Bohaisea-9145海洋耶氏酵母碱性脂肪酶基因的克隆、异源表达和重组酶酶学性质

采用基因重组和分子生物学相关技术,对Yarrowia lipolytica Bohaisea-9145海洋低温碱性脂肪酶(Y.lipolytica Bohaisea-9145,LipYp)基因lipYp(1116bp)克隆并在Pichia pastoris中进行了异源真核表达研究。通过MD和MM平板及PCR扩增,筛选和鉴定了重组子。结果表明,阳性重组子经摇瓶发酵54h后上清液酶活力达到1956U/ml。发酵液经两步纯化得到在SDS-PAGE上显示为单一条带的重组脂肪酶。实验同时研究了不同反应温度、pH值对重组LipYp活力和稳定性的影响,结果显示重组LipYp最适反应温度和pH分别为35℃和8.5,在pH7.0-10.5之间以及45℃以下有较好稳定性。另外,重组脂肪酶对中长链对硝基苯基酯类和甘油三酯类(C10-C12)有较强的水解能力。     

分子伴侣共表达对低温脂肪酶Lip-837异源可溶性表达的影响

将南极嗜冷菌Moritella sp.2-5-10-1的低温脂肪酶基因Lip-837克隆到表达载体pCold Ⅲ中,成功构建了重组质粒pColdⅢ+Lip-837,并转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3).SDS-PAGE实验结果表明,实现了该基因在E.coli的异源表达,且其表达量达到细胞总蛋白的39%;但表达...     

壳聚糖酶基因在解脂耶氏酵母中的表达及重组酶性质研究

为构建高效表达壳聚糖酶工程菌株,以Microbacteriumsp.基因组为模板扩增壳聚糖酶基因,目的基因与表达载体pINA1317连接构建重组质粒,重组质粒NotⅠ酶切线性化后转化解脂耶氏酵母Y.liPolytica Po1h。所得结果为PCR扩增得到约1000bp的特异性片段,序列分析表明含有壳聚糖酶全长基因,开放阅读框801bp,编码266个氨基酸残基。转化子酶活力为10.4U/mL,是原菌株酶活力的3.15倍。重组蛋白经DEAE-Sepharose FF分离纯化,达到电泳纯,SDS-PAGE显示单一条带,分子量约41kDa。重组酶反应最适温度为45℃,最适pH为5.6,Km和Vmax分别是0.926mg/mL和6.15U/mL。质谱分析酶解产物主要为三糖和五糖。实现了壳聚糖酶在解脂耶氏酵母中的分泌表达,为壳聚糖酶的工业化生产奠定了理论基础。     

低温脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达研究

将已有的低温脂肪酶基因克隆至表达载体pPICZα上,并转化毕赤酵母X-33。在低温条件下诱导培养6d后,发酵液中可检测到低温脂肪酶活力。重组酵母发酵液加入二硫苏糖醇后单位酶活力达到32U/mL,与未加入该试剂的原始菌株相比提高4倍以上。对重组脂肪酶的酶学性质研究表明,其最适pH为8.0,最适温度为35℃,50℃温浴30min后,仍有30.04%的活性。以不同碳链长度的4-Nitrophenyl Ester为底物检测其底物特异性,结果显示其较适合作用于短链底物。重组酵母能够在BMMY培养基中胞外分泌表达带有His标签的重组脂肪酶,经镍柱纯化后,SDS-PAGE检测可得到大约35kDa的单一蛋白质条带。     

海洋酵母菌胞外酶及其基因的最新研究进展

综述海洋酵母菌所产多种胞外酶的生产、纯酶性质及基因克隆工作的最新研究进展.从实验室建立的500多株海洋酵母菌种资源库中筛选出了数十株可以产生多种不同活性胞外酶的海洋酵母菌,它们分别属于耶鲁维亚酵母菌(Yarrowia)、类酵母(Aureobasidium)、毕赤氏酵母菌(Pichia)、梅奇酵母菌(Metschnikowia)和隐球酵母菌(Cryptococcus)等不同种属.所产生的胞外酶主要包括纤维素酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、淀粉酶(包括生淀粉酶)、菊糖酶、脂酶、植酸酶和嗜杀因子等.深入进行了各种胞外酶的生产,纯化及纯酶的性质研究,并对部分菌株的胞外酶基因进行了克隆、测序和表达,这些研究有助于对海洋酵母胞外酶的理论研究和生产应用价值的了解和对于海洋酵母菌资源、生理和遗传的进一步深入研究.     

中国明对虾血蓝蛋白C末端片段在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性

为研究中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)血蓝蛋白C末端(FcHC-C)的抗菌功能,将血蓝蛋白基因FcHC的2个C末端基因片段连接到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建酵母表达载体pPIC9K/FcHC-C。该载体经SalI酶切后,采用PEG法转化毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)。转化子经过PCR鉴定后,阳性克隆通过含有G418的YPD平板筛选,获得高拷贝重组子。重组毕赤酵母利用甲醇诱导表达目的基因。经Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析结果表明,利用酵母工程菌成功表达了血蓝蛋白C末端片段(rFcHC-C1和rFcHC-C2)。抑菌活性鉴定实验结果显示,重组蛋白rFcHC-C1和rFcHC-C2作为阴离子抗菌肽具有抗真菌和抗细菌的活性。     

半滑舌鳎稚鱼脂肪分解关键酶基因的克隆及饲料中脂肪水平对其表达的调控

克隆了半滑舌鳎脂肪分解关键酶基因即激素敏感脂肪酶(Hormone-sensitive lipase,HSL)和脂肪甘油三酯脂肪酶(Adipose triglyceride lipase,ATGL)cDNA部分序列,并探讨了饲料中脂肪水平对半滑舌鳎稚鱼HSL及ATGL基因表达的影响。克隆所得到的HSL和ATGL片段长度分别为589bp和581bp,序列和系统进化分析表明半滑舌鳎的HSL和ATGL与大部分鱼类具有较高的同源性。采用不同水平的鱼油配制成5种不同脂肪水平(6.68%、9.84%、13.47%、17.89%和21.88%干物质)的等氮饲料,饲养35日龄半滑舌鳎稚鱼30d,养殖过程中每天饱食投喂5次,养殖实验结束后采用实时荧光定量PCR分别测定各处理稚鱼内脏团的HSL及ATGL mRNA相对表达量。结果表明,高脂饲料组(21.88%)显著促进了半滑舌鳎稚鱼内脏团HSL基因的表达(P0.05),但饲料脂肪水平对于半滑舌鳎稚鱼内脏团的ATGL表达量未产生显著影响(P0.05)。     

基于脂质组学的海洋颗石藻病毒甾醇去饱和酶及脂肪酸去饱和酶基因功能分析

赫氏颗石藻(Emiliania huxleyi)宿主-病毒(E.huxleyi virus,EhV)的互作过程是影响海洋碳、硫生物地球化学循环及气候变化的重要环节。在共进化过程中,Eh V通过基因水平转移从宿主基因组中“劫获”了一组鞘脂从头合成相关酶基因,重构宿主脂代谢网络以支持病毒的特殊需求。目前,对病毒这组相关酶基因的生物学功能尚不十分清楚。以颗石藻病毒Eh V-99B1基因组中的甾醇去饱和酶(EhV-SD)和脂肪酸去饱和酶(Eh V-FAD)基因为研究对象,构建酿酒酵母重组表达载体p YES2/CT-SD和p YES2/CT-FAD,转化相应的基因缺陷型酵母菌株YMR015C和YGL055W获得重组酵母细胞株,进一步采用UPLC-Q-Exactive-MS非靶向脂质组学技术,比较分析重组酵母和缺陷型酵母细胞脂质的组成和含量变化。结果显示,Eh V-SD与Eh V-FAD基因在酿酒酵母中成功表达并具有生物学活性。Eh V-SD过表达显著改变了重组酵母细胞脂质代谢,含多不饱和酰基链的磷脂酰胆碱(PC,20︰4/20︰5/20︰6)和甘油三酯(TAG,12︰3)种类的丰度显著升高;而部...     

弧菌DS32褐藻胶裂解酶基因vralg1的异源表达和酶学性质研究

对从福建省东山湾沉积物样品中筛选到的菌株Vibrio sp. DS32的褐藻胶裂解酶基因vralg1进行克隆和异源表达,并对其酶学性质进行评估。以DS32基因组为模板,克隆褐藻胶裂解酶基因vralg1,构建了pET-vralg1重组表达载体,并在大肠杆菌中实现了异源表达,对重组酶VRALG1的酶学性质、底物特异性和完全降解产物等进行了测定。结果表明：重组酶VRALG1最适温度为35℃,在5～50℃范围内相对酶活力达到80%以上,最适pH为6.5～7.5,在pH为6.0～9.0范围内保温1 h后相对酶活力在90%以上;重组酶VRALG1最大反应速率为5.919 mmol/(L·min),米氏常数为3.712 mmol/L,最适条件下比活力为5.874 U/mg; K⁺、Cs⁺、Na⁺、咪唑和乙醇对酶活性影响较小,5 mmol/L或50 mg/mL浓度下相对酶活力保持90%以上,EDTA对酶的抑制作用明显,1 mmol/L浓度下可使酶完全失活;重组酶VRALG1对海藻酸钠和聚古罗糖醛酸具有较高的降解活性,TLC分析显示产物主...     

副溶血弧菌tdh基因在毕赤酵母中的表达及溶血活性检测

通过PCR技术从副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus,VP)基因组DNA上扩增耐热溶血素基因tdh,双酶切后定向插入到酵母表达载体pPICZaA中,构建重组表达质粒pPICZaA-tdh,经限制性内切酶SacI线性化后电转化毕赤酵母(Pichia pastoris,P.pastoris)GS115,经PCR和测序鉴定耐热溶血素基因成功整合到毕赤酵母的基因组中。在甲醇诱导下进行tdh的表达,SDS-PAGE分析证明重组TDH(thermostable direct hemolysin,TDH)的分子质量约为23ku,经Western blotting鉴定VP抗体能与表达的TDH发生特异反应,说明tdh基因在毕赤酵母中的表达是准确的。溶血实验证明了表达的TDH具有溶血活性。本研究首次应用毕赤酵母表达耐热溶血素基因tdh,在培养基中获得分泌表达的耐热溶血素,为研究tdh基因的功能奠定了基础。     

解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)的代谢工程

本文论述最近几年在解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipol ytica)代谢工程研究方面的最新进展.解脂耶罗维亚酵母是最安全的微生物,广泛分布在包括海洋和极地等的各种环境中,已经具备很好的基因克隆表达系统;某些菌株在蛋白质、油脂、柠檬酸、酸性蛋白酶和碱性蛋白酶生产上具有优良特性,并且许多菌株具有很强的降解石油烃的能力.本文介绍了几种对解脂耶罗维亚酵母进行的表达系统改造,改造后该酵母能分解廉价而广泛存在的菊粉,提高细胞中油脂含量和细胞分泌的柠檬酸含量,合成许多生物活性物质,在能源工业、食品工业、医药工业和养殖业具有广泛的应用前途.     

可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)酵母双杂交文库和铁结合蛋白真核表达载体的构建

构建了可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)的酵母双杂文库, 总克隆数为6.09×106CFU, 重组率100%, 平均插入片段长度>1kb。随机挑取200个克隆子测序, 结果1个空载, 67 个无法对应的基因类型, 已知的132个基因中线粒体蛋白占29.54%, 蚯蚓血红蛋白15.9%, 核糖体蛋白10.6%, 铁结合蛋白8.3%, 肌动蛋白6.1%, 其它基因29.56%。这些基因分别为: 5-氨基乙酰丙酸合成酶、类博莱霉素水解酶、纤溶蛋白、谷氨酰胺合成酶、热休克蛋白、非特性类碱性磷酸酶、脂肪酶、金属蛋白、线粒体、硫氧还蛋白、蛋白磷酸酶、肌钙蛋白C、泛素。根据已获得的可口革囊星虫铁结合蛋白基因, 以EcoRⅠ和KpnⅠ为双酶切位点设计引物, 构建了可口革囊星虫铁结合蛋白真核表达载体pPink-HC-fer, 经PCR 及测序检验, 序列完全正确, 然后电转化至酵母细胞中诱导表达, 经SDS-PAGE检验其融合蛋白分子量大小约为23kDa。     

别藻蓝蛋白基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达

采用亚克隆方法,将别藻蓝蛋白(allophycocyanin,APC)基因插入到毕赤酵母整合型表达载体pPIC6αA中,再用SacⅠ线性化,纯化后,用氯化锂法转化毕赤酵母菌株X-33,筛选表达APC的重组子。PCR和序列分析表明,APC基因已整合到酵母染色体中。重组子经甲醇诱导,用Western blotting在培养基上清液检测到APC,表明别藻蓝蛋白(APC)在毕赤酵母中可以表达。APC由两种亚基组成,分子量分别为19kDa和21kDa。重组子经摇瓶培养48h表达量达4.4mg/L。     

海洋微生物低温碱性脂肪酶的纯化与性质研究

以海洋微生物通过发酵制备的脂肪酶为材料 ,对该酶的分离纯化条件及理化性质进行了研究。在脂肪酶纯化中 ,采用氯仿萃取、中空纤维柱超滤及CM SepharoseFF阳离子交换柱层析等技术对发酵制备的脂肪酶进行了纯化 ,结果得到达到电泳纯的脂肪酶。在脂肪酶理化性质研究中 ,采用SDS PAGE电泳对该脂肪酶分子量进行测定 ,并在实验中以橄榄油为底物采用脂肪酶酸碱滴定测活法 ,对脂肪酶的最适水解条件、各种因素对脂肪酶稳定性的影响进行了研究。结果显示 ,该脂肪酶分子量为 ( 38 0± 1 )kD ,最适水解温度为 35℃ ,最适pH为 8 5 ,为一低温碱性脂肪酶。该脂肪酶可在 35℃以下、pH =4 0— 9 0范围内保持良好的稳定性 ,与常见金属离子、化学试剂等的配伍性较好 ,并且具有良好的耐盐及抗氧化性能。研究中还以p NPL(月桂酸对硝基苯酚酯 )为底物采用脂肪酶化学发光测活法 ,对脂肪酶进行了酶促动力学的研究。结果表明 ,该脂肪酶在最适条件下Km 值为 7 80 5 μmol/L ,Vmax为 1 2 385mmol/ (L·min)。通过对Zn2 +抑制脂肪酶水解活性的研究 ,发现Zn2 +对脂肪酶具有可逆抑制作用 ,从而筛选到该脂肪酶的可逆抑制剂Zn2 +。     

南极深海沉积物中产低温脂肪酶菌株的筛选与基因克隆

在10℃恒温培养条件下,从第29次南极科学考察获得的南极深海沉积物样品中分离筛选到产脂肪酶细菌3株,产脂肪酶真菌1株,对其进行分子生物学鉴定,确定为假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas arctica）、芽孢杆菌属（Bacillus pumilus）、Glaciecola sp.以及白冬孢酵母属（Leucosporidium sp.）.通过测定各酶的最适反应温度,获得产低温脂肪酶芽孢杆菌XZ18,该菌所产脂肪酶最适反应温度为30℃,在0℃仍有部分活性.从NaCl浓度和pH值2个条件对产酶条件进行研究,最终确定了该菌最适产酶NaCl浓度5.0%、最适产酶pH值为6,最高产酶量为4.65 U/cm3.通过PCR扩增,获得了脂肪酶全长序列,对该序列进行系统发育分析,发现该脂肪酶基因处于较独立的分支.     

黄、东海春季海水胞外酶活性水平分布特征研究

海水胞外酶活性可以指示有机物的分布特征以及微生物的营养状况。我们测定了2017年3月25日至4月15日黄海和东海44个大面站以及2018年4月28日至29日胶州湾湾口附近海域10个站位表层海水中的8种胞外酶活性并研究了其分布特征。2017年春季黄、东海表层海水中碱性磷酸酶和脂肪酶活性较高，高值区出现在苏北沿岸和南黄海中部，碱性磷酸酶与磷酸盐浓度之间呈正相关。其余6种酶(肽酶、几丁质酶、纤维素酶、α-D-葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、木糖苷酶)活性高值区出现在长江口以东的外海，东海的β-D-半乳糖苷酶、木糖苷酶平均酶活性显著高于黄海。8种酶活性平均值排列顺序由大到小为:碱性磷酸酶、脂肪酶、肽酶、几丁质酶、α-D-葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、纤维素酶、木糖苷酶，其中α-D-葡萄糖苷酶和β-D-半乳糖苷酶的活性基本一致。2018年春季胶州湾附近海域海水中碱性磷酸酶、脂肪酶、木糖苷酶活性分布为近岸高于远岸，几丁质酶活性为近岸低于远岸。8种酶活性平均值排列顺序由大到小为:碱性磷酸酶、脂肪酶、肽酶、木糖苷酶、α-D-葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、几丁质酶、纤维素酶，其中几丁质酶和纤维素酶的活性基本一致。黄海的碱性磷酸酶和脂肪酶平均酶活性均显著高于东海和胶州湾附近海域。糖类水解酶(几丁质酶、纤维素酶、α-D-葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、木糖苷酶)平均酶活性在黄海最低。本文的结果对于理解中国近海海水有机碳的分布、浮游植物及异养细菌对有机碳的降解具有重要意义。     

海藻酸裂解酶基因在毕赤酵母中的表达及重组酶性质的初步研究

褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)是一种海藻酸降解菌.本实验采用PCR的方法,以褐球固氮菌基因组DNA为模板,克隆出约1.05 kb的海藻酸裂解酶基因algL的成熟蛋白编码序列,并将其插入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC9K-algL.重组质粒线性化后用聚乙二醇(PEG)法导入毕赤酵母菌株GS115中,获得高效分泌表达海藻酸裂解酶的毕赤酵母工程菌株.用甲醇诱导培养基进行摇瓶发酵,表达得到43 kDa的目的蛋白,酶活力可达1 400 U/cm3左右.经测定,该重组酶的最适反应pH为8.5,最适反应温度为40℃,并且在20~55℃,pH2.0~11.0具有较好的稳定性.另外,10 mmol/cm3的Cu2+,Fe2+,Co2+,Mn2+和Ca2+对酶有不同程度的抑制作用.     

凡纳滨对虾溶菌酶基因在大肠杆菌中的表达和活性检测

将凡纳滨对虾(litopenaeus vannamei)血淋巴细胞中提取的总RNA,经RT-PCR扩增溶菌酶基因(LvLys 基因)的开放阅读框,将其克隆至pMD18-T并测序.用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切取目的基因并与表达载体pET-28a(+)连接,构建重组质粒pET-28(a+)/LvLys,转移到BL21(DE3)中诱导表达.经亲和纯化得到凡纳滨对虾重组溶菌酶.抑菌活性检测表明重组溶菌酶对大肠杆菌TOP10有一定抑制作用.     

南极细菌低温脂肪酶在大肠杆菌中的高效表达

极端微生物是亟待开发的微生物资源宝库.通过PCR扩增南极嗜冷菌低温脂肪酶基因序列,将其连接到表达载体pE-24a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,实现低温脂肪酶在常温菌的高效表达,将对低温酶的催化机制研究和工业化应用起到促进作用.     

海洋球石藻病毒(Coccolithovirus)硫氧还蛋白(Trx)在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达及其活性分析

从实验室保存的pBS-Trx重组质粒中克隆球石藻病毒EhV-Trx基因,构建毕赤酵母重组表达载体pPIC9K-EhV-Trx,将重组质粒电转化毕赤酵母GS115,诱导分泌表达并对重组蛋白进行二硫键还原酶活性分析。结果表明,EhV-Trx基因开放阅读框为591bp,编码197个氨基酸;在毕赤酵母GS115中成功诱导表达重组EhV-Trx,经SDS-PAGE分析目的蛋白分子量约为27.8kDa;重组EhV-Trx具有二硫键还原酶的活性,能有效打开胰岛素A、B两条链的二硫键,有望开发成一种新型的硫氧还蛋白脱敏制剂应用于食品安全领域。