半滑舌鳎病原鳗利斯顿氏菌表型及分子特征研究

2008年12月,江苏赣榆某渔场养殖半滑舌鳎出现大量死亡,症状主要表现为:头部、鳃盖及鳍基出血,尾鳍腐烂,腹腔膨胀并积有大量腹水,部分病鱼肠管脱出肛外。从病鱼肝脏、腹水中分离出大量优势生长的细菌,人工感染试验证明其对半滑舌鳎有较强的致病性。对3株分离菌进行了形态特征、理化特性、胞外酶及溶血素活性等表型生物学性状检验;测定了代表菌株的16S rRNA和gyrB基因序列,分析了16S rRNA和gyrB两种基因序列的同源性,并构建了系统发生树,比较了两种基因对分离菌的鉴定能力;结果表明gyrB基因用于细菌种间鉴定更具优越性;基于16S rRNA和gyrB基因的系统发育学分析表明分离菌与鳗利斯顿氏菌具有高同源性,根据分离菌的表型及分子特征,判定分离菌为利斯顿氏菌属(Listonella MacDonell and Colwell 1986)的鳗利斯顿氏菌[Listonella anguillarum (Bergeman 1909) MacDonell and Colwell 1986]。胞外酶活性及溶血活性检测表明3株分离菌均具有淀粉酶、蛋白酶、卵磷脂酶等胞外酶活性,在含7%家兔脱纤血液营养琼脂培养基上呈β型溶血,PCR检测3株供试菌均可扩增出大小约493 bp的溶血素基因和大小约248bp的金属蛋白酶基因。分离菌的耐药谱测定结果显示,对供试49种抗菌药物中的青霉素G等13种药物耐药,对羧苄青霉素等6种药物存在敏感与耐药的株间差异。     

三种鰕虎亚目鱼类肌浆蛋白的比较研究

2002年4月在浙江宁波随机采集了弹涂鱼(Periophthalmus)、大弹涂鱼(Bolteophtalmus chinensis)和杂色鰕虎鱼(Gobius poecilichthys Jord and Snyd)样本。采用垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法,对3种鱼肌浆蛋白(Pm)从分类角度进行研究比较。结果表明：3种鱼肌浆蛋白图谱有明显的差异,大弹涂鱼与弹涂鱼间的相似系数最大(0．429),而杂色鰕虎鱼与大弹涂鱼、杂色鰕虎鱼与弹涂鱼的相似系数相对小些,分别为0．267和0．400,说明大弹涂鱼与弹涂鱼的亲缘关系更近。     

基于物种分布模型分析环境因子对海州湾偶见种资源分布的影响

偶见种易受环境变化和人类活动等外界威胁,在生物多样性保护中具有重要参考价值,但由于其数据量较少、分析困难,目前对分布特征的研究较少,其分布与环境因子的关系尚待探究。本研究基于2013–2019年海州湾渔业资源调查数据,分析了凤鲚（Coilia mystus）、红狼牙虾虎鱼（Odontamblyopus rubicundus）和虻鲉（Erisphex pottii）3种海州湾偶见种资源分布与环境因子的关系,并比较了广义可加模型（GAM）和随机森林（RF）模型对其资源分布的拟合效果,采用交叉验证的方法对模型的预测性能进行了评价。结果显示,水深是影响春、秋季凤鲚和红狼牙虾虎鱼资源分布的最显著因子,而底层水温仅在秋季是影响虻鲉资源分布的最重要环境因子。凤鲚分布模型的方差解释率最高,其次为红狼牙虾虎鱼,虻鲉模型方差解释率最低。凤鲚、红狼牙虾虎鱼和虻鲉分布模型在春季方差解释率均低于秋季。交叉验证表明,3个物种预测结果的曲线下面积（AUC）值在0.70～0.85之间,仅秋季凤鲚的AUC值达到0.9;同时GAM预测结果的AUC值均大于RF模型,表明对于偶见种而言,GAM的预测性能优于RF模型。本研究为...     

养殖鲟鱼出血症病原鲁氏耶尔森菌的分离鉴定和致病性研究

鲁氏耶尔森菌(Yersinia ruckeri)是鲑鳟鱼类和温水性鱼类肠炎红嘴病的主要病原,可引起病鱼体表出血、肠道肿胀发炎等临床症状。本研究从患出血症施氏鲟(Acipenser schrenckii)中分离到一株致病性菌株(YR-H01),生理生化鉴定和16S rRNA基因序列分析表明YR-H01株为鲁氏耶尔森菌。人工感染该菌后发病鱼表现为肛门红肿、外突明显,部分鱼鳍基部和下颌处有出血现象,内脏器官不同程度出血,且从组织中再分离的细菌特性与原感染菌相同。腹腔注射后该菌株对施氏鲟的半致死浓度为7.2×106CFU,且攻毒剂量越大,临床病症出现越快。病理组织切片显示,该菌感染鲟鱼后肝细胞发生明显病变,淋巴细胞侵润,肝索结构消失,细胞肿胀,核空泡变性或核仁边缘化。     

福鼎海域坛紫菜叶状体体表外生细菌的组成和数量分析

从采集自福鼎敏灶湾和硖门湾海域的健康坛紫菜（Porphyra haitanensis）叶状体体表分离、纯化到26株外生细菌．根据细菌菌落特征、菌体形态和16SrDNA基因序列分析相结合的方法进行鉴定,将其确认为6种不同的菌属,分别是假交替单胞菌属（Pseudoaheromonas）、Aquimarinas属、交替单胞菌属（Aheromonas）、黄杆菌属（Flavobacteriums）、弧菌属（Vibrio）和嗜琼胶菌属（Agarivorans）．2个海湾坛紫菜叶状体体表外生菌群数量稳定且差别不大,外生细菌菌属组成基本相同,个别菌属稍有差异,优势菌属为假交替单胞菌属和Aquimarinas属,常见菌属为交替单胞菌属和黄杆菌属,少见菌属为弧菌属．敏灶湾坛紫菜体表外生菌群数量为（5．7～6．5）×10^4cfu／g,外生细菌中各菌属所占比例为：假交替单胞菌属占38．5％,Aquimarinas属占52．8％,交替单胞菌属占13．9％,黄杆菌属占11．5％,弧菌属占3．3％．硖门湾坛紫菜体表外生菌群数量为（6．4～7．6）×10^4cfu／g,外生细菌中各菌属所占比例为：假交替单胞菌属占37．3％,Aquimarinas属占32．0％,交替单胞菌属占14．0％,黄杆菌属占12．7％,弧菌属占2．7％,嗜琼胶菌属占1．3％．优势和常见菌属菌株对健康坛紫菜叶状体进行感染,发现这些菌株对坛紫菜叶状体无致病力,叶状体生长无异常．这些可为坛紫菜微生物学研究提供基础资料．     

半滑舌鳎病原鳗利斯顿氏菌表型及分子特征研究半滑舌鳎病原鳗利斯顿氏菌表型及分子特征研究

2008年12月,江苏赣榆某渔场养殖半滑舌鳎出现大量死亡,症状主要表现为：头部、鳃盖及鳍基出血, 尾鳍腐烂,腹腔膨胀并积有大量腹水,部分病鱼肠管脱出肛外。从病鱼肝脏、腹水中分离出大量优势生长的 细菌,人工感染试验证明其对半滑舌鳎有较强的致病性。对3株分离菌进行了形态特征、理化特性、胞外酶及溶血素活性等表型生物学性状检验;测定了代表菌株的16S rRNA和gyrB基因序列,分析了16 S rRNA和gyrB两种基因序列的同源性,并构建了系统发生树,比较了两种基因对分离菌的鉴定能力;结果表明gyrB基因用于细菌种间鉴定更具优越性;基于16S rRNA和gyrB基因的系统发育学分析表明分离菌与鳗利斯顿氏菌具有高同源性,根据分离菌的表型及分子特征,判定分离菌为利斯顿氏菌属（Listonella MacDonell and Colwell 1986）的鳗利斯顿氏菌\[Listonella anguillarum ( Bergeman 1909)MacDonell and Colwell 1986\]。胞外酶活性及溶血活性检测表明3株分离菌均具有淀粉酶、蛋白酶、卵磷脂酶等胞外酶活性,在含7%家兔脱纤血液营养琼脂培养基上呈β型溶血,PCR检测3株供试菌均可扩增出大小约493 bp的溶血素基因和大小约248 bp的金属蛋白酶基因。分离菌的耐药谱测定结果显示,对供试49种抗菌药物中的青霉素G等13种药物耐药,对羧苄青霉素等6种药物存在敏感与耐药的株间差异。     

文蛤鳃组织内共生菌分离鉴定和多样性分析

为探究文蛤（Meretrix petechialis）鳃组织内共生菌群的群落组成及结构,采用纯培养方法,对文蛤鳃组织的内共生菌进行了分离、纯化和16S rRNA鉴定,共筛选到215株细菌,分属于变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门4个门级类群中,其中变形菌门是实现纯培养菌株数量最多的类群。基于16S rRNA序列信息,进一步对变形菌门的系统演化关系进行了分析,结果显示不同纲级类群的菌株分别聚集在了相应的分支内。另外,对获得的具有潜在抑菌活性或致病性的共生细菌进行了探讨,为后续对文蛤鳃内生菌的深入研究奠定了基础。     

海南地区溶藻弧菌遗传多样性的RAPD分析

以来源于泰国的菌株TG06003作对照,对采自海南地区的27株溶藻孤菌（Vibrio alginolyticus）环境菌株进行了随机扩增多态性DNA标记（RAPD）分析,其中6株为毒力菌株,另外22株为非毒力菌株。实验共得到70个多态性条带,多态性比率（PP13）为98．6％。基因多样度的算术平均数和加权平均数分别为0...     

工厂化养殖杂色鲍致病菌副溶血弧菌的分离鉴定及其生理特性

从广东汕尾地区工厂化养殖的患病和死亡的杂色鲍(Haliotis diversicolor)及养殖海水中分离到3株优势菌,经回归感染试验,证实所分离的细菌为杂色鲍的致病菌。经形态、生理、生化等多项指标鉴定,该菌株为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus),并经ATB微生物自动鉴定系统证实鉴定结果。在中国大陆,由副溶血弧菌使杂色鲍致病并大量死亡的事件,本文属首次报道。     

厦门沿岸海域2种虾虎鱼染色体核型的比较

采用鱼鳍细胞空气干燥法制片,Giemsa染色,对厦门沿岸海域2种虾虎鱼的染色体核型进行了分析研究.其中,犬牙缰虾虎鱼（Amoya caninus）的染色体数目为2n=50,臂数为NF=84,有8对中部着丝点染色体（M）,7对亚中部着丝点染色体（SM）,2对亚端部着丝点染色体（ST）和8对端部着丝点染色体（T）.髭缟虾虎鱼（Tridentiger barbatus）的染色体数目为2n=44,臂数为NF=68,有5对中部着丝点染色体（M）,6对亚中部着丝点染色体（SM）,1对亚端部着丝点染色体（ST）和10对端部着丝点染色体（T）.未发现有异形染色体.其中犬牙缰虾虎鱼的染色体数目是文献中尚未报道的1类虾虎鱼染色体类型.     

日本对虾(Penaeus japonicus)病原需钠弧菌(Vibrio natriegens)表型与分子特征及LAMP检测方法的建立

采用常规表观生物学特性及16S rRNA、gyrB及rpoA基因同源性检索与系统发育学分析等方法,对分离自江苏连云港某育苗场的大批死亡日本对虾蚤状幼体的优势生长菌进行了综合鉴定。结果表明,其形态和生理生化特征与弧菌属的需钠弧菌相近;16S rRNA、gyrB及rpoA基因同源性检索也均与需钠弧菌相似性最高,分别为98%、89%和95%,且三种基因的NJ系统发育树也均与需钠弧菌聚为一个分支;分离菌的致病性试验表明其半数致死量LD50为1.8×106CFU/ml。综合分离菌的致病性、形态与生理生化特征及基因同源性与系统发育分析结果,认为引起日本对虾蚤状幼体大批死亡的病原为需钠弧菌。基于gyrB基因序列设计1套LAMP特异性引物,建立了需钠弧菌的快速特异性检测方法,可用于由需钠弧菌引起的水产动物疾病的诊断及分子流行病学的调查研究。     

泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)病原温和气单胞菌(Aeromonas sobria)分子鉴定及耐药性研究

采用常规生理生化特性测定及16SrRNA、gyrB及rpoD基因同源性检索与系统发育学分析等分子生物学方法,对引起养殖泥鳅大量死亡的病原细菌进行了综合鉴定。生理生化特性结果表明,分离菌株NQ090701与气单胞菌属的温和气单胞菌相近;16SrRNA、gyrB及rpoD基因Blast序列同源性检索与系统发育学分析均与温和气单胞菌相似性最高;综合形态与生理生化特征及16SrRNA、gyrB与rpoD基因的分子特征,确认分离菌株NQ090701为温和气单胞菌(Aeromonas sobria)。同时,采用试管稀释法测定了养殖生产中常用的10种抗菌药物对病原温和气单胞菌的体外最小杀菌浓度(Minimal Bactericidal Concentration,MBC),结果表明氟哌酸杀菌作用最好,其次为盐酸沙拉沙星;甲砜霉素和复方磺胺甲恶唑在所试验的药物浓度范围对温和气单胞菌无杀菌效果。     

河流弧菌对牙鲆表皮黏液黏附作用的研究

为了解河流弧菌对牙鲆表皮黏液的黏附特性,采用3H-TdR同位素示踪方法研究了细菌浓度、孵育时间、孵育温度、pH值、阳离子、碳水化合物等因子对河流弧菌黏附作用的影响。试验结果表明:河流弧菌能很好地黏附于牙鲆表皮黏液,黏附量随菌浓度升高而增大并符合饱和黏附动力学:y=417.89ln(x)+691.57(R2=0.986);在30℃下黏附量随着孵育时间的延长而增加,180min趋于饱和;孵育温度在4~30℃范围内黏附量随温度升高而增多,30℃时黏附量最大;pH值酸性较碱性黏附作用明显,pH为5时最强;NaCl浓度在0.5%~4.5%范围内,细菌黏附作用随着浓度升高而增强,较纯水存在显著性差异(P<0.05);Ca2+,Mg2+能显著加强河流弧菌的黏附作用,但Ca2+作用明显超过Mg2+;葡萄糖等8种碳水化合物能显著促进河流弧菌的黏附作用(P<0.05)。以上结果说明:河流弧菌对牙鲆表皮黏液的黏附量较大,这有利于进一步感染、致病;河流弧菌的黏附作用受温度、pH值、阳离子、碳水化合物等多种环境因子的影响,较高的水温有利于河流弧菌的黏附,有利于疾病的发生。     

利用扩增vvhA基因的环介导等温扩增技术快速，特异而敏感地检测创伤弧菌

创伤弧菌是一种可感染人类的河口病原菌。建立快速,特异而敏感的检测方法,有助于创伤弧菌感染的早期疾病诊断和及时治疗。本研究设计了针对vvhA基因的一系列引物（包括两对外部引物和两对内部引物）,采用环介导等温扩增技术（LAMP）来检测创伤弧菌。结果显示,本方法的最适扩增温度是63℃,反应仅需35分钟。扩增产物不仅可以用含有DNA ladder的琼脂糖凝胶电泳检出,也可借助钙黄绿素直接肉眼观察。采用45株菌株检测该方法的特异性,其中所有创伤弧菌均被检出而其他菌株检测结果皆为阴性。本方法的敏感性是普通PCR扩增的100倍,同时利用该方法可以准确检测出所有的模拟样品、临床标本及环境样品。与其他已知方法比较,针对vvhA基因的介导等温扩增技术可以快速、简单、敏感及特异地鉴定创伤弧菌。     

水产动物致病性副溶血弧菌双重PCR 检测方法的研究

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是多种水产养殖动物的主要病原菌,尤其是可引起凡纳滨对虾幼虾呈毁灭性死亡。本研究基于gyrB和toxR两种基因序列设计2对特异性引物,建立一种副溶血弧菌快速、准确的双重PCR检测方法,扩增目的片段大小分别为285 bp和368 bp。结果表明在同一PCR反应体系中副溶血弧菌可同时扩增大小分别为285 bp和368 bp的2种基因片段,两种引物对4种其他水产动物病原菌无交叉反应;敏感性检测结果显示,该双重PCR最低能检测8.867 2×103 CFU/mL菌体浓度的副溶血弧菌,对副溶血弧菌模板DNA的检出极限为0.029 3 mg/L;对发病中国对虾糠虾幼体、水产品及虾池养殖用水进行双重PCR检测,呈阳性反应的样品可分离出优势生长的副溶血弧菌。该实验所建立的基于gyrB和toxR两种基因的双重PCR检测方法可用于副溶血弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及分子流行病学的调查研究。     

罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)致病性豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)的分离鉴定及其特性分析

近年来细菌性疾病因病原菌种类繁多、覆盖区域广而影响了其养殖业的健康发展,造成较大的经济损失。从体表具有黑斑、肢体残损症状的罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)肝胰腺组织中分离得到1株病原菌,通过形态学观察、生理生化特性鉴定、16S rRNA序列和特定毒力基因检测鉴定,以及人工回归感染试验和药敏试验分析其致病性和耐药性。结果表明,该菌为豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae),含有aer、lip、gcat、ser和OMPA I等毒力基因;药敏试验显示其对头孢曲松、氯霉素等7种抗生素高度敏感,对恩诺沙星、阿米卡星及复方新诺明3种抗生素中度敏感,对四环素、环丙沙星等10种抗生素具有耐药性;人工回归感染实验表明该菌具有较高的致病性,对罗氏沼虾的半致死浓度为6.54×10⁵ CFU/mL。豚鼠气单胞菌作为水产养殖中的条件性致病菌,研究结果揭示了该菌株的部分生物学特性,有利于丰富豚鼠气单胞菌属的基础数据,同时也为罗氏沼虾养殖过程中的病害防控提供了一定参考依据。     

致病性哈维氏弧菌:海洋寄生性纤毛虫的内共生细菌

哈维氏弧菌被观察到与海洋寄生性纤毛虫刺激隐核虫具有内共生现象,其作为一种致病性细菌,可导致感染刺激隐核虫的大黄鱼产生严重的继发性细菌感染。我们通过16s宏测序技术对刺激隐核虫的细菌群落进行鉴定,并通过标准的细菌培养方法分离鉴定出哈维氏弧菌。通过透射电镜和荧光原位杂交方法,在刺激隐核虫的细胞胞质中,均观察到内共生的哈维氏弧菌的存在;而在其细胞核中,则没有相关信号存在。哈维氏弧菌与刺激隐核虫的相关关系以及内共生的哈维氏弧菌对刺激隐核虫的影响作用,仍需要深入进行研究。     

哈维氏弧菌对泥蚶的毒性及半致死浓度研究

为构建泥蚶感染弧菌标准技术体系,本研究采用哈维氏弧菌浸泡感染和注射胁迫两种攻毒方式对泥蚶进行了急性毒性实验,观察泥蚶在菌液胁迫下的存活情况,分析哈维氏弧菌对泥蚶的半致死浓度。浸泡感染实验结果表明,随着感染水体中弧菌升高,泥蚶死亡起始时间和最大日死亡率时间均有所提前,泥蚶死亡情况呈现上升趋势,当浸泡浓度超过2×10⁷CFU/mL,泥蚶15 d累计死亡率接近100%。注射胁迫实验结果表明,泥蚶死亡率与弧菌注射浓度呈显著正相关(r=0.964,P<0.01)。Probit回归分析结果显示,哈维氏弧菌浸泡感染泥蚶7 d后停止实验,15 d的半致死浓度(LC₅₀)为1.35×10⁷CFU/mL;注射胁迫下的96 h半致死剂量(96 h LD₅₀)为2.12×10⁷CFU/g,说明哈维氏弧菌对泥蚶有明显的毒害作用。研究结果为泥蚶对哈维氏弧菌耐受性提供数据参考,并且为泥蚶弧菌病防治提供了理论基础。     

太平洋双色鳗鲡(Anguilla bicolor pacifica)致病性类志贺邻单胞菌的鉴定和中药敏感性研究

从发病死亡的养殖太平洋双色鳗鲡(Anguilla bicolor pacifica)肝脏中分离到一株优势菌AMSH1,为研究其种属、毒力及中药敏感性,结合BIOLOG微生物鉴定系统和16S r DNA序列分析对该菌株进行鉴定,并通过人工回归感染试验确定其致病性。此外,还研究了10味中药单用、10种双联用和4种三联用对该菌株的体外抑菌作用。结果显示该菌株为类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)。经人工腹腔注射感染健康太平洋双色鳗鲡,证实该菌具有致病性,半致死量LD50为3.2×105CFU/g。药敏试验结果表明,10味中药均有较好的抑菌效果,其中五倍子(Galla chinensis)、丁香(Eugenia caryophllata)和生地榆(Sanguisorba officinalis)的效果最好,7种双联用复方和1种三联用复方均具有协同抑菌作用。本次引起太平洋双色鳗鲡发病的病原为类志贺邻单胞菌,该菌对太平洋双色鳗鲡的致病性及其中药药敏的研究属首次报道。建议选用含五倍子的中药双联用复方或三联用复方进行防治,皆绿色环保。