4种笛鲷AFLP引物筛选及其遗传多样性分析

以湛江近海的勒氏笛鲷Lutjanus russellii、紫红笛鲷L. argentimaculatus、红鳍笛鲷L. erythropterus、千年笛鲷L. sebae为研究对象,采用EcoR /ⅠMselⅠ双酶切组合,对4种笛鲷进行扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)标记的开发和筛选,并对其进行遗传多样性分析.从50对引物中筛选适合4种笛鲷的AFLP引物,其中勒氏笛鲷筛选出24对,获得位点1431个,多态位点比例为22.85%;紫红笛鲷筛选出20对,获得位点1370个,多态位点比例为17.08%;红鳍笛鲷筛选出22对,获得位点1403个,多态位点比例为17.18%;千年笛鲷筛选出22对,获得位点1349个,多态位点比例为12.90%.Nei氏遗传距离法计算每种笛鲷30个个体之间的平均遗传距离,勒氏笛鲷为0.1035,紫红笛鲷为0.0719,红鳍笛鲷为0.0805,千年笛鲷为0.0572.选取2对引物对4种笛鲷群体间遗传多样性进行分析,获得总位点140个,多态位点104个.4种笛鲷种群间遗传距离分布在0.3773—0.6650,明显高于各笛鲷种群内遗传距离,其中紫红笛鲷和千年笛鲷的遗传距离最远,为0.6650,勒氏笛鲷和红鳍笛鲷的遗传距离最近,为0.3773.     

4种笛鲷属鱼类mtDNA的RFLP研究

用RFLP(限制性片段长度多态性,Restriction fragment length polymorphism)技术研究了红鳍笛鲷Lutjanus erythropterus Bloch、紫红笛鲷Lutjanus argentimaculatus Forskal、勒氏笛鲷Lutja-nus russelli Bleeker和约氏笛鲷Lutjanus johni Bloch的遗传多样性关系,检测到4种笛鲷的分子标记。通过差速离心、核酸酶消化、苯酚抽提,从4种笛鲷肝脏组织中分离纯化线粒体DNA(mtDNA),用19种5到6碱基对的限制性内切酶进行单酶、双酶和部分酶切,琼脂糖凝胶电泳,进行了RFLP分析,构建了4种笛鲷mtDNA的物理图谱。红鳍笛鲷、紫红笛鲷、勒氏笛鲷和约氏笛鲷的mtDNA大小分别为17.36±0.09kb、17.58±0.08kb、17.50±0.18kb和17.56±0.12kb。红鳍笛鲷和紫红笛鲷种群间平均mtDNA多态度π为0.106 2,红鳍笛鲷和勒氏笛鲷群体间平均mtDNA多态度π为0.130 5,红鳍笛鲷和约氏笛鲷群体间平均mtDNA多态度π为0.151 5,紫红笛鲷和勒氏笛鲷群体间平均mtD-NA多态度π为0.130 3,紫红笛鲷和约氏笛鲷群体间平均mtDNA多态度π为0.119 5,勒氏笛鲷和约氏笛鲷群体间平均mtDNA多态度π为0.139 4。红鳍笛鲷和紫红笛鲷种群间净遗传距离Pnet为0.102 0,红鳍笛鲷和勒氏笛鲷群体间净遗传距离Pnet为0.128 5,红鳍笛鲷和约氏笛鲷群体间净遗传距离Pnet为0.149 1,紫红笛鲷和勒氏笛鲷群体间净遗传距离Pnet为0.127 0,紫红笛鲷和约氏笛鲷群体间净遗传距离Pnet为0.115 7,勒氏笛鲷和约氏笛鲷群体间净遗传距离Pnet为0.137 8。     

6种笛鲷属鱼类Cyt b基因片段序列的比较

采用聚合酶链式反应直接测序法，获得紫红笛鲷(Lutjanus argentimaculatus)、白星笛鲷(L．stellatus)、千年笛鲷(L．sebae)、勒氏笛鲷(L．russelli)、红鳍笛鲷(L．erythropterus)5种笛鲷属鱼的线粒体细胞色素b(Cyt b)425bp序列，并结合基因库中的斜带笛鲷(L．decussatus)Cytb同源序列进行比较分析，共发现88个核苷酸位点存在变异(20．7％)。用MEGA2．1软件中的Pairwise distance工具计算了6种笛鲷属鱼类的相对遗传距离，表明6种笛鲷属鱼类的序列差异在0．096-0．129之间，其中红鳍笛鲷和紫红笛鲷序列差异最大为0．129，千年笛鲷与红鳍笛鲷的序列差异最小为0．096；序列变异的转换／颠换比值较低，平均只有2．160。     

9种常见笛鲷微卫星位点筛选与遗传多样性分析

利用从勒氏笛鲷Lutjanus russelli基因组文库中筛选得到37对微卫星引物对笛鲷属9个习见种红鳍笛鲷 L. erythropterus、紫红笛鲷L. argentimaculatus、星点笛鲷L. stellatus、约氏笛鲷L. johnii、千年笛鲷L. sebae、金带笛鲷L. fulvus、金焰笛鲷L. fulviflamma、画眉笛鲷L. vitta与奥氏笛鲷L. ophuysenii的微卫星位点进行筛选和分析.9个种都能检测到的微卫星位点有10个, 部分种能检测到的有13个.9种笛鲷Hardy-Weinberg平衡下的平均期望杂合度在0.730―1.000, 平均观测杂合度在0.716―0.915, 偏离指数(D)为-0.002― -0.214.微卫星位点杂合度的分析表明目前笛鲷属鱼类存在较高的遗传多样性水平.另发现9个种的笛鲷都出现了杂合子缺失的情况, 缺失的原因有待于进一步的研究予以解释.     

4种笛鲷的线粒体DNA多样性分析

取红鳍笛鲷(Lutjanus erythopterusBloch)、紫红笛鲷(Lutjanus argentimaculatusFor-skal)、勒氏笛鲷(Lutjanus russelliBleeker)和约氏笛鲷(Lutjanus johniBloch)肝脏组织,分离纯化其线粒体DNA,用限制性内切酶酶切进行了限制性片段长度多态性分析。在红鳍笛鲷共发现4种单倍型,单倍型间的平均遗传距离为0.010 1,其mtDNA多态度为0.002 9。在紫红笛鲷共发现6种单倍型,单倍型间的平均遗传距离为0.015 1,其mtDNA多态度为0.005 5。在勒氏笛鲷共发现3种单倍型,单倍型间的平均遗传距离为0.008 6,其mtDNA多态度为0.001 2。在约氏笛鲷共发现5种单倍型,单倍型间的平均遗传距离为0.008 3,其mtDNA多态度为0.002 0。     

RAPD对红鳍笛鲷(♀)×千年笛鲷(♂)子一代杂种优势预测的分析

应用RAPD技术对红鳍笛鲷(♀)、千年笛鲷(♂)和红鳍笛鲷(♀)×千年笛鲷(♂)子一代3个群体的RAPD扩增带谱进行了分析,并对杂交子代F1杂种优势进行了预测.从100个随机引物中筛选出35个扩增带丰富的引物进行扩增,共得到190条清晰稳定的扩增带,其中有176个扩增位点具有多态性,多态性位点比率为92.6%.红鳍笛鲷、F1、千年笛鲷3个群体的遗传相似性指数分别为0.831 9,0.726 3,0.916 8;Nei多样性指数分别为0.174 5,0.264 0,0.118 4;Shannon信息指数分别为0.256 4,0.384 5,0.171 2.红鳍笛鲷(♀)-F1,F1一千年笛鲷(♂),红鳍笛鲷(♀)一千年笛鲷(♂)的遗传距离分别为0.397 2,0.317 0,0.854 1.从相似性指数、Nei多样性指数和Shannon信息指数均显示F1代有杂种优势,并找到了种间特异性标记.     

RAPD对红鳍笛鲷(♀)×千年笛鲷(♂)子一代杂种优势预测的分析

应用RAPD技术对红鳍笛鲷(♀)、千年笛鲷(♂)和红鳍笛鲷(♀)×千年笛鲷(♂)子一代3个群体的RAPD扩增带谱进行了分析,并对杂交子代F₁杂种优势进行了预测。从100个随机引物中筛选出35个扩增带丰富的引物进行扩增,共得到190条清晰稳定的扩增带,其中有176个扩增位点具有多态性,多态性位点比率为92.6%。红鳍笛鲷、F₁、千年笛鲷3个群体的遗传相似性指数分别为0.831 9,0.726 3,0.916 8;Nei多样性指数分别为0.174 5,0.264 0,0.118 4;Shannon信息指数分别为0.256 4,0.384 5,0.171 2。红鳍笛鲷(♀)-F₁,F₁-千年笛鲷(♂),红鳍笛鲷(♀)-千年笛鲷(♂)的遗传距离分别为0.397 2,0.317 0,0.854 1。从相似性指数、Nei多样性指数和Shannon信息指数均显示F₁代有杂种优势,并找到了种间特异性标记。     

AFLP技术在笛鲷的仔鱼鉴定及其分类学上的研究

以南沙群岛采获的勒氏笛鲷(Lutjanus russelli)、黄笛鲷(Lutjanus lutjanus)、红笛鲷(Lut janus sanguineus)、紫红笛鲷(Lutjanus argentimaculatus)、金焰笛鲷(Lutjanus fulviflamma)、线纹笛鲷(Lutjanus lineolatus)、画眉笛鲷(Lutjanus vitta)、马拉巴笛鲷(Lutjanus malabarius)、驼背笛鲷(Lutjanus gibbus)、约氏笛鲷(Lutjanus johni)、金带笛鲷(Lutjanus vaigiensis)11种笛鲷属的后期仔鱼为材料, 进行了基因组DNA的AFLP(扩增片段长度多态性)研究,通过笛鲷仔鱼和成鱼的AFLP电泳图谱的比较分析,将这11种笛鲷属的仔鱼成功分开.研究表明,最适合的AFLP引物组合是E+AGC/M+CAA,由这11种笛鲷共扩增出132 AFLP位点,每种笛鲷的AFLP条带数为43~69,在这11种笛鲷中,共享的AFLP条带数仅为7,同一种笛鲷仔鱼和成鱼AFLP遗传相似度在90%以上.根据这11种笛鲷的Nei遗传距离对Neighboring系统进行进化分析,并且与传统的笛鲷形态分类进行了比较.分子生物学可以阐释笛鲷属鱼类的系统进化和遗传亲缘关系,对传统形态分类学加以完善和补充.     

金焰笛鲷与金带笛鲷的RAPD分析

应用RAPD技术，对笛鲷属的金焰笛鲷(Lutjanus fulviflamma)、金带笛鲷(Lutjanus vaigiensis)进行种群内及种群间遗传学分析。结果表明两种鱼的种内遗传多样性指数(H)分别为：金带笛鲷0．1107；金焰笛鲷0．1673。二者的多态位点比例(P)分别为47．8％和59．0％。2种笛鲷种间平均遗传相似系数为0．4640，遗传距离Dpd为0．5360。2种鱼共检出6个可作为种的特异性鉴定的条带。     

红鳍笛鲷肌肉营养成分分析

为评价红鳍笛鲷(lutjanus erythopterus)肌肉营养价值,使用国标方法测定分析了红鳍笛鲷肌肉营养成分。结果表明:红鳍笛鲷肌肉中粗蛋白、粗脂肪、粗灰分和水分分别为18.60%、0.18%、1.58%和79.80%,属于高蛋白、低脂肪鱼类。肌肉中含有18种氨基酸,氨基酸总量为13.82%(鲜样),其中8种人体必需氨基酸总量为5.90%(鲜样),必需氨基酸占氨基酸总量的比值(WEAA/WTAA)为42.69%,必需氨基酸占非必需氨基酸的比值(WEAA/WNEAA)为74.49%,CS、AAS及EAAI(63.96)均较高;红鳍笛鲷的第一限制性氨基酸为缬氨酸,第二限制性氨基酸为苏氨酸或蛋氨酸+胱氨酸。肌肉中4种金属元素含量低于其他几种经济鱼类。红鳍笛鲷必需氨基酸的组成达到了FAO/WHO的标准,符合全鸡蛋蛋白模式。     

红鳍笛鲷、紫红笛鲷和白斑笛鲷的核型研究

以红鳍笛鲷（Lutjanus erythopterus)、紫红笛鲷(Lutjanus argentimaculatus)、白斑笛鲷（Lutjanus bohar)为材料，胸腔注射PHA及秋水仙素溶液，取头肾细胞经空气干燥法制片，姬姆萨染液染色，观察分析获得染色体核型：染色体数目2N＝48，染色总臂数为48。     

笛鲷属三种鱼类染色体组型的研究

通过胸腔注射PHA及秋水仙素,取头肾细胞,经空气干燥法制片,Giemsa染液染色,观察了笛鲷属的约氏笛鲷（Lutjanus johni）、勒氏笛鲷（L.russelli bleeker）、画眉笛鲷（LLutjanus vitta）的染色体核型进行分析研究,结果表明：染色体数目2n=48,染色体总臂数（NF）为48,核型公式为48t.     

川纹笛鲷消化道优势菌群PCR-DGGE指纹图谱比较分析

采用免培养的16S rDNA梯度凝胶电泳技术（DGGE）对集约化海水网箱养殖川纹笛鲷（Lutjanus sebae）的消化道胃壁、胃内容物、肠壁、肠内容物优势菌群结构进行了比较分析。研究结果显示，川纹笛鲷消化道存在着丰富多样的细菌群落，对DGGE指纹图谱聚类分析表明菌群组成相似度高于55％，其中胃内容物及胃壁细菌组成相似度最高（90％），这可能与摄食饵料在消化道推移有关；而胃壁与肠壁相似度相对最差，可能反应了由于生理环境不同引起的宿主差异性。通过建立川纹笛鲷消化道16S rDNA-DGGE指纹图谱及比较分析，为澄清川纹笛鲷消化道微生物区系奠定了基础。     

日本绒螯蟹放流群体12S rRNA序列研究

参考果蝇与蚤状汊序列进行了日本绒螯蟹放流群体的线粒体ＤＮＡ１２Ｓ ｒＲＮＡ基因片段的引物设计、ＰＣＲ扩增及序列测定,得到４５７ｂｐ的碱基序列,其Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ含量分别为１５８ｂｐ（３４．５７％）、１７８ｂｐ（３８．９５％）、５１ｂｐ（１１．１６％）、７０ｂｐ（１５．３２％）,与果蝇与蚤状相同基因片段序列含量相似。     

日本绒螫蟹放流群体12S rRNA序列研究

参考果蝇与蚤状溞序列进行了日本绒螯蟹放流群体的线粒体DNA 12S rRNA基因片段的引物设计、PCR扩增及序列测定,得到457bp的碱基序列,其A、T、G、C含量分别为158bp(34.57%)、178bp(38.95%)、51bp(11.16%),70bp(15.32%),与果蝇与蚤状相同基因片段序列含量相似.     

大亚湾紫红笛鲷野生群体遗传多样性的RAPD分析

紫红笛鲷野生群体样品取自广东大亚湾海区,取背部肌肉,提取DNA,用RAPD技术检测遗传多样性。40个随机引物当中,有11个引物得到了条带清晰、位点较多且重复性好的电泳图谱。11个引物共得到76个条带,其中48个多态位点,多态位点比例为63.16%。平均遗传距离为0.2144。遗传多样性指数为0.1876。结果显示,大亚湾海区的紫红笛鲷具有较丰富的遗传多样性,工程建设以及人为捕捞等对紫红笛鲷的遗传结构影响不明显。在该海区进行紫红笛鲷的养殖,可以选择野生紫红笛鲷作为亲本培育种苗,但应该注意合理的保护,防止遗传多样性的丧失。