用于单-藻细胞PCR扩增反应的样品保存方法比较

用室内培养的塔玛亚历山大藻（Alezandrium tamarense ATHK藻株）作为实验对象，分别选择了5％福尔马林固定后常温保存、95％乙醇固定后常温保存、-20℃冷冻保存、鲁哥氏液（Lugol’s solution）固定后常温保存等方法，在5，15，30，60d后对保存的样品进行单细胞PCR反应，并与新鲜样品进行比较。实验结果表明，用95％乙醇保存、-20℃冷冻保存、鲁哥氏液保存的样品在60d后仍可扩增出目标条带，与新鲜样品没有差别，但是样品中的藻细胞形态有一些改变；而以5％福尔马林固定保存的样品只能在5d后扩增出目标条带，但藻细胞形态比较完好。因此，对用于单细胞PCR实验的微藻样品，短期内（不多于5d）可以采用福尔马林保存，而需要长期保存的样品，应当采用乙醇或鲁哥氏液固定，或者采用-20℃冷冻保存的方法。     

海湾扇贝样品不同保存条件下DNA的提取及RAPD扩增比较

以海湾扇贝为材料，研究了鲜活样品以及采用冷冻保存、70％乙醇固定和10％福尔马林固定等方法保存的闭壳肌样品用于DNA提取的不同效果，并分析了不同保存条件下所提得DNA用于RAPD扩增的结果，研究表明，鲜活样品以及采肜冷冻保存和70％乙醇固定的样品可以得到很好的DNA，其质量和得率没有显著差异，利用上述DNA模板进行RAPD分析，可以获得一致性很好的扩增结果。10％福尔马林休固定样品则没有得到可用的DNA模板。采用70％乙醇固定保存海洋生物组织，是用于DNA提取及相关的分子生物学研究的快速、简易和有效的方法。     

不同保存方法的大黄鱼肌肉样品基因组DNA提取及RAPD分析

以－20℃冷藏、70％（V／V）乙醇、含50mmol/dm^3 EDTA的70％（V／V）乙醇和10％（V／V）福尔马林保存等方法处理大黄鱼肌肉样品，进行了DNA的提取及RAPD分析，并与新鲜样品作了对照。实验结果表明，鲜活样品以及冷冻保存、70％（V／V）乙醇以及含50mmol/dm^3EDTA的70％（V／V）乙醇保存的样品均可得到高质量的DNA，大小在21kbp左右，含量为100μm/cm^3左右。而从10％（V／V）福尔马林保存样品也能提到DNA，但其DNA得率低，约10μg/cm^3。分别以上述提取的DNA为模板进行RAPD扩增，未见有明显的差异。     

单条固定线虫基因组DNA提取及18S rRNA基因PCR扩增

根据线虫18S核糖体RM基因PCB扩增效果比较了丙酮、乙醇、乙醇 0．05mol／L FDTA(pH8．0)和5％海水福尔马林4种固定剂,碱裂解和蛋白酶K处理2种单条线虫基因组DNA提取方法的优劣。用乙醇固定的样品最适合制备RR模板DNA,而5％海水福尔马林固定的样品能最完整地保持样品形态。蛋白酶K处理获得的DNA较碱裂解获得的更适合PCR扩增。结果有助于分子生物学方法在海洋线虫分类、多样性和生态学研究中的应用。     

两种海洋单胞藻浓缩与保存效果的研究

研究了小球藻和球等鞭金藻分别用明矾和石灰水浓缩以及两种藻的浓缩液在常温(20 ±1℃)、低温(0—4℃)﹑冷冻(-30±1℃)三种温度条件下保存的结果,并对浓缩保存前后藻液的饵料效果进行了对比试验。 结果表明:(1)小球藻的浓缩以80±5ppm的明矾液及4%的石灰水效果最好;(2)球等鞭金藻的浓缩以100±10ppm的明矾液及6%的石灰水效果最好; (3)保存方法以加入保护剂甘油并置于-30℃ 冰箱中效果最好,小球藻和球等鞭金藻的存活率分别为95%和93%;(4)低温保存前后藻的脂肪酸分析结果表明高度不饱和脂肪酸(HUFA)的含量变化不明显;(5)用浓缩保存藻投喂中国对虾和轮虫的效果与普通藻无显著差异。     

海萝种藻冷冻保存对其释放孢子量及孢子附着的影响

为了研究海萝的非繁殖季节孢子育苗方法,进行了2个实验来研究海萝种藻冷冻保存对其释放孢子量及孢子附着的影响。1)6组不同风干程度海萝种藻在18℃冷冻保存6个月后取出在16℃水中进行孢子的释放,种藻风干到干重为原鲜重约25%的组,孢子的保存效果最好,该组种藻释放孢子量约为对照组(未经风干和保存的种藻)的77.6%,且孢子的附着率与对照组的差异性不显著;2)风干到重量为原鲜重约1/4的种藻分别保存于18℃、36℃、80℃,在保存8个月后,每一保存温度下的种藻分别在8℃、12℃、16℃、20℃水中释放孢子,种藻在水温12℃下释放的孢子量最多;保存于36℃、80℃的种藻较保存于18℃的释放孢子量多。本实验结果为海萝的非繁殖季节孢子育苗找到一种简便的方法,也为该属藻类的种质保存提供了参考。     

纤毛虫单细胞基因组DNA微量提取方法的比较及优化

在纤毛虫的分子生物学研究中,单细胞基因组DNA的微量提取是后续基因分析的关键。本研究以海洋纤毛虫红色伪角毛虫为材料,采用直接取完整虫体、裂解法以及3种改良后的试剂盒微量提取DNA方法,分别提取了新鲜样品与4种不同方法保存样品的基因组DNA,比较了9种组合在PCR产物质量、提取所需时间、成本及便捷性方面的优劣,并进一步比较、讨论和探索了4种样品保存方法和5种DNA微量提取方法在纤毛虫单细胞基因组PCR扩增中的可行性。本工作旨在为后续的纤毛虫分子生物学研究提供可资借鉴的技术路线和方法。     

不同保存方法对厚壳贻贝样品蛋白提取效果的比较

为了解厚壳贻贝(Mytilus coruscus)稚贝样品在冷冻保存过程中的蛋白变化情况,作者采用直接冷冻法、添加海水冷冻法、蛋白裂解液冷冻法等分别对保存1周至6个月的厚壳贻贝样品蛋白提取的不同效果进行了比较。SDS-PAGE胶结果显示,3种冷冻保存方法均出现4个有规律条带(a、b、c、d),其相对分子量依次约为55、46、38和26kDa。SDS-PAGE蛋白条带灰度值的检测结果表明,1个月内蛋白裂解液法保存的样品最佳;直接冷冻法和添加海水冷冻法的研究发现保存过程中的蛋白均出现不同程度的降解现象,因而可能不适宜用于该种稚贝样品的保存。     

舟山近海环境DNA保存方法的建立及优化

近年来,环境DNA(environmentalDNA,eDNA)技术开始被广泛应用于水生生物多样性研究。本文通过绝对定量和高通量测序技术对舟山近海高浊度水样eDNA的保存方法进行了建立和优化。研究结果如下:(1)"酒精+低温"保存法的eDNA获得量是"酒精+常温"保存法的0.78—1.06 (7d)、0.89—1.80 (15d)、1.05—2.75 (30d)和2.69 (60d)倍;(2)酒精保存法(低温、常温)存在eDNA富集物渗漏及滤膜黏附现象;(3)短期内冷冻保存样品的eDNA获得量是酒精保存样品获得量的1.25—1.59倍(7d)和1.07—1.20倍(15d);(4)酒精保存法的eDNA降解速率慢于冷冻保存法,长期内酒精保存样品的eDNA获得量是冷冻保存样品获得量的1.99—2.10倍(30d)和2.84—7.64倍(60d);(5)二次富集(过滤)能显著提高eDNA获得量,富集组eDNA浓度是未富集组浓度的1.60—4.95倍("酒精+低温")和1.21—2.04倍("酒精+常温");(6)"酒精+低温"保存的样品在高通量测序总丰度、各鱼种分丰度、物种多样性指数等多个方面优于冷冻保存样品;(7)微生物(micro-organism)的eDNA降解速率慢于大生物(macro-organism),不同界(Kingdom)的eDNA最优保存方法可能并不相同。本研究首次建立了舟山近海高浊度水样eDNA最适保存方法,为相似水域的eDNA保存提供了借鉴参考。     

单细胞凝胶电泳用于检测低温保存的真鲷(Pagrosomus major)精子DNA损伤

应用单细胞凝胶电泳(SCGE)方法,对超低温冷冻保存的真鲷精子DNA的损伤状况进行了检测研究。针对研究对象,在实验过程中对传统的碱性单细胞凝胶电泳在铺胶方法、电泳条件等进行了改进。对精子细胞进行预处理,在碱性电泳液中使核DNA双链解链变性后电泳,EB染色10min后,在荧光显微镜下观察,每次随机观察50个左右的核DNA。结果表明,对荧光显微镜下观察到的精子核按彗尾长度及荧光强度划分等级,出现损伤的精子核DNA的损伤程度主要为轻度损伤和中度损伤,很少见有完全损伤的真鲷精子核。对比真鲷冷冻精液与新鲜精液的精子DNA的损伤状况,表明仅用30%DMSO冷冻精子DNA损伤状况与鲜精差异显著(P>95%),其他冷冻方法保存的精子与鲜精差异不显著(P>95%)。     

中国海域赤潮物种多样性

遍布全球的赤潮问题近几十年来在我国海域愈演愈烈,成为我国海域最突出的生态灾害之一,严重威胁人类健康、生态安全和社会经济发展。随着研究的深入,我国海域越来越多的赤潮物种及隐存种得到鉴定,分类地位也经过不断修订,但是这些信息零散,不利于研究者系统认识和跟踪研究我国海洋赤潮物种。为此,文章整理了国内外赤潮物种研究资料,并参照联合国教科文组织全球有害藻华物种分类参考名单(2021年版,仅包括有毒赤潮物种)内容,完成了赤潮物种统计,共收录了341个赤潮物种,既包括有毒赤潮物种,也包括无毒赤潮物种。在这341个赤潮物种中,大部分(215种)在中国海域也得到鉴定,其中76个物种在所有主要海域都得到鉴定。近年来,基于通用分子标记(比如18S rDNA序列)的宏条形码分析被广泛应用于针对赤潮物种的鉴定和研究,成为研究赤潮物种组成及其时空动态变化的重要手段。然而,这341个赤潮物种中近30%的物种其18SrDNA序列尚未得到解析,严重限制了宏条形码方法的充分应用,是推行宏条形码分析中的重要瓶颈。全面构建赤潮物种分子标记可以促进宏条形码分析方法作为新一代海域生态调查分析技术,更好地将其应用于解析我国海域赤潮...     

赤潮随机梯度回归分析

赤潮的危害日益严重,为了预测赤潮的发生,运用回归树的随机梯度Boosting算法分析渤海赤潮数据, 建立浮游植物总量与环境因子的定量关系,给出各种环境因子对浮游植物总量相对影响的大小以及浮游植物总量和各种环境因子偏相关的图形,有利于探索赤潮的发生机制,指导菌种的培养. 最后,相比其它算法,回归树的随机梯度Boosting对于＂局部剧增＂的赤潮数据是稳健的,而且具有较高的预测精度.     

海洋有害藻华研究进展

浮游植物不仅是食物链的基础环节,也在生物地球化学循环中起着重要作用。然而,某些种类在一定条件下会过度增殖富集形成有害藻华(因造成水色变为红、绿、褐、金等颜色,所以俗称为赤潮、绿潮、褐潮、金潮等),结果严重影响当地经济、海洋生态系统、全球生物地球化学循环甚至人类健康。近年来,随着水体富营养化、全球气候变化等现象加剧,有害藻华(Harmful Algal Bloom,HAB)的暴发规模和频次呈逐年增加趋势,且相关研究已成为环境生态学领域的热点。本文主要以典型海洋HAB生物为线索,从物种分布、生物监测、主要影响因素、分子机制及防治等方面概述了近十年HAB的主要研究进展,总结了现有研究的优点和不足,并对未来HAB研究做了相关展望。近十年的研究进展主要体现在:(1)不断有新的HAB物种被发现或鉴定,HAB藻类系统分类也不断被更新;(2)鉴定、检测方法包括DNA分析、生物传感器研发应用等有较大改进;(3)藻类毒素生物合成通路的研究有一定进展;(4)在HAB生态学与海洋学研究持续发展的基础上,分子机制及现代组学发展较迅速。然而, HAB发生的关键环境诱因和生物学(特别是生化与分子)机制仍然不是很清楚,缺乏一个可用来预测HAB暴发的关键因子。笔者认为,一方面是因为HAB的复杂性、种类及生态系统的特异性,另一方面是研究缺乏系统性与完整性。因此未来有必要加强对每一个重要的HAB原因种开展系统、持续的研究,类似于生物科学领域里的模式种研究,并且有必要开展综合性的研究,如实验室单种培养、中尺度模拟及现场生态研究相结合,整合现代组学、传统生理生态学和现场实时连续观测等技术。     

近10年珠江口海域赤潮发生特征及原因初探

对2000-2009年珠江口海域发生的各种赤潮灾害资料进行统计分析,研究珠江口海域赤潮发生的时空分布规律、赤潮种类的变化规律、海水营养限制的变化状况.结果表明,珠江口赤潮多发区为深圳湾海区,近年珠江口西部珠海沿岸海域频发大面积赤潮;赤潮灾害发生的持续时间呈上升趋势;赤潮多发种为中肋骨条藻,多发于深圳湾;定鞭藻类原球形棕囊藻引发的有毒赤潮明显增多且影响范围较大.研究发现,珠海沿岸海域频发大面积赤潮和深圳湾春季频发赤潮可能与出现潜在硅酸盐营养限制有关,冬季频发球形棕囊藻与季节骤然升温有关.     

南麂海域浮游植物的分布特征

通过对南麂海域2003～2005年4个季节8个航次浮游植物样品的观察,对不同季节浮游植物的种类组成和数量分布进行了分析。研究结果表明,从调查样品中鉴定出浮游植物为3门34属128种。南麂海域的浮游植物密度从4月下旬到12月中、上旬(除赤潮消亡期外),基本保持在107个/m3以上。春季浮游植物以甲藻为主,夏季和冬季以硅藻为主;秋季大部分时间浮游植物以硅藻为主,有时以甲藻为主。能形成该区域赤潮的生物有14种,其中已引发赤潮的生物占6种(甲藻3种,硅藻3种)。春季赤潮为有色赤潮,有较大的危害性;其它季节的赤潮为无色赤潮,未出现危害现象。     

微藻的保种技术及其应用

本文介绍了微藻保种的几种常用方法 ,包括继代保存、固定化保存和超低温保存。结果表明 :继代保存简便易行 ,在生产和科研实践中比较实用 ;而固定化保存可用于较长期保存 ;超低温保存则可用于长期保存。另外 ,还对这几种保种技术的研究及应用现状进行了简单概述 ,以期能对微藻保种工作的开展有所裨益     

赤潮发生和蔓延的动力机制数值模拟

海洋中发生的赤潮不是单纯的生物生态问题,而是在海洋动力环境条件控制下的生物生态问题.对4种情况进行数值模拟来证明动力条件对赤潮的发生、蔓延所起的重要作用.这4种情况是:(1)1998年春实际发生在香港海域的赤潮的生消全过程;(2)改变潮差后的赤潮生消全过程;(3)改变流场的扩散强度后的赤潮生消全过程;(4)通过工程措施改变海区的周边地形来控制赤潮的蔓延途径.这些模拟结果表明海洋的动力条件不仅对赤潮的蔓延发挥输运作用,而且对赤潮的形成有影响,在某些条件下它对赤潮的发生将起着决定性作用.     

中国近海有害藻华研究现状与展望

海洋或淡水环境中的一些藻类生物量暴发性增长会形成有害藻华(harmfulalgalblooms,HAB),对人类健康、生态安全和社会经济发展构成威胁。近50年来,近海有害藻华问题不断加剧,已经成为一类全球性的海洋生态环境问题。在"全球有害藻华生态学与海洋学研究计划(GEOHAB)"和"全球变化下有害藻华研究计划(GlobalHAB)"支持下,有害藻华研究不断深入,在"有害藻华原因种多样性、生物地理分布特征与适应策略"、"典型有害藻华的生态学与海洋学研究"、"富营养化和气候变化对有害藻华的影响"、"藻毒素与人类健康"、"有害藻华的监测、预警和防控"等方面取得了重要进展。有害藻华是我国近海最突出的生态灾害之一,自2000年以来,我国近海大规模有害藻华不断出现,藻华原因种表现出多样化、小型化和有害化的演变趋势,对沿海地区社会经济发展和生态系统健康构成严重威胁。针对我国近海的有害藻华,本文从有害藻华原因种基础生物学研究、有害藻华生态学与海洋学研究、近海有毒藻和藻毒素研究、有害藻华监测与治理研究等四个方面对主要研究进展进行了总结和分析。综合国内外有害藻华现状和相关研究进展,建议进一步深化对我国近海有害藻华形成及演变机理的研究,高度关注全球变化和人类活动对我国近海有害藻华的影响,推动有害藻华监测预警体系建设,持续提高对藻华灾害的防控能力,积极参与有害藻华领域国际合作,更好地应对有害藻华问题。     

基于赤潮控制要素识别的近海富营养化压力指数研究

鉴于赤潮发生影响要素之间一般性逻辑关系模糊不清,且缺乏表征关键控制要素之间量化关系的解析式,造成当前赤潮预测预警与防控间关系不紧密甚至相脱节。为将二者密切连接,本文利用胶州湾1982—2015年的调查数据,在解析富营养化和赤潮发生关键控制要素基础上,建立了应用于赤潮预测预警的复合富营养化压力指数(compoundeutrophicationindex,CEI),同时将CEI应用于长江口赤潮高发区海域验证。结果表明,胶州湾赤潮发生关键控制要素有14种,CEI评价结果不仅与chl a吻合度较高(相似性指数为0.86),而且与赤潮发生时间匹配度较好(达93%),与统计方法预测预警准确度相当,其空间匹配度达77%,与生态动力学模型预测预警准确度相当。将CEI应用于长江口赤潮高发区,时间上与chl a吻合度(相似性指数)为0.74,达到较高的一致性;空间上与chl a吻合度(Kappa系数)为0.25,达到一般一致性。由于海域的特殊性,关键控制要素的遗失可能是一致性偏低的主要原因,未来研究基于长江口赤潮高发区进行CEI构建可能使问题改善。