海带配子体无性繁殖(克隆)技术研究与应用进展

海带具有异型世代交替,其配子体在单独分离培养时可进行营养生长,形成无性繁殖系(克隆)。本文简要回顾了海带配子体克隆技术研究与应用的历程,综述海带配子体克隆在海带种质资源保存、海带生理和遗传学研究及海带育种和苗种繁育中的应用现状。     

不同发育时期海带基因工程选择标记的研究

本文以海带(Saccharina japonica)配子体、配子体克隆及幼孢子体为实验材料,研究了不同发育时期的海带对草甘膦、草丁膦、氯霉素的敏感性,经SPSS软件计算出一定时间内3种选择试剂对不同发育时期海带的半致死剂量(LD50)。结果表明:海带配子体及配子体克隆对草甘膦和草丁膦极为敏感,对氯霉素较为敏感。4d时,草甘膦和草丁膦对海带配子体的LD50分别为8.19μg/mL和19.27μg/mL,对海带配子体克隆的LD50分别为73.69μg/mL和39.08μg/mL;而氯霉素对海带配子体及配子体克隆4天的LD50则高达742.00μg/mL和701.51μg/mL。海带幼孢子体仅对草甘膦极为敏感,4d的LD50为40.93μg/mL;对草丁膦和氯霉素较为敏感,4d的LD50分别为214.51μg/mL和907.86μg/mL。该结果说明草甘膦和草丁膦适合作为以海带配子体和配子体克隆为实验材料的基因工程选择试剂,草甘膦则更适合以海带幼孢子体为实验材料的基因工程选择试剂。     

无机氮和磷对海带配子体生长发育的影响

氮(N)是蛋白质和核酸等重要有机物的成份。磷(P)是核酸等重要有机物的成份。它们在细胞代谢中发生重要的作用。海带或其他生物在代谢过程中都必须有一定数量的氮和磷的供应,才能正常地生长和发育。Drew(1910)的实验指出,在天然海水中加入一些无机盐的氮和磷可以促进糖海带配子体的生长。Harries(1932)的实验指出:磷促进海带配子体的细胞分裂。当磷的含量超过氮时,配子体会生长成为多细胞分枝体,结果不能发育为孢子体,当氮的含量过多时,配子体的生长延缓,发育推迟。木下     

超声波对海带配子体克隆的作用

研究了超声波对海带配子体克隆粉碎效果、存活率及生长发育的作用。实验表明：在４００Ｗ处理３０ｓ后再用２００Ｗ处理６０ｓ,海带配子体克隆簇状体的粉碎效果较好：培养７天时细胞日生长速率为０．１５７;大量扩增７天雌、雄配子体克隆的鲜重增重最大为３．４７０ｇ：培养１４天雌性配子体克隆发育率为５２．１％。可作为一种快速、高速、简便的粉碎海带配子体克隆簇状体,制备单细胞悬液的方法。     

海带配子体克隆细胞附着的初步研究

海带是我国海水养殖主要品种之一,其综合应用价值较高[1].20世纪90年代末期,海带配子体克隆在海带苗种繁育中的应用,为海带育苗生产开辟了新途径[2].主要运用生长发育调控技术实现海带配子体克隆细胞大量扩增和同步成熟来繁育海带优良苗种,这样可大幅度降低育苗成本,缩短育苗周期,该项技术具有良好的应用前景.目前海带配子体克隆育苗技术尚未在海带育苗生产中得到规模化应用,其作为一项高新技术,部分关键技术仍有待进一步解决.在与有关生产单位进行海带配子体克隆育苗实验的工作中,笔者认为克隆细胞的附着是影响海带商品苗质量(出苗密度及出苗均匀程度)的关键问题之一.     

海水比重对海带幼苗生长发育的影响

本文提出不同比重海水对海带游孢子的放散、附着,胚孢子的萌发,配子体的生长发育和幼孢子体生长的影响 实验结果表明:(1)海带配子体的生长发育对比重的适应能力较强,在高比重和低比重的海水中虽然死亡率很高、生长发育缓慢,但总有一部分个体能生活下来。配子体对比重的适应范围是1.01010-1.03510;(2)海带的幼孢子体对比重的适应能力较小。其适应范围是1.02000-1.03510.尤其是低比重海水能引起泡烂。本实验结果对指导海带苗种生产有一定意义。     

运用分子标记辅助构建海带核心种质资源

海带(Saccharina japonica)是一种具有重要经济和生态价值的大型海藻,配子体是其种质资源保存的形式,也是海带杂交育种、育苗的材料。为有效管理和评价海带种质资源,初步构建了海带核心种质资源,利用RAPD标记技术对海带"早厚成一号"的28份配子体进行了遗传学评价。采用UPGMA聚类法,根据遗传相似性系数进行分组,采用简单比例法进行取样(25%、35%、50%、65%)分析,计算不同取样比例时的遗传多样性参数,结合样本的生长状态和雌、雄比例,综合评价遗传多样性的各种参数,取样比例为50%时构建的核心种质库相对合理。本研究为海带品种(系)的核心种质的筛选和遗传学评价打下基础。     

海带和长海带配子体无性繁殖系微卫星DNA多态性比较分析

探讨促进海带配子体克隆资源的有效保存和合理利用途径,进行海带良种和杂交海带培育,开发了18个海带微卫星DNA标记,并用这些标记分析了海带和长海带配子体克隆的遗传多样性.这些标记相互独立,至少在1个物种中呈多态性.在36份海带配子体中,这些标记检测到的等位基因数量从2～7个不等,揭示的基因多样性在0.21(H144)和0.75(H120)之间,揭示的香农氏信息指数在0.37(H144)和1.55(H120)之间.长海带和海带的平均等位基因数(1.5/3.3),平均基因多样性(0.12/0.45)和平均香农氏信息指数(0.20/0.81)显著不同.根据总样本确定的前2个最丰富等位基因中,绝大多数的频率在长海带和海带之间存在显著差异.长海带和海带之间在基因多样性和香农氏信息指数反映的遗传多样性上的平均遗传分化分别达35.6%和36.9%.     

大剂量Co~(60)γ-射線对海带配子体的影响

本实验观察了大剂量Co~(60)γ射线对海带多细胞雌、雄配子体的致死影响。 从实验的观察和对实验所得的材料分析,可以得出以下几点初步结论: (1)12万伦的Co~(60)γ射线没有立即引起配子体在射线下死亡,而仅仅少数个体的个别细胞,色素体开始有微小的变化。受照射各组配子体的死亡均发生在照射后第2天。 (2)海带多细胞雌配子体对辐射的抗性,要比海带单细胞雌配子体强。因为单细胞雌配子体在30天里的致死X射线剂量是6,000伦左右,但是12万伦的Co~(60)γ射线却不能在30天里使多细胞配子体全部死亡。 (3)海带雄配子体要比多细胞雌配子体对辐射敏感。因为受12万伦Co~(60)γ射线照射,在照射后经过12天,雄配子体已经全部死亡,但雌配子体却仅死亡60％。雄配子体对辐射的敏感性大于雌配子体。 (4)受大剂量γ射线照射后的海带配子体,不仅仅引起许多配子体的死亡,而且还严重地影响配子体的进一步发育。这表现在:受照射各组合子和孢子体的形成很少;孢子体细胞分裂不规则等等。并且大多数的合子和几乎全部的幼孢子体均相继发生死亡。 (5)受照射组的配子体细胞、合子和幼孢子体细胞的死亡过程相似。     

海带杂种优势苗种繁育技术研究

用生物反应技术进行海带配子体克隆的连续培养,将丝状体克隆细胞粉碎后,用两系法培育杂种优势苗种.实验结果表明,雌、雄海带配子体克隆细胞的日增重速率可达14.03%和13.87%,经42d培养增重6.9倍和6.8倍;雌、雄配子体克隆细胞杂交16d,排卵率为100%;培养40d后幼孢子体长度为2~3cm,经海上养殖实验,初步筛选出了一个较好的杂交组合.     

改进的海带夏苗培育法研究——三论海带育苗系统中脱苗和烂苗原因分析及其预防措施

我国常规的海带夏苗培育法,培育期比较长,成本较高,容易导致幼苗病烂。我们根据海带类在极地低温下能渡过漫长极夜的生态特性,改革了五十年代推广、沿用至今的夏苗培育法,即将生长良好的配子体贮存在0°～-2℃低温、无光、静水条件下,在出库下海前约70天将贮存的配子体恢复到常规夏苗培育条件时,便正常地生长发育为生产上所需要的健康     

基于MSAP技术的海带DNA甲基化初步研究

DNA甲基化在调节基因表达和控制细胞分化过程中扮演着重要的角色,其作为表观遗传修饰形式之一,已成为后基因组时代的研究热点。本文采用检测基因组CpG位点甲基化水平的MSAP技术(Methylation-Sensitive Amplification Polymorphism),对海带配子体与孢子体世代进行研究,研究发现:孢子体世代甲基化水平(25.64%)显著高于配子体世代(♂5.50%和♀4.48%);低温处理能引起DNA甲基化位点及比率的变化,直接反映在配子体克隆同步发育率的显著提高;对于海带孢子体世代不同组织部位甲基化程度的检测表明,同一株海带不同组织部位的甲基化程度不同(21.79%~29.49%),其中以Ⅳ型为主,同一组织部位在不同个体中甲基化程度也存在差异。研究为进一步从表观遗传学角度探讨海带不同倍型的发育机制和配子体对低温的应答机制奠定基础。     

激素对海带雄配子体的诱导作用

近年来,海带单倍体育种方面获得一些初步成果,方宗熙等从雌配子体进行孤雌生殖得到只产生雌性后代的海带,我们由雄配子体中培养出二棵成熟的大海带,其后代是雌雄都有,没有发现只产生雄性后代的海带。为了进一步研究海带单倍体育种上的性分化问题,需要培养出更多的由雄配子体产生的孢子体。采用一般的培养方法是无法得到的,只有应用植物激素来提高海带雄配子体的诱导频率。国外,研究激素对藻类的生长影响有一些报导,而在海带配子体诱导方面未见有发表的论文。     

4-碘苯氧乙酸在海带夏苗培育中的应用

本文报道了4—碘苯氧乙酸(4—IPOAA)在海带夏苗培育中应用的试验结果。4—IPOAA对海带配子体和幼孢子体的生长发育有着明显的影响,高剂量的4—IPOAA(500mg/L)对配子体的发育有明显的抑制作用;解除4—IPOAA对配子体的抑制,配子体在短期内即能正常排卵、排精并受精形成孢子体;低浓度的4—IPOAA(25mg/L以下)能促进幼孢子体的生长。这项试验结果表明,有可能利用4—IPOAA对配子体的抑制特性,来改进目前所采用的低温、自然光条件下培育海带夏苗的工艺。作者建议把海带夏苗培育工艺改为以下步骤:(1)在常温下采苗;(2)在18℃以下水温条件下培育配子体;(3)在配子体成熟前用4—IPOAA处理,使其停止发育,在较高水温(20℃左右)条件下静水培养被抑制的配子体;(4)在计划夏苗出库前40—50天,解除4—IPOAA对配子体的抑制,恢复最适条件下流水培育;(5)肉眼见苗后及时下海暂养。     

无机氮和磷对海带配子体生长发育的影响

氮(N)是蛋白质和核酸等重要有机物的成份。磷（P）是核酸等重要有机物的成份。它们在细胞代谢中发生重要的作用。海带或其他生物在代谢过程中都必须有一定数量的氮和磷的供应，才能正常地生长和发育。Drew(1910)的实验指出，在天然海水中加入一些无机盐的氮和磷可以促进糖海带配子体的生长，     

4-碘苯氧乙酸在海带夏苗培育中的应用

本文报道了4-碘苯氧乙酸(4-IPOAA)在海带夏苗培育中应用的试验结果。4-IPOAA对海带配子体和幼孢子体的生长发育有着明显的形响，高剂量的4-IPOAA(500mg／L)对配子体的发育有明显的抑制作用，解除4-IPOAA对配子体的抑制，配子体在短期内即能正常排卵、排精并受精形成孢子体，低浓度的4-IPOAA(25mg／L以下)能促进幼孢子体的生长。这项试验结果表明，有可能利用4-IPOAA对配子体的抑制特性，来改进目前所采用的低温、自然光条件下培育海带夏苗的工艺。作者建议把海带夏苗培育工艺改为以下步骤：(1)在常温下采苗；(2)在18℃以下水温条件下培育配子体；(3)在配子体成熟前用4-IPOAA处理，使其停止发育，在较高水温(20℃左右)条件下静水培养被抑制的配子体，(4)在计划夏苗出库前40—50天，解除4-IPOAA对配子体的抑制，恢复最适条件下流水培育，(5)肉眼见苗后及时下海暂养。     

培育海带夏苗新方法的初步实验

植物生长激素对藻类有种种不同的影响,Provasoli等(1974)对此曾做了综述。Dawes(1971)用IAA处理Caulerpa Prolifera,发现低浓度有促进生长发育的作用,而较高浓度则有抑制生长发育的作用。我们在进行4—碘苯氧乙酸(4—IPOAA)对海带配子体和幼孢子体生长发育作用的研究时发现:高剂量的4—IPOAA(500mg/L)对配子体的发育有着明显的抑制作用,配子体长期不能产生配子,但是,一旦解除4—IPOAA的抑制后,配子体在短期内就能进行正常的排卵、排精和受精,长出孢子体。低温、自然光、流水培育海带夏苗,是我国独创的海藻苗种生产方式,经过廿多年的实     

8种微藻的保存方法研究

选择固定化和低温弱光2种保存方法对8种微藻进行了研究。实验结果表明:不同的海洋微藻适合不同的保存方法。三角褐指藻、小球藻以及扁藻对这两种保存方法都比较适合,活化复苏快;蓝隐藻比较适合固定化保存,低温弱光保存后的再生能力相对较弱;等鞭金藻8701、紫球藻、牟氏角毛藻及茧形藻更适合低温弱光保存,其中等鞭金藻8701延缓期较长,经固定化保存后的藻悬液未能被活化,而经低温弱光保存后虽延缓期较长但复苏后生长良好。     

我国引种海带(Laminaria japonica)和长海带(L.longissima)配子体克隆的随机扩增多态性DNA分析

运用RAPD技术,对引种我国的海带(Laminaria japonica)和长海带(L.longissima)的22个配子体克隆进行分析。筛选的19条随机引物共获得252个位点.扩增片段大小在200～2000bp之间,多态性位点228个,占90.5%。配子体克隆遗传变异分析表明,长海带和海带的遗传多样性都比较高,两者之间的遗传分化较为明显,且种间变异大于种内变异。长海带和海带雄配子体克隆的遗传变异程度均低于雌配子体克隆。另外,两个种的雌、雄配子体之间均存在一定程度的分化,且长海带雌、雄配子体之间的遗传分化大于海带配子体。     

Co60γ射线对海带幼孢子体的影响

近几年来,有关X射线对海带配子体和幼孢子体的影响以及Co60γ射线对海带配子体的影响都有过报导。本实验在于观察Co60γ射线对海带幼孢子体的影响和目前条件下可能看到的作用机制。正如Gray(1959)所指出：尽管X射线对活细胞的作用问题已有60多年的研究,但对有关的机制还是所知极少。本实验所能探讨的只是一些可见的、也就是属于细胞水平的机制。