中华绒螯蟹多倍体诱导技术改进

采用抑制第二极体排放的方式对15℃孵育的中华绒螯蟹自然受精卵人工诱导三倍体,通过抑制第一次卵裂对18℃孵育的自然受精卵人工诱导四倍体,应用流式细胞仪进行倍性鉴定.分别使用CB,6-DMAP和KCl三种试剂对受精卵处理,发育至囊胚期检测,获得的最高三倍体诱导率依次是49.1%,51.7%和77.5%,获得的最高四倍体诱导率依次是50.3%,54.9%和79.8%.使用KCl试剂对抱卵蟹诱导处理,孵出潘状幼体检测,最高三倍体诱导率为85.3%,最高四倍体诱导率为27.3%.克服了以往三倍体诱导中离体培养的困难,首次获得了中华绒螯蟹三倍体潘状幼体,并极大提高了潘状幼体阶段四倍体诱导率.     

β-胡萝卜素对中华绒螯蟹卵巢发育及免疫学指标的影响

通过投喂添加β-胡萝卜素质量比分别为50,100 mg/kg的实验饲料,饲养中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)60 d,探讨了对中华绒螯蟹卵巢发育及免疫学指标的影响。结果表明,β-胡萝卜素能够明显增加中华绒螯蟹的质量,提高养殖成活率;极显著提高中华绒螯蟹血细胞吞噬百分率(P<0.01);显著或极显著降低血清超氧化物歧化酶活力(P<0.05或P<0.01);极显著增加卵巢中总类胡萝卜素的含量(P<0.01);显著增加肝胰腺中总类胡萝卜素的含量(P<0.05);较明显增加中华绒螯蟹卵巢指数和卵母细胞直径,但对于肝胰腺指数、卵巢和肝胰腺蛋白质影响较小。     

白芍(Radix paeoniae alba)提取物对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)造血组织发育及造血因子Astakine的影响

血淋巴细胞在甲壳动物免疫反应中起着非常重要的作用,其主要由造血组织(Hematopoietic tissue, HPT)生成并随着开管式循环分布到身体各处。到目前为止,还没有相关研究表明甲壳动物造血组织是否受草本植物的影响。本研究以中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)为对象,利用荧光定量PCR、免疫荧光和组织化学等技术,初步探索了白芍(Radix paeoniae alba)提取物对中华绒螯蟹造血组织和造血因子Astakine的影响。结果显示,在原代培养的造血组织细胞中添加终浓度为0.85mg/mL的白芍提取物后,造血因子Astakine mRNA的表达量显著上调(P0.05)。进一步制备含1%白芍提取物的中华绒螯蟹饲料并进行饲喂实验,结果显示饲喂含白芍提取物饲料的中华绒螯蟹造血组织的Astakine mRNA的表达量较饲喂前上调了10.5倍,要高于对照组。免疫荧光结果同样表明,饲喂含白芍提取物饲料后中华绒螯蟹造血组织的Astakine蛋白荧光信号也要强于对照组。通过造血组织的形态学观察和造血组织体重百分比的检测,我们发现白芍组中华绒螯蟹造血组织含有较多卵形小叶,且造血组织体重百分比较饲喂前增加了6.64%,而对照组仅增加1.6%。免疫保护率实验显示,在脂多糖急性刺激下,白芍添加组的中华绒螯蟹的存活率(77.5%)要高于对照组(57.5%)。综上所述,白芍提取物可以促进中华绒螯蟹造血因子的表达和造血组织的发育,从而提高中华绒螯蟹的免疫调节功能。     

利用咖啡因和热休克诱导太平洋牡蛎三倍体

报道采用咖啡因和热休克相结合的方法 ,抑制受精卵第二极体释放诱导太平洋牡蛎三倍体的优化方案。实验结果表明 ,三倍体诱导率随着咖啡因浓度的增高而增高 ,D形幼虫的孵化率却随着咖啡因浓度的增高而降低 ;所进行 30～ 36℃热休克温度试验 ,其对三倍体诱导率影响不大 ,但对孵化率影响明显。在 2 3～ 2 5℃条件下 ,当 50 %受精卵出现第一极体时 ,用浓度为 2 g/ L的咖啡因 ,结合 33℃± 1℃的热休克 ,处理牡蛎受精卵 15min,三倍体诱导率达 80 %以上 ,孵化率在 4 5%左右。通过此法诱导的三倍体群幼虫的成活与生长情况与其二倍体群体无明显差异。     

葡萄糖对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)眼柄CHH免疫阳性细胞ICa的影响

依据中华绒螯蟹正常血糖水平和摄食、饥饿条件下的血糖变动范围[(0.43±0.06)—(0.73±0.08)mmol/L],选择不同浓度葡萄糖,采用全细胞膜片钳技术,在单个细胞水平观察葡萄糖对中华绒螯蟹眼柄分泌CHH细胞高电压激活钙电流(ICa)的调控作用,探讨眼柄神经内分泌调控的生物物理机制。通过实时监测细胞膜电容的变化,观察去极化电压诱导的分泌CHH细胞ICa对细胞分泌的影响,发现ICa的大小与细胞的分泌强度呈明显的正相关;灌流正常中华绒螯蟹生理浓度的葡萄糖(0.3、0.9、1mmol/L)对细胞ICa无明显影响,高浓度葡萄糖(3、10mmol/L)灌流10—20min,对细胞ICa产生显著的抑制作用,但对细胞膜通道的激活、失活电压等电生理特征无明显的影响。这表明血糖水平通过抑制细胞ICa对中华绒螯蟹眼柄CHH神经多肽激素分泌活动产生快速的负反馈调节,以维持中华绒螯蟹的正常生理血糖水平。     

高盐诱导太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)三倍体的初步研究

初步探讨了利用高盐抑制受精卵第2极体(PB2)的释放的方法诱导太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)三倍体。水温25℃条件下,分别进行不同高盐处理(盐度梯度为40、45、50、55、60、65、70、75、80)、不同处理时机(受精卵出现第一个PB1,30%和50%PB1,出现第一个PB2,50%PB2)和不同持续处理时间(10~25min)的实验,通过胚胎孵化率、三倍体诱导率及综合评价指数的分析表明,高盐诱导太平洋牡蛎三倍体的最适方案为:当50%受精卵出第一极体时,以盐度为65的高盐海水处理受精卵20min,三倍体诱导率最高达65.53%。     

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)肠道和肝胰腺5-羟色胺(5-HT)和5-羟色胺受体2(5-HTR2)的定位研究

肠道和肝胰腺是中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)重要的消化器官,本文运用组织学技术测量了中肠和后肠长度,并对肠道长与体长进行相关性分析。应用免疫组化技术对5-HT和5-HT受体2进行组织定位和计数。结果表明:(1)中华绒螯蟹的肠道长与体长接近,两者之间呈极显著正相关(P0.01)。后肠长度约为中肠的2倍;(2)5-HT和5-HT受体2在中肠和后肠中的组织定位和数量相似,均分布于黏膜上皮细胞间和肌层与外膜交界处,亦见于后肠的固有膜和黏膜下层与肌层交界处,在肠球外膜中也有大量分布;(3)5-HT和5-HT受体2阳性物质在肝胰腺的四种细胞的胞核中均有分布,在F细胞的胞质中也有分布。5-HT和5-HT受体2在中华绒螯蟹肠道和肝胰腺组织中的分布规律一致,表明中华绒螯蟹消化道5-HT发挥生理功能可能与5-HT受体2有关。此外,5-HT和5-HT受体2在后肠近肌细胞分布的特点可能与肠道收缩有关。后肠在中华绒螯蟹消化生理中的作用应引起重视。     

东平湖草鱼-中华绒螯蟹复合生态养殖模式的初步研究

近年来,随着湖泊富营养化程度的加深,菹草疯长及其腐败给湖区环境造成了严重破坏。本文采用不投喂方式,对比研究了东平湖草鱼-中华绒螯蟹不同复合养殖模式下鱼、蟹生长情况及其对底质碳(C)、氮(N)、磷(P)营养盐含量的影响,来筛选适宜东平湖的生态养殖模式。结果表明,草鱼的摄食作用能有效控制菹草生物量,减轻菹草腐败带来的底质污染;中华绒螯蟹在整个养殖期间能在一定程度上控制或减轻底质碳氮磷含量,达到"养底"目的;综合比较发现,C2E1(草鱼2 ind/m~2,中华绒螯蟹1 ind/m~2)为最佳生态养殖模式,鱼、蟹生长状况最优,可生产草鱼31037.04 Kg/ha,中华绒螯蟹359.94Kg/ha,同时每产出1 t草鱼可从环境中带走129.43 Kg的C、27.83 Kg的N及3.30 Kg的P,每产出1 t中华绒螯蟹可从环境中带走121.51 Kg的C、17.22 Kg的N及1.89 Kg的P,养殖经济效益和生态效益均比较理想。     

中华绒螯蟹眼柄神经内分泌细胞胞吐分泌活动的实时监测

首次应用膜片钳技术 ,通过监测细胞膜电容变化的方法实时测定去极化电刺激诱导的单个中华绒螯蟹眼柄神经内分泌细胞释放甲壳动物高糖激素 (CHH)的胞吐分泌活动。结果表明 ,膜电容检测法适用于中华绒螯蟹眼柄神经内分泌细胞胞吐分泌活动的监测 ,在细胞的分泌过程中清晰地记录到膜电容的增加。膜电容的增加与去极化时间相关。去极化2 0ms,细胞的膜电容开始增加 ;2 2 0ms的去极化诱导细胞分泌CHH达到饱和 ,膜电容增加约(5 2 1± 3 6 )fF(n =5 )。不同幅值去极化电压诱导细胞分泌活动监测结果表明 ,只有当去极化电压超过钙离子通道激活阈值才会引起细胞膜电容的增加。这一结果提示中华绒螯蟹眼柄神经肽类激素为细胞外钙离子依赖性分泌。     

利用不同盐度诱导长牡蛎三倍体的研究

采用低盐度(4、6、8、10、12、14、16)和高盐度(40、45、50、55、60、65、70)在40%~50%受精卵出现第一极体时处理10和15min,进行长牡蛎三倍体的诱导。在低盐度诱导三倍体实验中,随着盐度降低,D型幼虫孵化率逐渐降低,处理10和15min的卵裂率差异显著(P0.05),孵化率差异不显著(P0.05)。当盐度为8时,处理受精卵10与15min,三倍体诱导率最高分别可达84.4%和91.0%,两处理组三倍体诱导率差异显著(P0.05)。在高盐度诱导三倍体实验中,随着盐度升高,D型幼虫孵化率逐渐降低,处理10和15min的卵裂率和孵化率均差异显著(P0.05)。当盐度为55时,处理受精卵10min,三倍体诱导率最高为80.3%;当盐度为60时,处理受精卵15min,三倍体诱导率最高为97.1%,两处理组三倍体诱导率差异显著(P0.05)。研究发现,在盐度为8和60条件下,40%~50%的受精卵出现第一极体时,处理15min,长牡蛎三倍体诱导率最高。     

Improvement of polyploidy induction in Eriocheir sinensis

An incubating temperature of 15℃ is used to induce triploidy in Eriocheir sinensis through inhibition of the release of polar body I1, and that of 18℃ to induce tetraploidy through inhibition of the first cleavage. Flow cytometry is used to identify the ploidy in different developmental stages. For induction of triploidy in fertilized eggs in vitro, the highest induction rate observed in blastula by cytochalasin B, 6-DMAP and KC1 is 49.1%, 51.7% and 77.5%, respectively. In the KC1 treatment of pregnant crabs with the fertilized eggs, the highest triploid induction rate observed in the zoea is 85.3%. For induction of tetraploidy, the highest induction rate observed in the blastula by cytochaslasin B, 6-DMAP and KC1 is 50.3%, 54.9% and 79.8% respectively. In the KC1 treatment of pregnant crabs with the fertilized eggs, the highest induction rate in zoea is 27.3%. Through this study such difficulty as in vitro culture is overcome. Triploid zoea Eriocheir sinensis has been developed for the fh‘st time. The induction rate of tetraploid zoea has also been greatly improved.     

提高太平洋牡蛎三倍体诱导率的几项技术措施

本文根据1996－2000年从事牡蛎三倍体育苗与养殖技术研究的生产试验中，主要从加强亲贝蓄养，让亲贝充分成熟；卵子的离体海水促熟培育，让卵子发育同步；洗卵处理；受精卵密度的掌握；三倍体诱导参数；外部环境条件等六方面探讨了如何提高牡蛎三倍体诱导率，以满足规模化生产的需要，推动牡蛎三倍体养殖业的发展。     

半滑舌鳎三倍体诱导研究

采用冷休克抑制第二极体排出的方法诱导了半滑舌鳎三倍体,并探讨了三倍体诱导的最佳条件.通过流式细胞仪倍性检测和染色体观察验证各组三倍化率.结果显示:在受精后5 min开始,将受精卵放在4℃海水中进行冷休克处理,持续时间为20 min,三倍体诱导率最高为35％.通过对三倍体染色体进行分析,辨认其雌雄染色体型为ZWW/ZZZ,出现频率为1∶1,没有发现ZZW型雌鱼,暗示半滑舌鳎Z染色体和W染色体之间的交叉和互换受到严重抑制.     

氯化钾诱导仿刺参(Apostichopus japonicus)幼虫附着变态的研究

以不同浓度的氯化钾(KCl)溶液处理仿刺参(Apostichopus japonicus)樽形幼虫,处理不同时间后,分析KCl对仿刺参幼虫附着变态的诱导作用。结果表明,使用较低浓度的KCl溶液(10、30和50 mmol/L)分别诱导仿刺参樽形幼虫6、12和24 h均可以显著提高其附着变态率,诱导24 h附着变态率分别提高27.67%、32.67%和19.67%。较高浓度的KCl溶液(100、300和500 mmol/L)也可以诱导仿刺参幼虫附着变态,但随着KCl浓度的升高和诱导时间的延长,幼虫死亡率逐渐升高。低浓度KCl溶液,特别是在30 mmol/L诱导仿刺参幼虫12 h时,可以显著提高幼虫的附着变态率,增加发育的同步性,降低死亡率,对仿刺参幼虫变态的诱导效果较好。     

我国太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)三倍体育苗与养殖技术研究进展

主要介绍太平洋牡蛎三倍体的基础研究和产业化显示度。在基础研究方面 ,主要阐述了三倍体诱导技术、活体倍性快速检测技术、诱导剂对受精卵和胚胎超微结构的影响、三倍体牡蛎核型与带型、三倍体牡蛎同工酶的表达及快速生长机理等方面的技术储备 ;在产业化显示度方面 ,综述了三倍体牡蛎育苗与养殖的技术及效果     

Production of Aneuploid Pinctada martensii Dunker in Tetraploid Induction

Aneuploidy embryos of Pinctada martensii Dunker are produced during tetraploid induction by inhibiting the first polar body in eggs from triploid fertilized with haploid sperms with cytochalasin B treatment. Chromosome analysis reveals that there are 88.18 ±6.79% aneuploidy embryos, and 28.70% aneuploids in pearl oysters of one-year age These aneuploids have five chromosomal conditions, such as 2n + 1(29), 2n + 2 (30), 3n-2 (40), 3n-1(41) and 3n + 1 (43). Results of growth measurement show that there is no significant difference between aneuploids (as a group) and diploids in body size and weight (p ＞ 0.10), but the aneuploide is obviously different from triploid (p ＜ 0.01). The mean body size and weight of aneuploids in diploid condition (2n ± 1 and 2n ± 2) are significantly smaller than those of diploids (p ＜ 0.01),but aneuploids within triploid condition (3n ± 1 and 3n ± 2) are not smaller than diploids in body size and weight (p ＞ 0.1).This study indicates Pinctada martensii Dunker could tolerate aneuploidy by 7 ～ 14% of the haploid genome, and that aneuploids of this species are viable under certain conditions.     

杂色鲍和九孔鲍三倍体的化学诱导

本文首次报道了用化学药物法（ＣＢ、咖啡因以及高ＰＨ高钙溶液）休克杂色鲍和九孔鲍受粗卵诱导产生三倍体的试验结果。结果表明,用ＣＢ诱导杂色鲍,三倍体诱导率高达５９．０￣７６．２％;用咖啡因诱导杂色鲍和九孔鲍,三倍体导率低,分别为３０￣２０％。本就它们在诱导中的作用机理进行了讨论。     

Cytochalasin B induced triploidy in Penaeus chinensis

ＣｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎＢｉｎｄｕｃｅｄｔｒｉｐｌｏｉｄｙｉｎＰｅｎａｅｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ￥ＢａｏＺｈｅｎｍｉｎ，ＺｈａｎｇＱｕａｎｑｉ，ＷａｎｇＨａｉａｎｄＤａｉＪｉｘｕｎ（ＲｅｃｅｉｖｅｄＡｐｒｉｌ５，１９９３；ａｃｃｅｐｔｅｄＡｕｇｕｓｔ１...     

用mRNA差异显示技术分析中华绒螯蟹早期发育的基因表达

用中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis)未受精卵、受精卵、二细胞胚、囊胚、原物胚为材料，提取总RNA，分别用Oligod T12GA、GC、AC3种锚定引物合成以上5种材料的cDNA第一链，然后以此cDNA为模板用30种随机引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分析。得出了5个早期发育的特异表达片段。结果表明，未受精卵、受精卵、二细胞胚之间的差异不大，都表面为母型调控，囊胚期有新mRNA的转录，开始进入合子型调控。