牙鲆dmrt1 基因的克隆及其与P450arom 基因的组织表达分析

通过基因组步移和3’RACE获得了牙鲆(Paralichthys olivaceus)dmrt1的cDNA全序列,该基因开放阅读框全长909bp,其编码的蛋白具有高度保守的DM结构域,5’UTR区含有性别相关转录因子Sox9和Sox5的结合位点。牙鲆dmrt1基因只在牙鲆的性腺中表达,且在精巢中的表达明显高于卵巢,表明牙鲆的dmrt1可能是一种性别相关基因。同时,对牙鲆的另一性别相关基因P450arom在成体各组织的表达分析结果表明,该基因除在牙鲆的性腺中有表达外,在肾脏、脾脏、鳃和脑等其他组织中也有不同程度的表达。牙鲆P450arom基因在性腺中的表达也存在两性差异,其表达模式与dmrt1的正好相反,在卵巢中的表达量明显高于精巢。     

许氏平鲉MyoD1s基因的鉴定及其调控成肌细胞分化功能的初步研究

在脊椎动物肌肉发育过程中,MyoD1基因可通过多个途径激活肌肉生长相关基因的表达,是成肌细胞增殖和分化的主要调控因子之一。目前关于经济鱼类MyoD1基因的研究主要集中在基因克隆和组织表达情况的分析,而对其功能的研究非常有限。本研究鉴定了许氏平鲉MyoD1基因两个拷贝,分别命名为MyoD1和MyoD1-like。MyoD1-like基因与MyoD1基因ORF序列存在19 bp的碱基差异,且MyoD1-like基因仅含有外显子而无内含子。qRT-PCR表达分析结果显示,MyoD1s基因在肌肉组织中的表达量显著高于其他组织,且MyoD1-like基因的表达显著高于MyoD1。原位杂交结果显示,MyoD1s基因的表达位置是肌纤维的边缘,即成肌细胞增殖、分化的位置。过表达许氏平鲉MyoD1-like基因可诱导小鼠成肌细胞发生分化,融合形成肌管。该结果为研究MyoD1基因在经济鱼类肌肉生长发育过程中的调控作用奠定了基础。     

牙鲆17β-HSD1基因克隆及其表达调控的初步研究

17β-羟类固醇脱氢酶1(17β-HSD1)的主要作用是将雌酮(El)转化为发挥功能的雌二醇(E2)。作者从牙鲆(Paralichthys olivaceus)性腺转录组数据库获得该基因的开放阅读框(ORF)序列,对其进行了验证,并分析了该基因在高温、外源性激素处理条件下性腺分化期性腺组织中的差异表达以及c AMP和转录因子(NR5a2和NR0b1)在精巢原代细胞中对该基因表达的作用。结果显示,牙鲆17β-HSD1基因的ORF为873bp,编码290个氨基酸,与其他鱼类的有很高的相似性。半定量RT-PCR结果表明,该基因在卵巢中高表达,精巢有少量表达,并且在雌性个体的鳃、头肾、肾、脾、胃和肠中也有表达。实时定量RT-PCR结果显示,该基因在卵巢或精巢分化的关键时期表达量较高;在精巢原代培养细胞中,外源信号分子c AMP及转录因子NR5a2可以显著下调17β-HSD1基因的表达(P0.05),且呈现剂量效应,转录因子NR0b1对该基因的调控也与剂量有关。作者推测牙鲆17β-HSD1基因在性腺分化中起一定的作用,其表达受到调控因子的作用,这些结果将有助于增加对鱼类性腺分化和发育的认识。     

真鲷（Pagrus major）vasa基因5′端启动子克隆及表达载体构建

采用染色体步移（Genome walking）的方法克隆了真鲷vasa基因5′侧翼序列,采用生物信息学方法分析潜在的顺式作用元件,并与斑马鱼核心启动子进行比对,在此基础上构建了绿色荧光蛋白表达载体。序列分析结果显示：克隆得到的真鲷vasa基因5′侧翼序列序列长度为2762bp,其中包括TATA-box、CAAT-box...     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)MHCⅡA基因全长cDNA的克隆与组织表达分析

采用同源克隆和末端快速扩增(RACE)方法, 得到1131bp的大菱鲆MHCⅡA全长cDNA片段.该序列包括720bp的开放阅读框(0RF), 75bp的5'末端非编码区(UTR)以及336bp的3'末端非编码区.利用CLASTAL W1.8软件进行MHCⅡA基因的氨基酸序列比对和同源性比较, 结果表明, 大菱鲆MHCⅡA与牙鲆MHCⅡA的相似性最高, 为69.8%, 与真鲷、鲈鱼和丽鱼的相似性次之, 分别为65.5%、69.6%和61.4%, 与人、鼠和鲨鱼MHCⅡA的相似性仅为19.8%、31.6%和26.9%.应用RT-PCR分析其组织表达发现MHCⅡA基因在正常大菱鲆组织中均表达, 但表达量在各个组织中不同, 其中在鳃、脾、头肾、心脏、小肠和皮肤中有较强的转录本, 中等程度表达于肝和血, 在性腺和肌肉中表达最弱.     

南极独角雪冰鱼(Chionodraco hamatus)miR-7132对红细胞发生的作用研究

micro RNA为短链非编码RNA,通过与靶基因3′UTR序列互补在转录后水平发挥作用。已有研究表明,micro RNA在红细胞发生过程中起着重要的调控作用。南极冰鱼是目前已知的唯一仅具有无功能性血红细胞的脊椎动物。前期研究提示,独角雪冰鱼(Chionodraco hamatus)头肾中高表达的micro RNAs可能抑制着冰鱼红血球的发生。本研究针对南极冰鱼头肾中高表达的miR-7132,运用斑马鱼显微注射、双荧光素酶报告系统,并结合靶基因预测等手段研究了miR-7132对血红细胞发生的作用机制。结果表明:斑马鱼胚胎注射miR-7132后,固蓝染色显示斑马鱼胚胎红细胞中血红蛋白的表达显著下降,这表明miR-7132的过表达抑制了血红细胞生成。通过转录组数据结合比对冰鱼的全基因组序列,获得了独角雪冰鱼血红细胞生成的血红素生物合成的限速酶(5′-aminolevulinate synthase 2,ALAS2)基因3′UTR序列。构建含ALAS2基因3′UTR序列的双荧光素酶报告质粒,并与miR-7132共转染293T细胞检测荧光素酶活性变化;构建包含绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达质粒与miR-7132共同注射斑马鱼胚胎,检测GFP荧光强度与蛋白表达量变化。结果显示,转染miR-7132的293T细胞荧光素酶相对活性显著降低,ALAS2基因是miR-7132的一个靶基因。斑马鱼体内注射miR-7132的GFP荧光强度显著降低,且GFP蛋白表达量显著减少。本研究揭示了miR-7132对血红细胞生成的抑制作用,miR-7132通过抑制ALAS2基因的表达而抑制南极冰鱼血红细胞的发生。     

牙鲆耐寒相关基因CIRP、HMGB1的克隆及表达特征分析

为鲆鲽鱼耐低温标记辅助育种研究和应用提供候选基因,并了解耐寒相关基因在低温下的表达图示,作者通过同源克隆以及5?/3?RACE的方法扩增得到了牙鲆(Paralichthys olivaceus)CIRP和HMGB1基因。组织表达谱分析显示,这两个基因在脑、鳃、心脏、肌肉、肝脏、肠等组织均有表达,但HMGB1基因在鳃中表达较弱。低温胁迫后,两基因随着胁迫时间的延长其表达量在肌肉中都出现先上升后下降的趋势:在0~12 h逐渐上升并达到最大值,然后下降恢复至最初水平。但在肝脏和脑组织中的变化趋势却不同,低温胁迫后0~2 h HMGB1基因在脑中的表达量上升至最高,然后下降至最初水平,在肝脏中变化不大。而CIRP基因在低温胁迫后0~2 h在肝脏中表达量处于上升趋势,然后下降至初始水平,在脑中变化不大。由此推测,这两个基因在低温条件下都参与了机体对外界的抵抗,特别是在抵抗外界寒冷的主要组织—肌肉中发挥作用,可能共同参与了机体的免疫反应,对低温胁迫环境下的鱼体进行保护,可以作为鱼类耐低温标记筛选的候选基因。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)双链RNA依赖的蛋白激酶R(PKR)基因克隆和实时定量表达分析

采用RACE方法克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)PKR基因(CsPKR), 获得了CsPKR全长cDNA序列为2907bp, 其中包含1959bp的开放阅读框, 100bp的5′非编码区和848bp的3′非编码区。保守结构域分析显示推导的CsPKR氨基酸在N端存在两个特异的dsRBD(dsRNA binding domain dsRBD)结构域, 在C端具有多个保守的激酶活性位点, 包括ATP结合位点和底物配体结合位点, 以及活性环结构A-loop。系统进化树分析显示鱼类、两栖类、鸟类及哺乳类的PKR具有共同的进化起源, CsPKR与牙鲆PKR的亲缘关系最为密切。荧光定量PCR结果显示, CsPKR基因在健康鱼多个组织中广泛表达, 在脑中的表达最高, 头肾中表达最低。经鳗弧菌和淋巴囊肿病毒分别感染后, CsPKR基因在免疫相关组织中呈现上调表达趋势, 其中感染鳗弧菌12h后在血液中表达量较对照组上升了9.28倍, 在感染淋巴囊肿病毒24h后, 在肝脏中的表达达到最大, 为对照组的9.97倍。以上结果暗示CsPKR基因在半滑舌鳎响应细菌和病毒免疫应答中起重要作用。     

牙鲆Lhx1基因的克隆和表达分析

Lhx1基因对于哺乳动物卵巢缪勒氏管的形成具有重要作用, 但鱼类中的报道仅限于其在体轴和肾脏形成中的作用, 尚未见到其与性别及性腺发育相关的报道。本研究克隆获得了牙鲆(Paralichthys olivaceus)Lhx1a和Lhx1b开放阅读框(ORF)序列, 长度分别为1224 bp 和1206 bp (GenBank 注册号为:JX999940、JX999941), 同源序列比较显示牙鲆Lhx1a和Lhx1b基因均具有两个LIM 及一个HOX 结构域, 符合Lhx1进化保守性。这两个基因在牙鲆雌、雄成鱼各组织RT-PCR 差异表达谱不尽相同, Lhx1a在精巢中弱表达, 卵巢中不表达, 在其他组织中雌、雄表达谱差异不大, 都只在脑和眼组织有弱表达;而Lhx1b的表达在性腺中相对较高, 且卵巢的表达量高于精巢。进一步检测牙鲆Lhx1a和Lhx1b在雌、雄性腺发育各期的表达谱, 发现这两个基因表达集中于Ⅲ、Ⅳ期性腺, Lhx1a在精巢中弱表达, Lhx1b卵巢中的表达明显高于精巢, 而在Ⅰ、ⅡII、Ⅴ期性腺几乎均不表达。由此推断牙鲆Lhx1a 和Lhx1b均为性别相关基因, 但在两性性腺发育中的作用可能各有不同。     

大黄鱼(Larimichthys crocea)I型干扰素基因的特征与表达分析

采用RT-PCR和RACE-PCR技术克隆了大黄鱼(Larimichthys crocea)Ⅰ型干扰素基因全长cDNA序列及其基因组序列,并利用荧光定量PCR技术研究了该基因在大黄鱼不同组织中的表达谱,以及副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、LPS、polyI:C刺激后大黄鱼脾脏、肝脏和头肾组织中该基因在转录水平的表达变化。结果表明,大黄鱼Ⅰ型IFN基因全长cDNA为878bp,开放阅读框558bp,编码185个氨基酸。推测的大黄鱼Ⅰ型IFN氨基酸序列N端含有20个氨基酸的信号肽,其后包含一个保守的IFabd结构域。大黄鱼Ⅰ型IFN基因包含5个外显子,4个内含子,在大多数组织和细胞中都有表达,其中在血细胞中表达量最高,肌肉中表达量最低。PolyI:C刺激可诱导大黄鱼Ⅰ型干扰素基因在脾脏、头肾和肝脏中的表达量显著上调;LPS刺激可诱导大黄鱼Ⅰ型干扰素基因在脾脏和肝脏中的表达量显著上调;灭活的副溶血弧菌可诱导大黄鱼Ⅰ型干扰素基因在头肾和肝脏中的表达量显著上调。     

杜氏盐藻叶绿体ATP合酶α亚单位基因启动子的克隆及初步功能分析

采用DraⅠ,EcoRⅤ,PvuⅡ,ScaⅠ,SmaⅠ和StuⅠ六种内切酶消化杜氏盐藻（Dunaliella salina）叶绿体基因组DNA,与相应DNA接头连接,构建成无载体连接的盐藻叶绿体Genome Walker DNA文库。利用长距离PCR（long distance-polymerase chain rea...     

翘嘴红鲌(Erythroculter ilishaeformis)果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(ALDO-C)基因定位、克隆及表达分析

翘嘴红鲌(Erythroculterilishaeformis)是大型淡水鱼类鳊鲌亚科(Abramidinae)中最大的一种鱼,具有较高的经济价值。但其饲料转化率及抗病性研究相对较少,相关基因信息缺乏。本研究以翘嘴红鲌为对象,利用RACE技术克隆翘嘴红鲌果糖-1.6-二磷酸醛缩酶(ALDO-C)基因,该基因cDNA全长1945bp,其中ORF区975bp,编码325个氨基酸.5′非编码区933bp.3′非编码区37bp。通过实时荧光定量PCR检测了ALDO-C在不同组织中相对表达水平。发现ALDO-C基因在翘嘴红鲌的肾、肝、肌肉、性腺中均有表达,且在肾中表达量最高,显著高于其他组织。同时采用石蜡切片、H.E染色和原位杂交染色,观察分析翘嘴红鲌的肾组织显微结构和ALDO-C基因的表达定位,结果表明,ALDO-C在鱼类肾单位和集合管结构、调节肾组织水平衡及抗病性方面有重要作用。可以考虑将翘嘴红鲌醛缩酶C基因作为生长发育及抗病性相关的候选基因,用于翘嘴红鲌鱼的分子辅助育种,以期为今后的研究提供理论基础。     

Cloning of cytochrome P450 1A (CYP1A) genes from the hermaphrodite fish Rivulus marmoratus and the Japanese medaka Oryzias latipes

To use two small fish Rivulus marmoratus (Cyprinodontiformes, Rivulidae) and the Japanese medaka Oryzias latipes (Belloniformes) as testing models in molecular ecotoxicology, we have cloned the cytochrome P450 1A (CYP1A) gene after screening of both genomic DNA libraries, and sequenced 11,863 and 7,243 bp including all the exons and introns with promoter regions, respectively. The Rivulus and the medaka CYP1A gene consisted of seven exons (including non-coding exons) with high homology to mammals. In the promoter region, Rivulus CYP1A gene has seven xenobiotic response elements (XREs) and two metal response elements (MREs), while the Japanese medaka CYP1A gene has six XREs and four MREs. Interestingly, medaka CYP1A gene has a number of MREs at the promoter, which may affect its response on metal exposure. We describe here the gene structure of both fish CYP1A genes.     

黄鳍棘鲷IGF-2基因克隆及IGF-1/2在胚胎发育过程中的表达特性分析

类胰岛素样生长因子（Insulin-like Growth Factors,IGFs）是生物生长轴下游的关键调控因子,其对促进细胞分化与机体生长具有重要的作用。为深入研究IGF-1和IGF-2基因在黄鳍棘鲷（Acanthopagrus latus）胚胎发育过程中表达机制及可能发挥的作用,本文利用分子克隆技术分离鉴定了黄鳍棘鲷IGF-2基因cDNA序列,并对其进行了生物信息学分析。同时,在对其胚胎发育过程连续观察的基础上,利用实时荧光定量PCR的方法,测定并分析了黄鳍棘鲷胚胎发育不同时期IGF-1和IGF-2基因mRNA的表达情况。实验结果表明,IGF-2基因cDNA序列全长为1 736 bp,其中开放阅读框648 bp,共编码215个氨基酸。多重序列比对分析发现,黄鳍棘鲷IGF-2氨基酸序列与同属鲷科鱼类的大西洋鲷（Sparus aurata）相似性为99.95%,与三长棘赤鲷（Pagrus auriga）相似性为98.14%,与其他硬骨鱼类的IGF-2也有较高的相似性,显示出IGF-2在硬骨鱼类进化关系上的保守性。在水温为（26.5±0.5）℃,pH为8.0和盐度为28的条件下,黄鳍棘鲷由受精卵至孵化出膜历时25.5 h。实时荧光定量PCR结果显示:IGF-1和IGF-2基因mRNA 在黄鳍棘鲷胚胎发育不同时期均有表达。IGF-1基因表达量呈现先升高后降低的趋势,在肌肉效应期达到最高表达量;IGF-2基因表达量呈现先升高后降低再升高的趋势,在原肠期、肌肉效应期与出膜后3 d表现高表达量,这表明IGF-1和IGF-2基因在胚胎发育时期可能发挥重要作用。     

南移养殖仿刺参（StichopusjaponicusSelenka）铁蛋白基因的克隆及表达特征分析

采用cDNA文库、RACE、荧光定量PCR和Westernblot技术,克隆了南移养殖仿刺参铁蛋白基因的全长序列,并对其表达特征进行了研究。结果表明,南移养殖仿刺参铁蛋白cDNA全长1222bp,包括187bp的5’UTR;513bp的3’UTR和编码173个氨基酸残基的522bp的开放阅读框。诸如铁结合序列标签和铁调...     

黄条(鰤)(Seriola aureovittata)MyHC基因克隆及其在早期发育阶段表达研究

为解析肌球蛋白重链(MyHC)基因在黄条鰤(Seriola aureovittata)生长发育过程中作用机制,本研究采用RACE技术,克隆了黄条鰤MyHC基因全长cDNA序列,采用荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对MyHC在黄条鰤不同组织、胚胎发育过程以及仔稚幼鱼发育过程中的表达特征进行了研究。结果表明:黄条鰤MyHC基因全长为6143bp,开放阅读框为5811bp,编码了1936个氨基酸,由3个保守结构域组成即MYSc-classⅡ、Myosin taill和SH3;系统进化树分析显示黄条鰤MyHC与高体鰤进化关系最近。qRT-PCR分析发现黄条鰤MyHC在各组织中均有表达,但在肌肉中表达量最高(P0.05);随着黄条鰤胚胎发育的进行,MyHC在16细胞期之前表达量较高,在胚体下包2/3时期表达量显著升高,且在孵化期达到峰值(P0.05:);在仔稚幼鱼发育阶段,MyHC在孵化后20d后表达量显著升高,30d表达水平达到峰值(P0.05),随后的35d到40d表达水平略有下降但仍保持较高表达趋势,黄条鰤MyHC表达具有发育阶段表达的特异性。MyHC表达特征揭示其参与了调控黄条鰤的早期生长发育。     

短沟对虾和斑节对虾酚氧化酶原基因的克隆和序列分析

采用RT-PER原理和长片段扩增技术克隆短沟对虾和斑节对虾酚氧化酶原基因。设计合成特异引物、提取血细胞总RNA，反转录后扩增获得的特异片段回收并克隆到pGEM-TEasyVector系统的T载体上，重组子进行碱基序列测定。结果表明，所克隆的短沟对虾酚氧化酶原基因含起始密码子A1B到终止密码子TGA的2055bp，编码684个氨基酸。斑节对虾酚氧化酶原基因含ATG到TGA的2061bp，编码686个氨基酸。短沟对虾酚氧化酶原推算分子量为78153Da，等电点pI为6．25；斑节对虾则为78581Da，pI为5．83，用DNA分析软件分析显示两种对虾酚氧化酶原基因具有高度的同源性，二者的碱基和推测的氨基酸序列同源性分别为93％和92％；对虾与其他节肢动物酚氧化酶原基因的同源性的高低与种类间亲缘关系相关；不同种类间酚氧化酶活性中心重要组成部分的2个铜结合位点、位于铜结合位点内的6个组氨酸以及与铜结合位点相邻的氨基酸序列高度保守。