菌为发酵型革兰氏阴性短杆菌,有动力,氧化酶阳性,水解赖氨酸及色氨酸等。利用Biolog细菌鉴定方法进行种属鉴定,确定9L2为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii),相似性达100%。同时对其16S rDNA基因进行PCR扩增、测序和系统发育分析,结果表明该菌与气单胞菌属的菌株亲缘关系最近,与维氏气单胞菌(登录号为LMG13695)的16S rRNA基因序列相似性达99.79%。经人工腹腔注射感染吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)的试验结果表明,9L2对罗非鱼的半数致死剂量LD_(50)为1.08×10~3CFU/g。24种抗生素药敏试验结果表明,该菌株对诺氟沙星、新生霉素、呋喃妥因、头孢曲松等13种药物高度敏感,对洛美沙星、卡那霉素等5种药物中度敏感,对利福平、青霉素等6种药物产生耐药性。20种中药体外抑菌试验结果表明,其中11种对致病菌体外抑菌效果较好,平均抑菌浓度范围为0.11—7.20mg/mL。     

大黄鱼选育群体与普通养殖群体部分免疫指标的比较

以本课题组选育的“闽优1 号”及未经选育的普通大黄鱼(Larimichthys crocea)养殖群体为研究对象, 比较了两者的白细胞吞噬活性、血清溶菌酶活性、杀菌活力、白蛋白及免疫球蛋白含量、血清及血细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性等免疫指标的差异。结果表明: 选育的“闽优1 号”大黄鱼血清溶菌酶和血细胞SOD 活力显著高于对照组(P<0.05), 而血清中的免疫球蛋白含量低于普通养殖群体。在病原菌攻毒后8 d 内, 选育群体累积死亡率显著低于非选育群体, 提示非特异性免疫在大黄鱼抗病免疫的早期阶段可能起着重要作用。     

低温选择大黄鱼(Pseudosciaena crocea)的肝脏蛋白质组双向电泳分析

采用双向电泳技术,对低温选择组与对照组大黄鱼进行肝脏蛋白质组双向电泳分析。结果表明,低温选择组肝脏蛋白点1673±47个,对照组1651±43个,共有19个蛋白点经低温选择后,表达量显著变化。从中挑选3个差异蛋白点进行肽指纹图谱(MALDI-TOF-MS)或串联质谱(LC-MS-MS)分析,然后MS-BLAST数据库搜寻。低温选择组大黄鱼肝脏MHC和CFL2蛋白表达显著上调,而2-CysPrxs蛋白表达显著下调。说明低温选育组大黄鱼机体抗细胞凋亡能力明显增强,预示低温选择后留下的大黄鱼在低温环境中生存能力更强。