贝类精子质量检测与评价方法的研究Ⅲ:FDA-PI双荧光复染法检测马氏珠母贝精子的存活率

将马氏珠母贝新鲜精液和精子水浴致死精液配制含有不同精子死亡率(0%、20%、40%、60%、80%)的5浓度梯度检测样品,并作为理论精子死亡率,采用二乙酰荧光素(Fluorescein diacetate,FDA)-碘化丙啶(Propidium iodide,PI)双荧光复染法检测精子存活率和质膜完整性。结果表明,FDA和PI能有效区分活精子和死精子,活精子发出绿色荧光,死精子发出红色荧光。各样品实测精子死亡率和理论死亡率之间呈极显著正相关,相关系数r=0.99(p<0.01)。FDA-PI双荧光复染法检测马氏珠母贝精子存活率,灵敏度高,重复性好,准确有效。     

羟基红花黄色素A对Aβ_(25-35)诱导PC12细胞凋亡的保护作用

为探讨羟基红花黄色素A(HSYA)对β-淀粉样蛋白(Aβ)25-35诱导的神经元样PC12细胞凋亡的影响,并阐明其可能的作用机制,采用Aβ_(25-35)(20μmol/L)诱导PC12细胞凋亡建立AD细胞模型,以不同浓度HSYA(20,40,80μmol/L)对抗干预,使用形态学观察法及Hoechst染色法检测各组PC12细胞凋亡形态,MTT法检测各组细胞存活率,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率,同时应用RT-PCR检测细胞PUMA m RNA的表达变化。结果表明,HSYA可维持PC12细胞及其突触的正常形态,提高细胞存活率,明显抑制细胞凋亡,下调促凋亡蛋白PUMA m RNA的表达,与Aβ_(25-35)组差异均有统计学意义(P0.01)。HSYA可明显对抗Aβ引发的神经元样PC12细胞损伤,其保护作用机制与下调PUMA m RNA的表达量有关。     

三氯化铁絮凝小球藻的采收工艺

【目的】研究三氯化铁对小球藻絮凝采收效果的影响,并优化采收工艺条件。【方法】分析FeCl₃浓度、小球藻初始浓度和絮凝时间对小球藻采收效率影响,利用响应面法优化利用FeCl₃采收小球藻的工艺参数。【结果】单因素实验表明,FeCl₃质量浓度为0.6 g/L、小球藻初始质量浓度为0.42 g/L和絮凝时间为30 min时,小球藻的采收效率最高。响应面法分析表明,小球藻初始浓度对小球藻采收率有显著影响(P<0.05);影响采收效率的主次因素顺序为小球藻初始浓度>FeCl₃浓度>絮凝时间;FeCl₃浓度和小球藻初始浓度的交互作用对小球藻的采收效率有显著影响(P<0.05);FeCl₃浓度二次项对小球藻的采收效率有极显著影响(P<0.01)。【结论】利用FeCl₃采收小球藻的最佳工艺条件:小球藻初始质量浓度为0.55 g/L,FeCl₃质量浓度为0.6 g/L,絮凝时间为38 min,此时的采收效率为(98.6±1.9)%。     

巴马香猪Hsp70基因的克隆、生物信息学分析及其在猪肠上皮细胞IPEC-J2中的表达

为研究热应激蛋白70(HSP70)在巴马香猪(Sus scrofa domestica)耐热中的作用,利用NCBI公布的猪Hsp70基因序列设计引物,用RT-PCR克隆巴马香猪Hsp70基因。核酸序列分析表明,巴马香猪Hsp70基因开放阅读框(ORF)长1 932 bp,编码643个氨基酸。该蛋白分子质量为71.1 ku,等电点(PI)为5.88,与野猪、人、牛、羊、犬和鸡的同源性分别为99.2%、82.8%、83.2%、83.6%、82.4%和77.7%。该蛋白非叶绿体转运肽和线粒体导肽,亦非信号肽分泌通道,存在多个明显的疏水区,其中397位疏水性最强,达2.211。将该基因的ORF与真核表达载体pc DNA 3.1/V5-HisTOPO连接构建真核表达载体,并转染IPEC-J2细胞,荧光定量PCR及Western blot检测可见其在基因和蛋白水平的高量表达。     

不同天然饵料对凡纳滨对虾亲虾性腺发育的影响

分别以双齿围沙蚕(Perinereis aibuhitensis)、杜氏枪乌贼(Loligo duvaucelii)、近江牡蛎(Ostrea riuularis)及三者的混合饵料(1∶1∶1)培育凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)亲虾至性腺发育成熟,通过分析亲虾性腺发育时间、蜕壳间期、交配率、产卵量、变态率,确定培育亲虾的优质饵料。结果表明:投喂双齿围沙蚕或混合饵料的组与投喂杜氏枪乌贼、近江牡蛎组在产卵量、卵巢发育时间、蜕壳间期、交配率、孵化率、变态率方面具有显著差异(P<0.01)。投喂双齿围沙蚕或混合饵料的亲虾平均产卵量可达21.2×104粒/尾,卵巢平均发育时间为101 h,平均蜕壳间期为218 h,平均交配率可达80%,平均孵化率可达62.99%,平均变态率可达82.44%。表明在凡纳滨对虾亲虾培育的过程中,沙蚕单独或与其他天然饵料混合投喂,较乌贼、牡蛎单独投喂对亲虾性腺发育具有更好的促进效果。     

斑节对虾虾苗白斑综合症杆状病毒的检测和养殖跟踪

利用 2步 PCR检测技术对湛江和阳西地区的虾苗进行白斑综合病杆状病毒 ( WSSV)检测。在仔虾 2日龄最早检测到病毒 ,有 2 5%的虾苗带有 WSSV病毒。带病毒虾苗和不带病毒虾苗分别在不同养殖模式的养殖过程中跟踪。前者在湛江湖光镇普通虾塘跟踪养殖 ,它们在变化的环境中容易发病 ,p H、盐度和温度是重要的诱发因子 ,在养殖 50～ 60 d时发病死亡 ;后者在高位池和普通池养殖跟踪 ,它们对变化的环境有较大的适应性 ,养殖时间为 80～ 1 1 0 d,在相对优良的养殖技术条件下大部分可望养殖成功。环境中有 WSSV病原传入 ,不带病毒虾苗在养殖后期可以带有 WSSV病毒 ,出现白斑虾。跟踪的普通池有爆发病害 ,但是时间延后 ,跟踪的高位池没有爆发病害。     

多鳞鱚Sillago sihama Forskál外周血细胞的显微结构观察

对多鳞鱚(Sillago sihama Forskál)Wright染色的血涂片进行显微观察。结果表明多鳞鱚外周血细胞可区分为红细胞、血栓细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞等6种细胞,未发现嗜碱性粒细胞。血栓细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞在白细胞中所占比例分别为47.5%、32.5%、12.5%和7.5%,嗜酸性粒细胞在整个实验中只发现7个。并发现较多未成熟的红细胞以及少量正在分裂的红细胞和晚幼嗜中性粒细胞。     

硝酸银络合法浓缩金枪鱼鱼油多不饱和脂肪酸的研究

以金枪鱼鱼油混合脂肪酸为材料 ,利用硝酸银络合法浓缩其中的多不饱和脂肪酸 (PU FA) ,主要考察了搅拌时间和硝酸银浓度对产品得率和EPA和DHA含量的影响 ,并测定了产品的理化指标和脂肪酸组成。研究结果表明 :搅拌时间为 6 0min ,硝酸银浓度为 4mol/L时得到的产品得率为 18.0 3% ,浓缩产品中的EPA和DHA的质量分数分别为 9.78%和 86 .0 7% ,总质量分数达95 .85 % ,过氧化值为 7.35mmol/kg ,碘值 2 6 0 8.9g/kg。     

罗湖病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

【目的】建立一种快速、灵敏、特异的罗非鱼(Oreochromis spp)罗湖病毒定量检测方法。【方法】根据罗湖病毒节段8保守区设计一对特异性引物,建立检测罗湖病毒的SYBRGreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行了评价。【结果】标准曲线在2.5×10~8～2.5×10~0拷贝数之间有良好的线性关系(相关系数R~2=0.999),检测限为2.5×10~0个拷贝。试验内及试验间变异系数分别为0.11%～0.43%与0.54%～1.13%,重复性强;对水生动物其他病毒和细菌均无扩增反应,有很好的特异性。【结论】新建立的罗湖病毒实时荧光定量PCR检测方法特异性好、灵敏度高、重复性强,可用于TiLV的早期的快速诊断、流行病学调查和防控。     

眼柄粗提物对凡纳滨对虾性分化的影响

采用生化方法制备凡纳滨对虾[Litopenaeus(Penaeus)vannamei)]眼柄粗提物,用活体注射法研究不同粗提物剂量对去眼柄凡纳滨对虾卵母细胞直径大小的影响,以检验其性腺抑制素(Gonadinhibiting hormone,GIH)的生物活性;在凡纳滨对虾仔虾后17、22和27 d,分别以不同浓度眼柄粗提物浸泡24 h,结果显示:除0.001个眼柄/mL的GIH浓度外,0.01、0.1和1个眼柄/mL组均显著降低凡纳滨对虾卵母细胞直径(P﹤0.05);浸泡处理后,仔虾后17 d GIH处理组凡纳滨对虾雌性率达70.1%～80.1%;仔虾后22 d GIH处理组雌性率达65.8%～71.7%,各浓度GIH处理组雌性率比对照组(雌雄比例约为1:1)显著提高(P﹤0.05);仔虾后27 d,0.01和1个眼柄/mL处理组雌性率(约58%)略高于对照组,但0.1个眼柄/mL处理组雌性率(73.1%)与对照组相比显著提高(P﹤0.05)。结果表明较低浓度的眼柄粗提物可明显诱导凡纳滨对虾雌性化,在仔虾后22 d前处理效果最佳。     

卵形鲳鲹PPARα基因cDNA序列的克隆、组织表达及生物信息学分析

采用RACE-PCR克隆卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptors-α,PPARα)基因的c DNA序列全长,并应用生物信息学方法分析其编码蛋白质的理化性质和结构特征。结果表明:卵形鲳鲹PPARα基因(Gen Bank登录号KP893147)c DNA全长1 930 bp,开放阅读框(ORF)为1 425 bp,共编码474个氨基酸,其编码的蛋白质为不稳定蛋白,无信号肽和跨膜结构,二级结构由α螺旋、β转角、伸展片段和无规则卷曲组成,且α螺旋占较大比例;预测显示,该蛋白有PPARs基因家族典型的DNA结合区(DBD)和配体结合区(LBD);序列对比表明,卵形鲳鲹PPARα基因与尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、花鲈(Lateolabrax japonicas)、大黄鱼(Larimichthys crocea)、金头鲷(Sparus aurata)、军曹鱼(Rachycentron canadum)等有较高的同源性(81%~89%);蛋白系统进化树分析显示,在人(Homo sapiens)、鼠(Mus musculus)、鸭(Gallus gallus)、花鲈、大黄鱼、军曹鱼等动物中,卵形鲳鲹的PPARα蛋白与军曹鱼的进化关系最为密切(94%),与人(68%)、鼠(68%)、鸭(67%)等的同源性较低。荧光定量分析显示,卵形鲳鲹PPARαm RNA在脑、肾脏、肠、脾脏等组织表达水平较高,其次是皮肤、肌肉,在心脏、肝脏中表达量较低。     

低值鱼蛋白多肽-铁(Ⅱ)螯合物的酶解制备及其抗氧化、抗菌活性

以南海低值鱼蛋白为原料,采用木瓜蛋白酶和风味酶的复合酶水解得到多肽水解物(HP),并制备多肽-铁(Ⅱ)螯合物,对螯合工艺及螯合产物的结果及抗氧化和抗菌功能特性进行了初步研究。结果表明:1)水解度为5%的多肽与铁(Ⅱ)螯合效果最佳,螯合率为94.15%;2)化学分析及红外光谱表明活性肽与亚铁离子螯合并形成稳定结构的螯合物;(3)经过50%乙醇(体积分数)沉淀的螯合铁具有明显的抗氧化活性,其抗氧化作用相当于维生素E的90%,经过80%乙醇(体积分数)沉淀的螯合物具有显著的抗枯草牙孢杆菌和金黄色葡萄球菌活性,其抑菌圈均直径为13mm。     

海参磷脂对慢性应激诱导小鼠抑郁样行为的影响

【目的】探究海参磷脂对慢性不可预知性应激(CUMS)诱导小鼠产生抑郁样行为的影响及机制。【方法】将昆明小鼠(KM)随机分为对照组、模型组和海参磷脂低、高剂量组,对照组外的三组小鼠进行连续60d的CUMS,同时,低、高剂量组每天分别灌胃50 mg/kg和100 mg/kg海参磷脂,模型组和对照组灌胃等体积生理盐水。应激结束后进行旷野和高架十字迷宫行为学实验,酶联免疫法检测血清糖皮质激素(GC)的含量,高效液相色谱(HPLC)检测海马区的五羟色胺(5-HT)水平。【结果】与对照组相比,模型组小鼠旷野实验5min内水平活动、垂直运动均明显减少(P<0.01),高架实验5 min内小鼠进入高架开放臂次数显著减少(P<0.05),开放臂时间显著减少(P<0.01),血清GC显著升高(P<0.01),海马区5-HT含量显著降低(P<0.05),五羟吲哚乙酸(5-HIAA)显著升高(P<0.05),5-HT/5-HIAA比值显著降低(P<0.05)。【结论】海参磷脂可改善CUMS诱导致小鼠抑郁样行为,与其抑制GC分泌和5-HT降解活性有关。     

二十二碳五烯酸对淋巴细胞活性及单胺类神经递质的影响

【目的】研究二十二碳五烯酸(Docosapentaenoicacid,DPA)对精神分裂症患者外周血淋巴细胞的活性及细胞内单胺类神经递质的调节作用。【方法】将正常人和病人的外周血淋巴细胞分为对照组、病人组、对照+DPA组(0～200μmol/L)、病人+DPA组(150μmol/L),用DPA处理细胞48 h。用CCK8法检测细胞存活率,用高效液相色谱法检测血浆中多巴胺及其代谢物的含量,检测淋巴细胞中去甲肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺和代谢物的含量。【结果】与对照组相比,精神分裂症患者外周血淋巴细胞存活率下降,血浆中的多巴胺(DA)及其代谢产物二羟苯乙酸(DOPAC)含量上升,淋巴细胞中的多巴胺与其代谢产物、5-羟色胺(5-HT)与其代谢物5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)的含量显著下降,DA/DOPAC、5-HT/5-HIAA比值显著升高,去甲肾上腺素代谢物的含量显著下降。DPA可以显著提高淋巴细胞的存活率,提高多巴胺、5-羟色胺及其代谢物的含量,降低DA/DOPAC、5-HT/5-HIAA比值,提高去甲肾上腺素代谢物的含量。【结论】DPA可以提高精神分裂症患者外周血淋巴细胞的存活率,调节单胺类神经递质的含量。     

硝化细菌对罗非鱼苗培育环境及抗病力的影响

于罗非鱼鱼苗培育水体中引入不同浓度的硝化细菌,检测主要水质因子,测定罗非鱼与抗病力有关的酶的活力,研究微生态调控对水质和对罗非鱼抗病力的影响。结果显示,硝化细菌浓度为100/L时,氨氮含量相对于对照组降低25.05%,亚硝酸氮含量降低45.16%,COD值降低12.33%,差异显著(P<0.05);鱼苗培育成活率相对于对照组高7.58%,体长增加22.18%,体重增加46.15%;幼鱼的抗菌酶、碱性磷酸酶(AKP)和超氧化物歧化酶(SOD)活力相对于对照组分别提高18.60%、59.19%和49.89%,差异显著(P<0.05),组织过氧化物酶(POD)活力差异不显著。表明不同浓度的硝化细菌可显著改善罗非鱼苗培育环境的水质,增强罗非鱼苗的抗病力。     

大口黑鲈肌肉生长抑制素前肽真核表达载体的构建及其在肌肉组织中的表达

将大口黑鲈(Micropterus salmoide)肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)前肽(MSTN-Pro)的cDNA定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)/mycHisB中,双酶切检测和测序鉴定证实,插入pcDNA3.1(-)/mycHisB载体中的片段为目的基因的核苷酸序列,MSTN基因前肽cDNA为正向插入,且重组质粒无错配或插入移位等突变。采用肌肉注射法将重组表达质粒注入大口黑鲈背部肌肉组织,在注射后第2天经RT-PCR检测到MSTN前肽基因mRNA的表达,第6天经免疫组化学检测到MSTN前肽蛋白的表达,第8天蛋白表达强度增强,对照组始终未检测到MSTN前肽基因的表达。     

基于CUDA的地表水动态模拟并行方法

如何高效地动态监测、模拟和预测地表水过程是防灾减灾中亟待解决的问题,也是科学化的国土整治、区域规划、环境保护和水资源管理的基础。因此,本文利用统一计算设备架构(CUDA)对基于不规则三角网(TIN)的地表水动态模拟算法进行并行化改进,提出了一种基于CUDA的地表水动态模拟并行方法,旨在对任意时刻的地表水进行快速、高精度的动态模拟,从而满足实际的应用需求。该算法从高精度的数字高程模型(DEM)中提取地形特征点和流域线,生成受流域线约束的TIN。在此基础上,根据TIN表面的三角面坐标数据获取水流方向,再结合任意位置的降雨源点追踪得到流水线网络。基于曼宁公式,利用流水线流速计算核函数得到每条流水线上雨滴的流速,结合预设的时间,利用汇流量统计核函数得到该时刻的地表汇流量。具体的并行化过程包括数据的传输,CUDA中线程的划分和流水线流速计算核函数和汇流量统计核函数的实现。本文选取位于加拿大新布伦瑞克西北部的BBW(Black Brook Watershed)流域作为实验样区,将该算法与改进前的方法进行对比表明,该模型在保持精度的同时,大幅提高了模拟效率,加速比达到11.2;另外,通过与SWAT(Soil and Water Assessment Tool)模型进行对比,结果表明,该并行方法的Nash系数提高了88%,相关系数提高了5%。     

鲶爱德华氏菌间接酶联免疫快速检测法的建立

用鲶爱德华氏菌兔抗血清作为一抗,碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗兔IgG作为酶标二抗,建立黄颡鱼"红头病"病原菌—鲶爱德华氏菌的间接酶联免疫(ELISA)快速检测法,并优化检测条件。抗原最佳包被浓度为107/mL,一抗工作的最佳稀释度为1∶211,病原菌的检测灵敏度为105/mL,交叉反应实验证明该方法特异性强,与迟钝爱德华氏菌、弧菌等13种标准菌株无交叉。应用上述技术对人工感染发病鱼中分离的优势菌进行检测,结果表明阳性检出率为80%;对自然发病黄颡鱼体内分离获得的20株优势菌检测结果表明,12株菌为鲶爱德华氏菌。     

远东拟沙丁鱼抗氧化肽对Caco-2细胞氧化应激损伤的影响

对远东拟沙丁鱼(Sardinops sagax)蛋白进行蛋白酶解和膜分离,得到分子质量100~3 000 u(F1)、3 000~10 000 u(F2)和大于10 000 u(F3)的多肽组分。在生化水平上测定各组分对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、羟基自由基和过氧自由基清除能力;在细胞水平上,以H2O2对Caco-2细胞的毒性及细胞内抗氧化体系的影响为检测指标,筛选最适浓度的H2O2建立细胞氧化应激模型;在建立该模型的基础上,进一步检测蛋白多肽F1对氧化应激损伤细胞的修复功能。结果表明:组分F1对DPPH、ABTS、羟基自由基和过氧自由基清除能力最强,清除率分别为56.03±0.14、86.26±0.32、38.34±1.70、54.85±0.75;100μmol/L的H2O2对细胞毒性作用较小,并可降低细胞中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、总抗氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化物酶(POD)的活性和谷胱甘肽(GSH)的含量,增加丙二醛(MDA)的含量,细胞氧化应激模型选择H2O2浓度为100μmol/L;在该模型条件下,F1对受损的Caco-2细胞中抗氧化体系中的GSH-Px、T-SOD、POD的活性和MDA、GSH的含量有一定恢复作用,可调节细胞中失衡的抗氧化体系。远东拟沙丁鱼多肽FI对细胞氧化应激受损有一定保护作用。     

基于RSIV-RF模型的凉山州泥石流易发性评价

针对随机森林(RF)模型进行泥石流易发性评价过程中存在连续型因子依靠主观意识分级、随机选取的非泥石流样本准确度较低等问题,以位于四川西南部的凉山彝族自治州为研究区,提出基于统计学先验模型抽样的随机森林对研究区进行泥石流易发性评价分区。利用累计灾害频率等曲线的相对变化对连续型因子进行分级处理;采用粗糙集理论(RS)和信息量法(IV)计算加权信息量值,划定极低和低易发性区并从中选择负样本数据。通过袋外误差(OOB)变化曲线确定RF模型的最佳树棵数n＿estimators和分裂特征数max＿features,随后构建加权信息量-随机森林(RSIV-RF)模型预测凉山州泥石流易发性。进一步地,与从全区随机选择非泥石流样本的RF模型开展对比研究。结果表明,训练集和测试集下RSIV-RF模型的准确度分别为0.89,0.83,且对应的ROC曲线的AUC值分别为0.920,0.895,均高于单独的RF模型;RSIV-RF绘制的泥石流易发性评价图与历史灾害分布较为一致,较高和高易发性等级区域占研究区面积比为18.625%,包含了78.57%的泥石流点。性能评估和易发性统计结果均表明基于RSIV-RF能够...