宁波-舟山港口航道水域致病性细菌的毒力基因型鉴定

根据标准对宁波-舟山港口航道致病性细菌进行分离,结合16S r DNA等方法鉴定分离菌株,研究其生理生化特征,通过PCR方法判断其毒力基因型,分析危害风险.结果表明,4个样品采集区的样品经分离鉴定,菌种分别为埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella sp.)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、李斯特菌(Listeria monocytogenes)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)等9种,其中粪肠球菌分离率最高.各种细菌的生理生化及形态特征与已报道陆源细菌相近,携带毒力基因型多样性丰富,提示具备致病力.运行Blast程序对所有分离株16S r DNA序列进行比对,发现与已知序列相似度均在98%以上.研究结果对海洋微生物的毒力基因多样性研究以及危害风险评估提供了基础.     

含铁肠杆菌素受体调节蛋白VPA0148对副溶血弧菌毒力的影响

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种嗜盐性革兰氏阴性菌, 广泛分布于海洋环境中, 能够引起肠胃炎、伤口感染以及败血症, 是人类重要的病原菌之一。宿主体内被认为是一种低铁环境, 能够激发致细菌的毒力。副溶血弧菌能够分泌弧菌素或利用外源铁载体来获取铁。在低铁条件下, 编码双组份调控系统的基因簇VPA0148-VPA0149转录上调, 使含铁肠杆菌素受体PeuA转录出有活性的蛋白。VPA0148编码产物为一个响应调节因子, 具有一个磷酸基团接收结构域和一个DNA结合结构域。本研究发现, VPA0148的缺失增强了菌株的生物膜形成能力和对斑马鱼的致死能力, 同时能够促进菌株在低铁环境中的生长, 并增强菌株的群集运动。研究结果表明含铁肠杆菌素受体调节蛋白VPA0148对副溶血弧菌致病力具有调控作用, 增进了对铁调节副溶血弧菌毒力机制的认识。     

舟山港口航道水域致病性细菌的毒力基因型鉴定

根据标准对宁波,舟山港口航道致病性细菌进行分离,结合16S rDNA等方法鉴定分离菌株,研究其生理生化特征,通过PCR方法判断其毒力基因型,分析危害风险.结果表明,4个样品采集区的样品经分离鉴定,菌种分别为埃希氏大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella sp.）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、李斯特菌（Listeria monocytogenes）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、迟缓爱德华菌（Edwardsiella tarda）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）等9种,其中粪肠球菌分离率最高.各种细菌的生理生化及形态特征与已报道陆源细菌相近,携带毒力基因型多样性丰富,提示具备致病力.运行Blast程序对所有分离株16S rDNA序列进行比对,发现与已知序列相似度均在98%以上.研究结果对海洋微生物的毒力基因多样性研究以及危害风险评估提供了基础.     

一株副溶血弧菌D3112致病性和抗药性的表征

副溶血弧菌广泛分布于海洋环境中,虽然大多数环境菌株并非致病菌,但它们常常携有毒力基因,从而具有潜在的致病性。本文从黄海(山东青岛)海水中分离到一株副溶血弧菌D3112,对其进行了全基因组测序、溶血实验和人工感染实验等。基因组测序分析发现D3112并不含有副溶血弧菌的致病性标志溶血素基因tdh和trh,这与PCR检测结果一致,但含有其他溶血素基因以及多种毒力相关基因。生物学实验显示,该菌可产生明显的溶血现象,而且具有蛋白酶、明胶酶、脂酶和淀粉酶活性,但是缺少卵磷脂酶活性。人工感染实验表明副溶血弧菌D3112具有致病性,感染斑马鱼的半致死剂量约为5×105CFU。药物敏感实验证明了D3112具有多重耐药性。本文对海洋环境中的副溶血弧菌D3112同时开展了基因型和表型研究,为准确评价环境细菌的潜在致病性提供了有用的数据信息。     

两株溶藻弧菌噬菌体的生理特性和基因组研究

利用噬菌体治疗水产养殖细菌病害具有专一性强、自我增殖能力强等优点, 可以有效减少对环境的污染。为了获得可防治水产病原体溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的生物杀菌剂, 本研究以Vibrio alginolyticus ATCC 17749^T为宿主, 从福建省东山岛的对虾养殖场与水产市场污水环境中分离得到两株巨型噬菌体vB_ValM_R10Z和vB_ValM_R11Z, 并分别从噬菌体形态、宿主范围、生命周期和基因组信息等方面进行了鉴定和分析。实验结果显示, 噬菌体R10Z和R11Z具有相似的噬菌斑形态和电镜形态, 属于肌尾噬菌体; 除宿主之外, 噬菌体R10Z和R11Z均能侵染另一株欧文氏弧菌Vibrio owensii JL3186; 两株噬菌体均对氯仿不敏感, 表明其衣壳蛋白不含脂类物质; 噬菌体R10Z和R11Z的潜伏期均为20min, 但裂解量却相差一倍, 分别为45PFU·cell^-1和114PFU·cell^-1; 两株噬菌体的基因组大小分别为247167bp和246831bp, G+C含量分别为41.30%和41.33%, 两者基因组相似性达99.45%, 均未检测出毒力基因与抗药性基因; 系统发育分析显示两株噬菌体均属于Myoviridae(科), Tevenvirinae(亚科), Schizotequatrovirus(属), 同源基因在环境中分布广泛。两株噬菌体性状优良, 在水产病害的噬菌体治疗领域具有重要的研究价值和潜在的应用价值。     

斑节对虾病原菌胞外产物的致病性研究

由养殖濒死病虾体内分离的副溶血弧菌(2019#)、溶藻弧菌(4302#)和嗜水气单胞菌(1003#)培养液中分别提取了胞外产物,测定了酶成分,定量分析了蛋白酶及磷酸酯酶的活性.用细菌胞外产物粗提液对斑节对虾进行致死试验,戊二醛固定致死对虾的肝组织,电镜观察了斑节对虾肝组织的超微病变,初步探讨了三株细菌胞外产物诱发虾病的病理.     

3种致病弧菌感染对大黄鱼7种酶活性的影响

大黄鱼溃疡病主要由3种致病弧菌引起:溶藻弧菌Vibrio alginolyticus、哈维弧菌V. harveyi和副溶血弧菌V. parahaemolyticus。为了解大黄鱼抗病原菌感染的免疫反应机理,对其疾病防御提供重要的理论基础,本实验将健康的大黄鱼随机分为3个实验组和1个对照组,分别注射0.2 mL的哈维弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌及灭菌生理盐水。在人工感染后的第0,1,2,4,7,10,13,16,20天分别采样,通过测定每组大黄鱼血清中7种免疫相关酶活性,比较这3种致病弧菌对大黄鱼影响的差异性。结果表明:在感染后的1～10 d,实验组大黄鱼血清中血清溶菌酶(LSZ)、酸性磷酸酶(ACP)、过氧化物酶(POD)、髓过氧化物酶(MPO)的活性变化,总体表现为先升高、后降低再逐渐升高最后趋于-致的现象,且不同病原菌之间存在-定的时效差异。 碱性磷酸酶(AKP)对入侵体内的哈氏弧菌反应较敏感,ACP、POD和MPO对溶藻弧菌反应较敏感,LSZ和PO对副溶血弧菌反应较敏感。     

罗氏沼虾线粒体锰超氧化物歧化酶的克隆表达与功能研究

罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)是我国重要的经济虾类之一。近年来, 细菌性感染造成罗氏沼虾养殖业病害频发, 经济损失巨大。因此了解其免疫机制对于指导疾病防控至关重要。线粒体锰超氧化物歧化酶(mitochondrial manganese superoxide dismutase, mMnSOD)被认为是抵御氧化应激的第一道防线, 在先天性免疫中具有至关重要的作用。目前, 甲壳动物中mMnSOD的免疫功能尚不清楚。为此, 本研究克隆了罗氏沼虾mMnSOD基因(mMnSOD of M. rosenbergii, MrmMnSOD), 制备了多克隆抗体, 分析了嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染下, MrmMnSOD在不同组织中的表达模式。结果显示, 肝胰腺和肠组织中MrmMnSOD的基因表达水平分别在感染后3h和6h达到最大; 组织免疫荧光分析显示, 肝胰腺和肠组织中MrmMnSOD均在感染后12h达到最大荧光强度。以上结果表明, mMnSOD参与了罗氏沼虾对嗜水气单胞菌的免疫应激反应。进一步的蛋白抑菌实验表明, MrmMnSOD可显著抑制大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的生长, 推测该蛋白可能属于免疫相关分子, 可通过抑菌反应发挥免疫功能。当前的研究结果进一步丰富了甲壳动物先天性免疫基础理论, 也可为今后罗氏沼虾的病害防控和药物研发提供新的靶点参考。     

石斑鱼及暂养环境中副溶血弧菌分离鉴定与毒力评价

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)存在于海洋环境和海产品中,可引起人的食物中毒。本研究的目的是对某地石斑鱼暂养环境的副溶血弧菌的致病风险进行评价。结合弧菌选择性培养基TCBS、gyr B基因和16Sr RNA特定片段的序列分析方法对分离菌株进行鉴定;通过PCR检测毒力基因,血琼脂平板溶血实验、细胞感染实验、KM鼠灌胃实验分别检测各菌株的致病性、溶血性、细胞毒性与肠毒性。共鉴定出4株具有毒力的副溶血弧菌,分别为HS51-5、HS54-4、MJ01-1和MJ03-1。所有菌株都检测到溶血素基因(tdh和tlh)、三型分泌系统(T3SS)基因簇1(T3SS-1)的4个效应蛋白基因(vop Q、vop R、vop S和vpa0450)、和基因簇2(T3SS-2)的1个效应蛋白基因(Vop A)的分布,同时在HS51-5和HS54-4还检测到T3SS-2中的其他3个效应蛋白基因(vop C、vop T和vop L)。所有菌株都具有溶血现象、细胞毒性以及对小鼠的致死能力,而HS54-4、MJ01-1、MJ03-1对小鼠的毒力明显强于HS51-5。因此,从毒力基因检测、神奈川溶血、细胞毒性和对小鼠的毒力等4个方面的结果都表明副溶血弧菌具有致病性,说明石斑鱼暂养环境的副溶血弧菌具有致病风险,应加强对这些环境的监测。     

弧菌毒力基因水平转移与进化的研究进展

弧菌是一类世界范围内广泛分布的革兰氏阴性杆菌,是引起人类、水生动物细菌性疾病的重要病原之一。与其它病原微生物一样,弧菌的致病性与其产生的多种毒力因子息息相关,毒力基因是产生各种毒力因子的物质基础。就霍乱弧菌Vibrio cholerae、副溶血弧菌V．parahaemolyticus、拟态弧菌V．mimicus、溶藻弧菌V．alginolyticus、鳗弧菌V．anguillarum等人类和水生动物病原弧菌的多种毒力因子编码基因的种类,以及毒力基因的种间与株间水平转移和毒力株进化的研究进展进行了综述,同时也对此研究中存在的问题,特别是与水生动物病害相关的问题进行了探讨,并提出了开展毒力基因多样性研究与检测的建议。     

Khai岛和Pathiu岛珊瑚礁沉积物细菌多样性及细菌粗提物延缓秀丽隐杆线虫衰老活性研究*

在Khai岛和Pathiu岛珊瑚礁生长海域采集2份珊瑚礁沉积物样品, 将样品预处理后采用6种分离培养基进行分离培养, 获得活性海洋细菌菌株, 通过PCR扩增和16s rRNA基因序列测定, 分析物种多样性, 并构建系统发育树。以模式生物秀丽隐杆线虫为模型考察菌株发酵提取物延缓衰老的作用。实验结果表明, 从4种样品中分离鉴定出22株细菌, 分别属于11目13科14属。16S rRNA基因序列相似性低于98.65%的细菌有2株, 疑似为潜在新种。GXIMD014 (Vibrio galatheae)和GXIMD112 (Kocuria kristinae)的500μg·mL^-1细菌粗提物具有延缓线虫衰老的活性, 能不同程度的延长线虫寿命, 提高线虫产卵量、运动能力、热激损伤能力、抗氧化损伤能力、体内酶活性以及改善虫体表皮形态。Khai岛和Pathiu岛珊瑚礁沉积物细菌具有较高的物种多样性, 蕴藏着丰富的微生物资源, 且部分细菌菌株具有延缓衰老的生物活性。     

饵料中添加自然产物对豹纹鳃棘鲈生长和体色的影响

为探究自然成分添加剂对东星斑Plectropomus Leopardus的影响,选择了虾青素、叶黄素、螺旋藻和玉米蛋白粉4种自然产物,以不同量分别添加到石斑鱼配合饵料中制成实验饵料,在循环水养殖系统中喂养东星斑75 d,测定了实验前后东星斑的生长率、特定生长率、饵料系数3个主要生长指标和鱼体代表部位的体色指标。结果显示,4种添加物对东星斑的增重率、特定生长率和饵料系数均无显著影响(P<0.05,下同);4种添加物均使东星斑的体色亮度L^*值略变小,且部分体色L^*值影响显著;4种添加物均能使东星斑的a^*值和b^*值升高,且与空白对照组比差异显著,尤其是虾青素,对东星斑体色整体变红、变黄效果最为显著。     

夏季珠江口及近岸海域悬浮颗粒物生物硅分析

2017年6月在珠江口及近岸海域61个站位采集了悬浮颗粒物生物硅(BSi,biogenic silica)和叶绿素a(Chl a)。利用RAGUENEAU et al(2005)提出的碱提取法测定了悬浮颗粒物生物硅,探讨不同环境条件下BSi浓度以及碱性提取液中岩源硅(LSi,lithogenic silica)的干扰程度。结果显示,Chl a质量浓度范围为0.06~8.64 μg·L^-1,悬浮颗粒物BSi浓度从低于检测限到14.3 μmol·L^-1,LSi浓度范围为0.00~9.56 μmol·L^-1;LSi/(LSi+BSi)比均值为0.38 mol·mol^-1。提取液中测得的Si/Al比均值为2.42 mol·mol^-1,与RAGUENEAU et al(2005)报道值接近。研究区域内的表层BSi反映了硅藻的生物量,与Chl a存在显著线性相关。LSi对BSi测量的干扰程度存在明显的空间差异,总体上近岸BSi和LSi高,LSi/(LSi+BSi)比低;外海BSi和LSi低,LSi/(LSi+BSi)比高;河口内BSi低,LSi高,LSi/(LSi+BSi)比高;上升流区BSi和LSi高,LSi/(LSi+BSi)比高;底层较表层具有更高的LSi和LSi/(LSi+BSi)比。最后,对常用的几种碱提取法在应用时存在的问题作了探讨。     

海洋弧菌HN897 β-琼脂糖酶基因vas1-1339异源表达及活性分析

海洋弧菌HN897株是一株高产琼脂糖酶的Vibrio astriarenae菌, 前期功能缺失实验证明其β-琼脂糖酶基因vas1-1339的缺失可显著降低弧菌HN897株的琼脂水解活性。文章在大肠杆菌中异源表达Vas1-1339基因编码蛋白, 分析该基因的表达及蛋白功能活性。首先, 构建含vas1-1339基因开放阅读框全长的表达载体pET28a-1339, 利用原核表达技术在大肠杆菌中成功地异源表达了Vas1-1339琼脂糖酶; 然后, 利用卢戈氏碘液染色分析发现异源表达Vas1-1339琼脂糖酶的大肠杆菌能够高效水解琼脂, 且异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)最优诱导浓度为10μmol·L^-1; 免疫印迹分析发现胞内基因表达产物羧基端可能存在切割现象, 推测Vas1-1339琼脂糖酶存在复杂的成熟过程。对纯化的琼脂糖酶活性分析发现海洋弧菌HN897株β-琼脂糖酶Vas1-1339能够独立发挥琼脂糖降解功能。     

北部湾养殖牡蛎体内异养细菌数量及其耐药性研究

为了探究北部湾养殖区域香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)体内的异养细菌和弧菌数量及其耐药概况变化, 对不同养殖场牡蛎体内的异养细菌进行分离培养, 并统计其数量, 通过药敏纸片扩散等方法研究了细菌的耐药状况。结果显示: 牡蛎在高死亡率养殖环境中体内的异养细菌[(8.6±0.4)×10⁶CFU·g^-1]和弧菌[(9.5±0.4)×10⁵CFU·g^-1]数量较高, 在中死亡率环境中体内的异养细菌[(6.9±0.2)×10⁶CFU·g^-1]和弧菌[(4.5±0.6)×10⁵CFU·g^-1]数量次之, 在低死亡率养殖环境中体内的异养细菌[(3.3±0.1)×10⁶CFU·g^-1]和弧菌[(2.5±0.6)×10⁵CFU·g^-1]数量最低。耐药细菌主要为革兰氏阴性菌, 对β-内酰胺类(青霉素)、糖肽类(万古霉素)的耐药率较高, 对四环素类(四环素、多西环素)的耐药率次之, 对氨基糖苷类(链霉素、庆大霉素、妥布霉素、新霉素)、大环内酯类(红霉素)、喹诺酮类(诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、恩诺沙星)的耐药率较低。在高死亡率环境中牡蛎体内的多重耐药菌占79.7%, 其耐药谱型(48种)较广; 在中度死亡率环境中牡蛎体内的多重耐药菌占66.2%, 其耐药谱型为30种; 在低死亡率环境中牡蛎体内的多重耐药菌占58.4%, 其耐药谱型为17种。本文探究了牡蛎死亡率与其体内异养细菌数量和细菌耐药性的关系, 结果显示牡蛎在高死亡率环境中体内的耐药细菌数量多、耐药谱型较广, 低死亡率环境中牡蛎体内的耐药细菌数量较少, 异养细菌数量与牡蛎死亡率呈正相关关系, 两者相关系数为0.996。     

长江口可培养耐(嗜)盐细菌群落结构研究

针对长江口10个站位样品,采用HM培养基和ZMCA培养基分离培养耐(嗜)盐菌,通过PCR方法获取156株细菌的16S rDNA序列。其中,由HM培养基分离获得136株菌株,可划分为33个分类单元(OUT),分属α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)的芽孢杆菌纲(Bacilli)3个类群,其中γ-变形菌纲为优势耐(嗜)盐细菌;靠近海岸的站点M5-1,N6-2和M4-1耐(嗜)盐细菌均属于厚壁菌门,而远离海岸的站点耐(嗜)盐细菌均属于变形菌门。以ZMCA培养基分离获得的20株菌株分属α-变形菌纲和放线菌纲(Actinobacteria),可划分为10个OTU。由HM培养基分离获得的菌株中,70.5%属于耐盐菌,29.5%属于中度嗜盐菌;由ZMCA培养基分离获得的菌株均为耐盐菌。HM培养基分离得到的136株细菌的硝酸盐和亚硝酸盐还原性分析表明,亚硝酸盐还原菌数量仅为硝酸盐还原菌的1/3左右。     

别样玫瑰变色杆菌(Aliiroseovarius sp.)Z3基因组测序及比较基因组分析

菌株Z3是一株从凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肠道样品中分离出的细菌。本研究利用Illumina HiSeq测序平台对其进行了测序, 用SOAPdenovo等软件进行基因组组装、系统发育分析、基因预测和功能注释, 并与别样玫瑰变色杆菌属(Aliiroseovarius)已知的5个种的模式株进行了比较基因组分析。基因组注释结果显示, Z3基因组大小为3525503bp, GC(guanylate and cytidylic acid)含量为59.4%, 预测包含3509个编码蛋白基因。通过16S rRNA基因全长序列比对、平均核苷酸一致性(ANI)、DNA-DNA杂交(DDH)和共线性分析发现, 菌株Z3与Aliiroseovarius crassostreae CV919-312T的16S rRNA基因全长序列相似度最高, 为98.20%, 与Aliiroseovarius sediminilitoris DSM 29439T的DDH和ANI值最高, 分别为26.80%和84.95%, 属于Alliroseovarius属的新种, 将其命名为Aliiroseovarius sp. Z3。经比较基因组分析发现, Aliiroseovarius sp. Z3与5个近缘的模式株细菌共享2005个直系同源核心基因簇; Z3拥有的413个独立基因经注释, 主要与碳水化合物转运与代谢、氨基酸转运与代谢、复制、重组及修复等功能相关。功能注释发现Z3具有进行完整的反硝化途径的相关基因, 其利用的可能是环境中的硝酸盐、亚硝酸盐等。本研究对Z3全基因序列的注释、功能和比较基因组的分析, 不仅丰富了Aliiroseovarius属细菌基因组资源, 还为深入研究其反硝化特性等提供了基础。     

中国西沙群岛底栖甲藻热带库里亚藻(Coolia tropicalis)的形态学、系统发育及毒性研究

库里亚藻(Coolia)是一类广泛分布且具有生物毒性的海洋底栖甲藻。本研究对近年来在中国南海西沙群岛海域采集分离的4株库里亚藻, 通过光镜及电镜下的形态学观察, 并结合基于核糖体大亚基(large subunit, LSU)rDNA(D1-D3)和内部转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)的序列进行系统发育分析, 鉴定该4个株系为热带库里亚藻(Coolia tropicalis)。在卤虫(Artemia salina)生物毒性试验中, 热带库里亚藻不同株系毒素提取液对卤虫幼虫表现出了毒性差异, XS554株系的48h半致死浓度(LC50)为1.42mg·mL ^-1(约相当于1.1×10 ⁵cells·mL ^-1), 5XS15株系的LC50为1.92mg·mL ^-1(约相当于1×10 ⁵cells·mL ^-1)。