麻痹性贝毒毒素研究Ⅱ.麻痹性贝毒毒素纯化产品的高效液相色谱和质谱分析

麻痹性贝毒 (ParalyticShellfishPoisoning ,PSP)毒素由石房蛤毒素 (saxitoxin ,STX)及其衍生物组成 ,目前已发现 2 0余种 ,在赤潮研究、分子生物学和神经生物学基础研究、医药、军事防化等方面均有应用潜力。由于PSP毒素的稀有来源和国际社会对STX交易的禁止 ,限制了国内PSP毒     

麻痹性贝毒毒素研究Ⅰ.塔玛亚历山大藻的麻痹性贝毒毒素对运动神经末梢和全细胞钠离子通道的抑制作用研究

麻痹性贝毒(Paralytic Shellfish Poisoning，PSP)毒素由石房蛤毒素(saxitoxin，STX)及其衍生物组成，目前己发现20余种，在赤潮研究、分子生物学和神经生物学基础研究、医药、军事防化等方面都有应用潜力[其结构、类型和应用见本集刊王云峰等(2003)“麻痹性贝毒毒素的应用研究进展”一文]。由于PSP毒素的稀有来源和国际社会对STX交易的禁止，限制了国内PSP毒素应用及研究的全面深入展开，因此本文作者对PSP毒素进行了制备，并采用不同方法对制备的PSP毒素进行了研究。 PSP毒素能够选择性地可逆抑制可兴奋膜的电压依赖钠离子通道的开放，从而阻止神经冲动的发生和传导，使神经、肌肉丧失兴奋性(Frace et al.，1986；Penzotti et al.，1998)。本文利用神经束膜下记录和全细胞膜片钳技术，报道了从塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)中提取的PSP粗毒素对小鼠运动神经末梢膜电流和NG108-15细胞钠离子通道的作用研究结果，并与STX标准毒素的作用结果进行了比较。 NG108-15细胞是由小鼠神经母细胞瘤和大鼠胶质细胞瘤融合的杂交细胞，经分化剂分化后，显示诸+L1196如兴奋性、合成和释放乙酰胆碱、与培养肌细胞形成突触联系等多种神经细胞的基本特性(Hamprcht，1977)和Na+、K+、Ca2+等多种离子通道，已作为神经细胞模型被广泛应用于分析药物对离子通道作用的研究(Enomoto et al.，1992； Docherty et al.，1992；Shi et al.，1993；Hu et al.，1997a；Hu et al.，1997b)；发育出具有Na+内流支持的锋电位(Hamprecht,1977)，该电位是分析作用于膜钠离子通道药物的好材料。     

麻痹性贝毒毒素研究Ⅰ.塔玛亚历山大藻的麻痹性贝毒毒素对运动神经末梢和全细胞钠离子通道的抑制作用研究

麻痹性贝毒 (ParalyticShellfishPoisoning ,PSP)毒素由石房蛤毒素 (saxitoxin ,STX)及其衍生物组成 ,目前已发现 2 0余种 ,在赤潮研究、分子生物学和神经生物学基础研究、医药、军事防化等方面都有应用潜力 [其结构、类型和应用见本集刊王云峰等 (2 0 0 3 )“麻痹性贝毒毒素的     

麻痹性贝毒毒素的应用研究进展

由于有害赤潮的发生日趋频繁，对养殖业、自然生态系统和人类健康的危害越来越大，造成的经济损失也逐渐增加，因而有害赤潮问题成为人们关注的焦点。藻毒素是有害赤潮致害的重要因子之一，而麻痹性贝毒(Paralytic Shellfish Poisoning，PSP)毒素又是藻毒素中分布最广、危害最大的一类毒素。随着科学家们对PSP毒素的来源(Steidinger，1993)、结构和作用方式(Penzotti et al.,1998)的深入研究，PSP毒素在赤潮研究、分子生物学和神经生物学基础研究、医药、军事防化等的应用也逐渐受到重视。本文作者针对这些问题进行了综合评述，以期为深入开展PSP毒素应用研究提供参考依据。     

液相色谱-四极杆/线性离子阱复合质谱测定双壳贝类中麻痹性贝类毒素

采用液相色谱-四极杆/线性离子阱复合质谱,建立了双壳贝类中13种麻痹性贝类毒素的定性确证和定量分析方法。样品经乙酸水溶液提取,石墨化碳黑固相萃取净化,亲水性液相色谱柱(hydrophilic interaction liquid chromatography,HILIC)分离;质谱采集使用独有的多反应监测-信息依赖性采集-增强子离子扫描模式。13种目标物线性范围相关系数不低于0.99,检出限为62.0μg STX eq/kg,其中石房蛤毒素(Saxitoxin,STX)、新石房蛤毒素(Neosaxitoxin,NEO)、脱氨甲酰基石房蛤毒素(Decarbamoylsaxitoxin,dc STX)、脱氨甲酰基新石房蛤毒素(Decarbaoylneosaxitoxin,dc NEO)以及N-磺酰氨甲酰基类毒素5(Gonyautoxin-5,GTX5)为10.0μg/kg,膝沟藻毒素12(Gonyautxins-1-2,GTX12)为12.0μg/kg,膝沟藻毒素34(Gonyautxins-3-4,GTX34)、N-磺酰氨甲酰基类毒素2(N-Sulfocarbamoylgonyautoxin-2,C2)和脱氨甲酰基膝沟藻毒素3(Decarbamoylgonyautoxins-3,dc GTX3)为4μg/kg,N-磺酰氨甲酰基类毒素1(N-Sulfocarbamoylgonyautoxin~(-1),C1)和脱氨甲酰基膝沟藻毒2(Decarbamoylgonyautoxins-2,dc GTX2)为13μg/kg。基质加标平均回收率为(79.6±10.4)%—(98.8±6.54)%。该方法能够有效降低贝类基质抑制效应,简化前处理过程并通过减少样品稀释倍数来显著提高方法灵敏度,使同分异构体达到基线分离,适用于双壳贝类中麻痹性贝类毒素的监控分析。     

石房蛤毒素

石房蛤毒素[Saxitoxin(STX)],又叫甲藻毒素,最早是从阿拉斯格奶油蛤(Saxidomus giganteus),有毒的加州贻贝(Mytilus californianus)和膝沟藻(Gonyaulax catenella)中分离到的神经毒素,是已知的最毒的非蛋白毒素之一。此毒素也在枣形膝沟藻(Gonyaulax tamarensis)的水花(赤潮)形成时,从陈年扇贝中提取到,海产甲壳动物黄蟹(Zosinus aenus Amanioshina)中也有存在。     

中国沿海部分海域麻痹性贝毒研究

采用美国分析化学家协会推荐的小白鼠生物检测法,对产于大连、深圳、广西北海和福建厦门海域的贝类进行麻痹性贝毒检测,选取部分有毒样品进行高效液相色谱毒素成分分析。小白鼠生物检测法检测结果表明,样品消化腺毒素含量为0—25.3MU/g,剔除消化腺的其他贝类软组织均没有检测到PSP的存在。消化腺和其他软组织的毒力加权平均值为0—2.6MU/g,低于联合国粮农组织制定的贝类安全食用标准的限定值4MU/g。大连海域染毒样品的检出率为50%,在四个海域中最高,福建海域检出率则最低。高效液相色谱毒素成分分析结果表明,深圳和广西北海海域贝类所含PSP成分相似,包含有C毒素(C1/2),GTX毒素(GTX1—4)和STX,而大连海域贝类含有的毒素组分与前两者有较大差异,且随贝类采集的不同时期而变化。     

麻痹性贝毒毒素的应用研究进展

由于有害赤潮的发生日趋频繁 ,对养殖业、自然生态系统和人类健康的危害越来越大 ,造成的经济损失也逐渐增加 ,因而有害赤潮问题成为人们关注的焦点。藻毒素是有害赤潮致害的重要因子之一 ,而麻痹性贝毒 (ParalyticShellfishPoisoning ,PSP)毒素又是藻毒素中分布最广、危害最大的一类毒素。随着科学家们对PSP毒素的来源 (Steidinger,1 993 )、结构和作用方式 (Penzottietal.,1 998)的深入研究 ,PSP毒素在赤潮研究、分子生物学和神经生物学基础研究、医药、军事防化等的应用也逐渐受到重视。本文作者针对这些问题进行了综合评述 ,以期…     

福建漳州海域麻痹性贝毒的污染状况调查

本文通过对漳州海域的养殖区栉孔扇贝扣僧帽牡蛎为期1a的麻痹性毒素（PSP）污染状况的调查分析，以了解贝类海产品的安全性．贝毒测定按照AOAC小白鼠法进行，利用高效液相色谱（HPLC）进行贝毒成分分析．结果表明：漳州海域的栉孔扇贝为该海域轻微PSP染毒贝类，含量为1．83～3．23MU／g；漳浦古雷和东山铜陵的栉孔扇贝样品检出率分别为66．7％和16．7％．高效液相色谱分析表明，样品中PSP成分为B1、GTX1／4、GTX2／3及STX和C毒素．漳州海域贝类PSP含量很低，未超出安全食用标准；但毒素分布存在季节差异，春季检出率较高．因此有针对性的加强贝毒监测非常必要．     

贝类麻痹性毒素的昆明小鼠测定法若干问题探讨

探讨了昆明小鼠用于贝类麻痹性毒素测定的3个问题，（1）石房蛤素素（Saxitoxin简称STX）剂量明小鼠死亡时间为典型关系，其曲线方程为Y=7.1271X^-0.7497,(2)把死亡时间t变为时间的倒数1/t,STX的毒性，MU取对数为logMU ,再进行回归分析得斜率和截距分别为140和0.2,相关系数为0．97，直线回归方程Y＝140X－0．2，所得直线回归方程与AOAC方法中Sommer's表之STX－小鼠死亡时间直线回归方程Y＝145X－0．2比较相近。（3）通过系列实验，求得昆明小鼠一个鼠单位所代表的毒素剂量为0.189ugSTX.     

渤海裸甲藻和链状亚历山大藻的麻痹性贝毒毒素分析

目的:分析渤海裸甲藻(Gymnodinium sp.)和链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)的麻痹性贝毒毒素,为渤海天津海域的赤潮研究积累基础数据。方法:通过实验室培养裸甲藻和链状亚历山大藻,选取对数生长期、平台生长期的裸甲藻以及平台生长期的链状亚历山大藻,利用高效液相色谱法(HPLC)对这两种微藻进行麻痹性贝毒(PSP)毒素分析。结果:裸甲藻细胞内不含有麻痹性贝毒(PSP);链状亚历山大藻细胞内含有C毒素和GTX1-4毒素,该微藻每个细胞毒素含量约为10.81 fmol/cell。结论:裸甲藻细胞内虽不含有麻痹性贝毒(PSP),但不能排除其含有其它毒素的可能。链状亚历山大藻细胞内含有麻痹性贝毒(PSP),属于有毒微藻,需要对其进行密切监测。     

基于SPE与SPATT的水体中麻痹性贝类毒素检测方法构建与应用

为实现麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish poisoning,PSP)的实时监控与提前预警,本研究构建了基于固相萃取技术(solid phase extraction,SPE)与固相吸附毒素跟踪技术(solid phase adsorption toxin tracking,SPATT)的水体中PSP检测方法,重点优化了吸附材料及前处理方法,评价了回收率、检出限等指标,并将方法应用于2019年春季秦皇岛山海关海域PSP消长过程的监测中,比较评估了两种方法的监控预警效果。结果表明:SPE方法选用ENVI-Carb 500mg/6mL固相萃取柱,过样体积为50mL,13种PSP组分的平均回收率为82.2%±10.0%、检出限为4.0-20.0ng/L;SPATT方法选用SP207大孔吸附树脂,洗脱时间为静置Id最佳,整体回收率约为9.2%;在实际应用中,结合产毒藻密度及贻贝富集毒素含量的变化,发现SPE方法的检测结果可实时表征海域PSP风险状况,对于贻贝中PSP的预警效果也显著优于SAPTT方法,后者不仅因监控方式相对滞后一个监测周期,且灵敏度及准确性均较差。对于秦皇岛海域,当SPE方法检测结果达到100ng STX eq/L时,该海域贻贝中PSP残留将具有潜在的食用安全风险,跟踪过程表明这一阈值可提前两周预警贻贝富集毒素含量超出我国限量标准(800μg STX eq/kg),这对于强化风险警示并制定防范措施具有积极作用。     

舟山渔场及其相邻赤潮高发区麻痹性贝类毒素研究

采用小白鼠生物检测法和高效液相色谱荧光检测法，对采自舟山渔场及其相邻赤潮高发区贝类的麻痹性贝毒素进行了调查分析与研究。结果表明，浙江舟山海域有毒贝类检出率为7．0％。利用高效液相色谱荧光检测法对2006年5月份采集的六横的西格织纹螺、岱山的毛蚶组织提取液进行麻痹性贝毒素测定，结果显示，六横的西格织纹螺体内麻痹性贝毒素含量为0．178Mu／g，毒力值为0．0356μg STXeq／g，其毒素成分由GTX2、GTX3、STX、dcSTX、C2组成：岱山的毛蚶体内麻痹性贝毒素含量为3．494Mu／g，毒力值为0．6987μg STXeq／g，其毒素成分由STX、NEO、C1、C2组成。浙江中、南部海域有毒贝类检出率为2．2％，利用高效液相色谱荧光检测法对2006年10月份在南麂列岛采集的棒锥螺的组织提取液进行麻痹性贝毒素的测定，结果显示棒锥螺体内麻痹性贝毒素含量为0．705Mu／g，毒力值为0．1409μg STXeq／g，其毒素成分有GTX1、GTX2、GTX3、NEO、C1、C2组成。     

麻痹性贝毒在文蛤体内的累积及净化技术研究

试验研究分毒素累积和解毒两个阶段,丈蛤（Meretrix meretrix）对麻痹性贝毒（Paralytic Shellfish Poisoning,PSP）的累积能力试验中每天投喂一定量塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense）,定期测定丈蛤体内的毒素含量;解毒试验通过投喂饵料和水体消毒的“内排外解...     

麻痹性贝毒PSP在紫贻贝体内的累积、转化与排出

于1998年9月在青岛鲁迅公园附近礁石区采集紫贻贝（Mytilus edulis)，采用实验室培养的方法，初步研究了塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense,ATHK)产生的麻痹性贝毒（Paralytic Shellfish Poison,PSP)在其体内累积、转化与排出的规律。结果表明，在累积实验阶段，紫贻贝内脏的和肌肉中的PSP毒素含量均随实验时间的延长而逐渐增加，累积实验结束时，平均每只贝体内的PSP毒素含量为13.40nmol，毒性水平为12.24ugSTXEq/100g，紫贻贝内脏中的毒素含量远远高于肌肉，内脏中PSP毒素占贝体内PSP毒素总量的97.5%。在8天的排出实验阶段，贝体内的PSP毒素总量呈下降趋势，实验结束时，PSP毒素共排除了约50%，每天排除率约为9%。     

微小亚历山大藻投喂量与菲律宾蛤仔对麻痹性贝毒累积"转化和排出的动态

选用高毒性微小亚历山大藻台湾株和菲律宾蛤仔为研究对象,研究了不同毒藻投喂量对贝类累积和排出麻痹性贝毒(PSP)的影响.实验分为累积和排出2个部分,累积实验设计了4个投喂梯度(A组:2.0×107cell/d、B组:7.0×107cell/d、C组:1.1×108cell/d和D组:2.0×108cell/d),在排出毒素阶段,每实验组又分成投喂无毒饵料藻组和饥饿组并进行比较.结果显示不同投喂梯度组间PSP毒素累积存在明显差异.随着毒藻投喂量的增加,PSP毒性增加,但毒素累积率下降,这说明在一定范围内毒藻投喂量的大小对蛤仔的毒素累积有影响.A组、B组、C组的最高累积量依次为6.5,82.9,113.9μgSTXeq/100g,D组达到本实验的最高累积量154.1μgSTXeq/(100g),但累积率却随着投喂量的增加而递减,分别为1.79%,0.92%,0.42%和0.39%.停止投喂毒藻后蛤仔体内的PSP毒性迅速下降,在排出阶段,对投喂饵料组和饥饿组的比较结果用单因素方差分析(ANOVA)得出P＜0.05,结果差异显著,饥饿组的毒性均高于投喂饵料藻组,说明投喂无毒饵料有助于菲律宾蛤仔体内的毒素排出.其中D饵料组和饥饿组间排出速率差异最明显,饵料组的排出速率为13.2 μgSTXeq/(100g·d),饥饿组的仅为8.3μgSTXeq/(100g·d),因此将菲律宾蛤仔归属于快速排毒者.     

微小亚历山大藻投喂量与菲律宾蛤仔对麻痹性贝毒累积、转化和排出的动态关系

选用高毒性微小亚历山大藻台湾株和菲律宾蛤仔为研究对象,研究了不同毒藻投喂量对贝类累积和排出麻痹性贝毒(PSP)的影响。实验分为累积和排出2个部分,累积实验设计了4个投喂梯度(A组:2.0×107cell/d、B组:7.0×107cell/d、C组:1.1×108cell/d和D组:2.0×108cell/d),在排出毒素阶段,每实验组又分成投喂无毒饵料藻组和饥饿组并进行比较。结果显示不同投喂梯度组间PSP毒素累积存在明显差异。随着毒藻投喂量的增加,PSP毒性增加,但毒素累积率下降,这说明在一定范围内毒藻投喂量的大小对蛤仔的毒素累积有影响。A组、B组、C组的最高累积量依次为6.5,82.9,113.9μgSTXeq/100g,D组达到本实验的最高累积量154.1μgSTXeq/(100g),但累积率却随着投喂量的增加而递减,分别为1.79%,0.92%,0.42%和0.39%。停止投喂毒藻后蛤仔体内的PSP毒性迅速下降,在排出阶段,对投喂饵料组和饥饿组的比较结果用单因素方差分析(ANOVA)得出P0.05,结果差异显著,饥饿组的毒性均高于投喂饵料藻组,说明投喂无毒饵料有助于菲律宾蛤仔体内的毒素排出。其中D饵料组和饥饿组间排出速率差异最明显,饵料组的排出速率为13.2μgSTXeq/(100g.d),饥饿组的仅为8.3μgSTXeq/(100g.d),因此将菲律宾蛤仔归属于快速排毒者。     

栉孔扇贝体内麻痹性贝毒的累积与排出过程研究

通过室内摄食实验,研究了栉孔扇贝(Chlamys farreri)对麻痹性贝毒(PSP)产毒藻的敏感性及其累积和排出毒素的特征.有毒微小亚历山大藻(Alexandrium minutum)在短时间内可对栉孔扇贝的摄食有一定的抑制作用,且投喂毒藻的浓度越大,对摄食作用的抑制越明显.栉孔扇贝对PSP贝毒的累积能力很强,实验中,48 h后内脏累积毒素就高达5000μg STXeq100g-1,但其毒素排出速率较慢,在24d解毒阶段后内脏中的毒素还没有下降至国际贝毒食用安全标准水平的80μg STXeq 100g-1.各毒素组成比在整个累积与排除过程中有较大变化,GTX1,GTX4在累积阶段比例下降,同时GTX2,GTX3比例上升;内脏中GTX2:GTX3的比值逐渐增加.毒藻中PSP贝毒毒素组成和贝体中PSP贝毒毒素组成之间的主要差别是GTX4含量的减少和GTX1含量的升高;而扇贝粪便中的毒素组成却与对数生长期的毒藻极为接近.     

海洋的天然产物化学

富饶的海洋是生命起源的摇篮。地球上的生物就是从海洋发展起来的,至今仍有80%以上的动植物生长在海洋之中。海洋天然产物化学最近引人兴趣的报道是海洋生物毒素、化学信号物质、防御剂和抗癌剂。 一、海洋生物毒素 1.石房蛤毒素(saxitoxin,STX):此种毒素是从双鞭毛藻(Dinoflagellate)得到的,所以又称双鞭毛藻毒素(dinoflageua toxin)。双鞭毛藻有时每毫升海水可达50000细胞的浓度,局部生长过密时可形成赤潮。毒     

麻痹性贝毒对肝脏和肾脏氧化损伤的影响

为了探讨麻痹性贝毒(PSP)对肝脏和肾脏损伤的机制,采用膝沟藻毒素GTX-1,4对小鼠进行急性暴露,剂量为1μg/kg,时间分别为60、90、120min。结果发现,与对照组相比,肝脏染毒组中的还原型谷胱甘肽(GSH)含量没有显著变化;在肾脏中,60 min时染毒组GSH含量没有明显变化,90、120 min时GSH含量降低;两器官中抗氧化酶(GSH-Px、SOD)活性与对照组相比均无显著变化(P0.05)。从而推断,GSH参与了PSP对肾脏损害的毒性过程;肾中GSH含量有可能作为PSP早期检测的敏感指标。