鱼类多聚免疫球蛋白受体(pIgR)研究进展

鱼类皮肤、鳃、消化道等黏膜相关淋巴组织及其表面的黏液是鱼类抵御外界病原入侵的第一道防线,而其局部的特异性免疫应答对病原体的抵御更加重要。黏膜免疫系统以分泌型抗体(SIgs)为主要的防御因子,多聚体IgM、IgT等黏膜免疫球蛋白通过多聚免疫球蛋白受体(pIgR)介导的转胞吐作用被转运穿过黏膜上皮细胞,以SIgs形式分泌到黏膜表面,在鱼类黏膜免疫防御中发挥重要作用。硬骨鱼类pIgR研究在近年来成为日渐活跃的领域,本文综述了有关鱼类pIgR基因与结构、表达分布、功能及表达调节等方面的研究进展,有助于促进对pIgR在鱼类黏膜免疫中作用的理解。     

牙鲆多聚免疫球蛋白受体基因的克隆、表达及鉴定

采用PCR扩增、构建重组高效表达载体的方法,进行了牙鲆多聚免疫球蛋白受体(pIgR)基因的克隆、原核表达研究,并利用SDS-PAGE、western-blot及ELISA方法对纯化的重组蛋白特性进行了分析。结果表明,PCR扩增出pIgR开放阅读框(ORF)基因全长为1005 bp,所构建的pET-32(a)-pIgR重组质粒经PCR和双酶切鉴定含有ORF全长基因。SDS-PAGE结果表明,表达的目的蛋白相对分子质量为58 kDa,与理论预期值一致,IPTG诱导6h后表达量趋于稳定,经亲和层析纯化得到高纯度的重组蛋白。Western-blot结果表明,重组pIgR能够与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性反应;ELISA结果表明重组pIgR能够与牙鲆IgM发生特异性结合。本研究获得了纯化的重组pIgR,证明其具有IgM结合活性,为下一步研究牙鲆pIgR的转运机制及在黏膜免疫防御中的作用机理提供了分子基础。     

花鲈Argonaute基因家族的快速进化与表达分析

RNA干扰(RNA interfering,RNAi)是广泛存在于动植物等生物中的一种高度保守、序列特异的RNA降解机制。Argonaute蛋白是RNAi途径的关键组成部分,其结构、功能和进化模式在无脊椎动物中已得到广泛研究,但在脊椎动物特别是硬骨鱼中的报道还十分有限。本研究从已测序物种的基因组中鉴定了12种哺乳动物和15种硬骨鱼的Argonaute家族基因。通过拷贝数、系统发生和共线性分析,本文验证了在脊椎动物中存在两个保守的Argonaute亚家族,即miRNA/siRNA介导的AGO亚家族和piRNA介导的PIWI亚家族。硬骨鱼类多样的繁殖发育方式是其生殖能力最大化的适应机制。为比较硬骨鱼中piRNA途径和miRNA/siRNA途径的功能和进化差异,本文对硬骨鱼(包括花鲈)和哺乳动物中的piRNA途径基因进行了全面的分子进化分析,并将这些基因与miRNA/siRNA途径中的Ago基因进行比较。结果表明硬骨鱼类的piRNA途径具有快速进化的特征,这可能适应了硬骨鱼基因组转座子数量大、种类多的特点。通过转录组分析,我们进一步证实了piRNA途径基因在四种硬骨鱼中的生殖特异性表达,预示其可能在配子发生过程中发挥作用。本研究为进一步解析硬骨鱼中piRNA途径基因的进化模式及其在鱼类生殖发育中的调控作用提供理论基础。     

外源污染物对硬骨鱼甲状腺干扰作用机制的研究进展

甲状腺激素在鱼类生长发育、变态、生殖、渗透调节以及摄食和营养代谢中发挥着重要作用,外源化合物对硬骨鱼的甲状腺干扰作用会导致发育和孵化延迟、运动性降低。本文首先对鱼类甲状腺激素的中枢调控、合成、转运、代谢和发挥作用的相关过程进行简要介绍,随后从核受体介导途径、非受体介导途径两个方面综述了外源污染物对硬骨鱼甲状腺的干扰作用机制,最后从物种特异性、检测指标、膜受体介导途径三个方面提出了目前研究的不足之处以及解决方法,以期为今后探究外源污染物对鱼类甲状腺系统干扰作用机制的研究提供更多的参考。     

牙鲆血清中免疫球蛋白M的分离及其测定

通过提取健康养殖牙鲆(Paraliehthys olivaceus)血清中的免疫球蛋白(Ig),并测定其相对分子质量,其中重链(H链)的相对分子质量为74．2ku,轻链(L链)的相对分子质量为23．8ku。用纯化的牙鲆血清中的Ig作抗原,制备多克隆抗体,确立牙鲆血清中免疫球蛋白的最佳测定方法。     

半滑舌鳎des基因的表达及其启动子功能分析

利用NCBI上已经发表的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)基因组及转录组序列,发现了半滑舌鳎两个有结蛋白(Desmin)基因(des和des-like),且des-like具有两个剪切型des-like_X1、des-like_X2。系统进化树及基因结构分析发现,半滑舌鳎的des基因和des-like基因分别与硬骨鱼的des基因和des-like基因聚为一支,物种间des和des-like氨基酸序列相似性分别在90%和85%以上。保守性与染色体共线性分析发现,半滑舌鳎的des基因和哺乳动物的des基因具有相同的起源,而其des-like基因是通过硬骨鱼的第三次全基因组复制获得的。qRT-PCR的检测分析发现,des基因在肠和心脏中表达量较高,在肌肉中只是痕量表达;而des-like基因则在心脏和肌肉中表达最高,在肠中痕量表达,说明des与des-like已经出现了功能的分化而且可能存在功能上的互补效应。有趣的是,des-like_X1只在心脏中表达,本研究推测des-like_X1对于半滑舌鳎的心脏发育具有重要作用。des基因呈现母源性表达,而des-like在胚胎发育早期表达量较低,从神经胚后表达量开始升高,此时是肌节与心脏发育的时期,说明des-like可能参与胚胎发育时期的肌节与心肌发育。此外,通过PCR克隆了半滑舌鳎结蛋白基因不同长度的启动子片段,并对其进行启动活性分析。结果表明,半滑舌鳎des基因ATG上游长度为667 bp的片段是其核心启动子,为进一步研究des基因的功能奠定了基础。     

清热解毒化浊片对内毒素性肝损伤大鼠肠道sIgA、pIgR的影响

目的：观察清热解毒化浊片对内毒素性肝损伤大鼠肠黏膜免疫球蛋白A（sIgA）、多聚免疫球蛋白合体（pIgR）的影响。方法：以高脂饮食加白酒灌胃法建立内毒素性肝损伤大鼠模型,将造模成功的18只大鼠随机分为模型组、治疗组、阳性对照组,并设正常组,每组各6只。药物干预4周后观察各组大鼠肝功能［丙氨酸氨基转移酶（AST）、天冬氨酸氨基转移酶（ALT）］,sIgA、pIgR水平,以及肝脏组织病理。结果：与模型组比较,治疗组AST、ALT均下降（P＜0.05）,但较正常组高（P＜0.05）,sIgA、pIgR均升高（P＜0.01或P＜0.05）,但较正常组低（P＜0.01或P＜0.05）;与模型组相比,治疗组肝脏组织肝细胞脂肪变及炎性细胞浸润程度均有改善。结论：清热解毒化浊片能改善内毒素性肝损伤大鼠的肝功能,减轻其炎性细胞浸润及肝细胞脂肪变程度,作用机制与减少肠黏膜sIgA、pIgR的表达、保护肠黏膜免疫屏障有关。     

大菱鲆mIgD重链基因的克隆与表达分析

利用RACE技术克隆获得大菱鲆(Scophthalmus maximus)膜结合型免疫球蛋白D(Membrane-bounded Ig,mIgD)重链基因的cDNA序列全长,该基因全长3 357bp,包含1个2 997bp的开放阅读框,编码999个氨基酸,基因结构为VDJ-μ1-δ1-δ2-δ3-δ4-δ5-δ6-δ7-TM。重链恒定区δ1~δ7氨基酸序列同源比对结果显示,其与庸鲽(78%)、鳜(71%)、牙鲆(68%)具有较高的同源性;多序列比对结果显示,大菱鲆mIgD的每个δ恒定区内均存在色氨酸与半胱氨酸保守位点。利用邻位相连法构建硬骨鱼类免疫球蛋白系统发育树,结果显示,鱼类IgD聚为一大支,大菱鲆IgD与庸鲽及牙鲆聚为一支。利用RT-PCR分析了大菱鲆IgD重链基因的组织差异表达,结果显示,其在外周血白细胞、脾脏、前肾及中肾组织中具有较高的表达。将大菱鲆腹腔注射福尔马林灭活鳗弧菌后,实时荧光定量PCR检测其前肾组织中mIgD重链基因应答表达量,结果显示,mIgD重链基因在注射鳗弧菌后呈显著下调趋势,在注射后8h时降至最低值,其相对表达量约为对照组的1/28,然后呈逐渐恢复上调趋势,在48h时mIgD相对表达量与对照组无显著差异。     

栉孔扇贝骨形态发生蛋白Ⅰ型受体基因的克隆及表达分析

首次在栉孔扇贝(Chlamys farreri)中克隆了骨形态发生蛋白I型受体(Bone morphogenetic protein type Ⅰ receptor,cfBMPR1)基因cDNA全长序列,该基因开放阅读框长1560bp,编码为519个氨基酸。实时荧光定量反转录PCR(real-time qRT-PCR)分析结果显示,cfBMPR1基因在栉孔扇贝受精卵、4细胞期、囊胚、原肠胚、担轮幼虫期、D型幼虫期和壳顶幼虫期等发育时期均有表达,其中胚胎时期表达量高于幼虫期,提示该基因在扇贝早期发育及幼虫形态形成过程中的重要作用;在成体组织,包括外套膜、鳃、性腺、肾、横纹肌和消化腺中也均检测到了cfBMPR1的表达,其中以性腺和横纹肌中表达量最高,暗示其参与了扇贝包括繁殖和肌肉生长发育等在内的多种生物学过程。研究结果为进一步研究TGF-β信号通路在扇贝生长发育中的功能提供了基础数据。     

大黄鱼FcRs基因的克隆及其在免疫应答中的初步功能分析

Fc受体（Fc Receptors,FcRs）是一类与免疫球蛋白的Fc段特异性结合,介导多种免疫反应的受体分子。本研究克隆得到了大黄鱼（Larimichthys crocea）6个FcRs基因,分别是LcFcγRⅠL、LcFcγRⅡ、LcFcγRⅡaL、LcFcγRⅢ、LcFcRL5和LcFcRLA,其开放阅读框（ORF）大小分别为1 070、2 486、1 145、 1 955、4 125、1 659 bp。大黄鱼的6个LcFcRs都具有一个信号肽和2~8个免疫球蛋白（Ig）结构域,LcFcγRⅡ、LcFcγRⅢ和LcFcRL5还包含一个跨膜区。实时荧光定量PCR结果显示LcFcγRⅠL、LcFcγRⅡ、LcFcγRⅡaL和LcFcγRⅢ主要在鳃或肠等黏膜组织中表达,而LcFcRL5和LcFcRLA主要在脾和头肾等系统免疫组织中表达;革兰氏阴性细菌细胞壁脂多糖（LPS）刺激后,这6个LcFcRs基因头肾和脾脏中的表达在不同时间出现了显著上调;双链RNA病毒类似物Poly(I:C)刺激后,6个LcFcRs在头肾和脾脏中的表达出现不同程度的上调,而LcFcRL5在脾脏中的表达显著上调,在头肾中则明显下调,提示大黄鱼FcRs可能在LPS和Poly(I:C)诱导的免疫反应中起着重要但又不同的作用。