来自大黄鱼(Pseudosciaena crocea)肠道的弧菌拮抗菌的筛选与鉴定

采用点种法并以副溶血弧菌(Vp1.2164)和溶藻弧菌(Va-Y)为弧菌指示菌,对从健康的大黄鱼肠道内分离的115株细菌进行体外拮抗试验。并对筛选出的拮抗菌进行抗菌谱测定,最后利用VITEK-32细菌快速鉴定系统和16SrRNA基因序列对拮抗菌进行鉴定。结果表明,从中筛选到3株有较强拮抗作用的菌株,编号分别为X1402-1、X1108和X3914,且菌株X1402-1的抗菌作用最强,抗菌谱最广,21株病原指示菌中,对16株均能产生较强的抑制作用,其中对Vp-1.2164的抑菌直径最大,达到28.5mm,对Va-Y的抑菌直径为8.7mm;其次为菌株X1108和X3914,对两种指示弧菌的抑菌直径分别为:12.0mm、9.0mm和0mm、7.2mm。经VITEK-32细菌快速鉴定系统鉴定,3株拮抗菌分别与铜绿假单胞菌,恶臭假单胞菌,地衣芽孢杆菌的相似性均为99%。通过16SrRNA基因序列分析表明,3株拮抗菌分别与类产碱假单胞菌Pseudomonas pseudoalcaligenes(EU419918)、恶臭假单胞菌Pseudomon asputida(FJ440105)和地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis(DQ988136)的16SrRNA基因同源性最高,分别为100.0%、97.5%、99.0%。综合分析试验结果,X1402-1、X1108和X3914分别被确定为类产碱假单胞菌、恶臭假单胞菌和地衣芽孢杆菌。     

拮抗菌对病原性溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)粘附大黄鱼(Pseudosciaena crocea)表皮粘液的影响

采用3H-TdR同位素示踪法研究了病原性溶藻弧菌和9株拮抗菌对大黄鱼表皮粘液的粘附动力学。结果表明,10株细菌的粘附作用都符合饱和粘附动力学特征;R4、R13和R32等3株拮抗菌的最大粘附量高于溶藻弧菌;9株拮抗菌的分离常数都高于溶藻弧菌;R32的亲和指数大于溶藻弧菌,其余8株拮抗菌的亲和指数都小于溶藻弧菌。测定了9株拮抗菌对病原性溶藻弧菌粘附大黄鱼表皮粘液的竞争、排斥和置换作用,结果显示:9株拮抗菌在竞争条件下都能极显著减少溶藻弧菌对表皮粘液粘附(P<0.01);在粘附排斥方面,R4、R13、J26、J28、J312、Y59等6株拮抗菌能显著排斥病原性溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附作用(P<0.05);在粘附置换方面,J26、J28等2株拮抗菌能极显著(P<0.01)降低病原性溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附量。研究结果表明,病原性溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液有较强的粘附作用;9株拮抗菌能够抑制溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附作用,其中竞争作用效果最好,排斥作用次之,置换作用的效果最差;拮抗菌对病原菌粘附的抑制效果受多种因素的影响,各菌株的粘附动力学参数有重要的影响作用。     

大黄鱼病原弧菌拮抗菌筛选

用平板涂布法从集美海边分离到381株细菌,用平板划线法或点种法检验这些海洋细菌对两株病原弧菌(副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的拮抗作用。从中挑选2株对海水养殖动物病原弧菌有较好拮抗作用的细菌,编号为GX75和GZ46。对拮抗菌(GX75和GZ46进行了抗菌谱测定,结果表明,GX75对9株指示菌中的副溶血弧菌、河流弧菌和坎普氏弧菌有较好的拮抗作用,GZ46对副溶血弧菌、溶藻弧菌和坎普氏弧菌有较好的桔抗作用。在营养肉汤中,测定了GX75和GZ46的抗菌作用,表明(GX75和GZ46对副溶血弧菌拮抗作用很明显。     

海洋放线菌对大黄鱼病原弧菌的拮抗作用和抗菌谱

在大黄鱼（Pseudosciaena crocea)病原弧菌的拮抗放线菌筛选和人工诱变基础上，选择出对溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus)和副溶血弧菌（V.paradaemolyticus)同时具有较强拮抗作用的4株放线菌，采用琼脂块法测定4株放线菌的抗菌谱，并检测4株放线菌分别在固体和液体培养液中的拮抗作用，结果表明：4株放线菌的抗菌谱均较窄，在固体和液体培养基中对2种病原弧菌都有较强的拮抗作用。     

冬季刺参养殖环境与肠道内细菌菌群的研究

运用传统细菌分离培养与分子生物学技术相结合的方法,对2008年11月至2009年1月冬季刺参(Apostichopus japonicus Liao)养殖池塘环境(养殖水、底泥、附着基)及刺参肠道内的细菌菌群进行了分析。应用平板稀释涂布培养计数法测得刺参养殖池塘水体、底泥、附着基和肠道细菌数量分别为0.75×102～1.4×104cfu/mL、8.7×104～8.1×105cfu/g、3.8×105～2.8×106cfu/g、7.1×105～1.5×107cfu/g;根据形态学差异从培养所得的细菌中筛选得到22株菌,用限制性内切酶Rsa I和Msp I对所分离菌株进行ARDRA(Amplified rDNA Restriction Analysis)分析,这22株菌被分为8种不同的分类单元(Operational Taxonomic Unit,OTU),其中OTU2与OTU3所包含的菌株分别占分离菌株种数的30%和20%;此外,作者对不同环境培养所得的优势度最高的细菌进行分子鉴定分析。结果表明:水环境中优势菌为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)及巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium),沉积物中优势菌为巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis),附着基中优势菌为巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis),灿烂弧菌(Vibrio splendidus),肠道中优势菌为巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis),灿烂弧菌(V.splendidus)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)。通过对冬季刺参池塘细菌菌群多样性分析和优势菌鉴定,为筛选低温益生菌和防治刺参疾病提供了有益参考。     

刺参肠道微生物组成分析及产酶、溶血性试验

对野生和人工养殖刺参的肠壁及内容物中的菌群数量、种类组成进行了研究;并结合产酶试验和溶血性试验,对刺参肠道益生菌做了初步的体外筛选。结果表明,野生刺参肠壁及内容物中的细菌数量分别为(3.30±0.41)×107 cfu/g、(6.39±0.32)×107 cfu/g,养殖刺参肠壁及内容物中的细菌数量分别为(2.83±0.31)×107 cfu/g、(5.67±0.53)×107 cfu/g。野生刺参肠道优势菌为弧菌属(Vibrio),次优势菌为假单胞菌属(Pseudomonas)和希瓦氏菌属(Shewanella);养殖刺参肠道优势菌为弧菌属(Vibrio),次优势菌为假单胞菌属(Pseudomonas)。在224株细菌中,共有160株细菌具有产酶能力,所占比例为71.43%,其中具产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶能力菌株分别为114株、114株、108株,所占比例分别为50.89%、50.89%、48.21%。99株细菌中有23株具有溶血性,所占比例为23.23%。综合分析实验数据,确定6株细菌作为刺参肠道潜在益生菌,菌株代号分别为HS1(Pseudomonas)、HS5(Bacillus)、HS7(Shewanella)、HS8(Vibrio)、HS10(Vibrio)、HS11(Vibrio)。     

中国对虾成虾肠道微生物区系

对野生健康中国对虾成虾肠道微生物区系进行了研究.从其肠道中分离出47株菌,它们分别属于弧菌属、发光杆菌属、不动杆菌属、假单胞菌属、黄杆菌属、气单胞菌属、屈挠杆菌属和色杆菌属8个属.其中弧菌属和发光杆菌属在整个肠道中为优势菌属,不动杆菌属和假单胞菌属为次优势菌属,黄杆菌属、气单胞菌属、屈挠杆菌属和色杆菌属为非优势菌属.在对虾的整个肠道中,前肠和中肠的优势菌属为弧菌属,而后肠的优势菌属为发光杆菌属.在弧菌属中溶藻胶弧菌、漂浮弧菌和坎贝氏弧菌为优势菌,哈唯氏弧菌为非优势菌.前肠、中肠和后肠的菌量分别为1.3×105、2.8×105和1.1×104cfu/虾体.     

大黄鱼病原弧菌拮抗放线菌的筛选与人工诱变

从厦门集美海滩底泥分离得到38株放线菌，用琼脂块法测定它们对大黄鱼病原弧菌-溶藻弧菌和副溶血弧菌的拮抗效果，选择两株拮抗效果较好的放线菌进行诱变，测定诱变后各菌株的抗菌效果，并选择抗菌效果较好的菌株进行第二次诱变，如此反复诱变3次，共得到97株放线菌，结果表明；38株放线菌中的22株对两株病原菌有一定的拮抗作用；用紫外线照射可以获得少量对两株病原菌拮抗作用加强的菌株。     

海湾扇贝(Argopecten irradians)附着基异养细菌区系初探

从海湾扇贝附着基上分离出61株异养细菌，对其进行80项生理生化特征测定，以数值分类法进行分析。鉴定结果表明，海湾扇贝附着基上异养菌属于假单胞菌(Pseudomonas)、气单胞菌(Aeromonas)、弧菌(Vibrio)、芽孢杆菌(Bacillus)和产碱杆菌(Alcaligenes)。扇贝幼虫附着前附着的细菌主要为芽孢杆菌与假单胞菌，扇贝幼虫附着后气单胞菌成为优势，弧菌数量明显增加，与假单胞菌数量相当。     

牙鲆肠道内弧菌拮抗菌的分离与筛选

根据微生态学原理,用普通培养基和选择性培养基相结合的方法,分离健康牙鲆肠道内的固有菌群。对获得的菌株进行弧菌的抑制试验,以筛选弧菌拮抗菌。用点种法初步筛选出6株对致病性弧菌有不同抑制作用的拮抗细菌（G12,G13,G14,G15,G16,Y1-13）。进一步研究它们的抑菌活性,在上清液抑菌试验中,G12,G13,G14,G15,G16这5株菌均未表现出抑菌作用,表明它们的抑菌活性较弱,而且受环境条件的影响。在Y1-13和弧菌混合培养实验中,弧菌的数量均明显低于对照组弧菌的数量,表明Y1-13对弧菌具有较强的抑制作用,有望通过生物学和鱼体保护等方面的研究,将其制成微生态制剂应用于牙鲆的养殖。     

皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)肠道潜在益生菌的筛选及对幼鲍生长的影响

采用体外实验筛选益生菌结合16SrDNA序列分析法,从124株不具有溶血作用的皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)肠道细菌中筛选得到5株潜在益生菌并进行了分子鉴定,进一步对5株潜在益生菌进行了安全性实验及体内饲喂实验。结果表明,2株具有拮抗哈维弧菌和灿烂弧菌能力的潜在益生菌分别被鉴定为Shewanella sp.(WA64)和Shewanella sp.(WA65),一株产海藻酸酶和淀粉酶的潜在益生菌被鉴定为Vibrio sp.(WA51),产蛋白酶潜在益生菌被鉴定为Bacillus sp.(FA12),产琼脂酶潜在益生菌被鉴定为Tamlana sp.(FA86);安全性实验表明5株潜在益生菌在107cfu/ml下对皱纹盘鲍没有明显的毒害作用;通过体内饲喂实验发现,潜在益生菌WA64、WA65的复合作用能够显著提高幼鲍增重率和存活率(P<0.05),并在生产条件下能够明显降低幼鲍的死亡量。经抗生素敏感性实验,WA64菌株对15种抗生素均敏感或中度敏感,WA65菌株仅对庆大霉素和链霉素2种抗生素产生耐药。     

条斑紫菜外生细菌的遗传多样性

为研究藻际微生物多样性与紫菜健康养殖的关系,从江苏南通(养殖)、山东青岛(野生)、浙江温州(养殖)三地的条斑紫菜叶状体和江苏东台条斑紫菜贝壳丝状体及其周围的海水样品中分离了条斑紫菜外生细菌。根据菌落特征和菌体形态将获得的63株细菌分为21种表型。16SrDNA-V3片段DGGE分析结合序列测序比对结果表明:这些菌株与假交替单孢菌(Pseudoalteromonas)、嗜冷单胞菌(Psychrobacter)和芽孢杆菌(Bacillus)等10属相应菌株具有较高的同源性。通过对条斑紫菜外生细菌区系多样性分析得出:条斑紫菜藻体外生细菌组成与生活环境相关,但不同于周围海水细菌群落;不同来源(地点)、不同生理状况(健康与病烂)和不同生长阶段(叶状体和丝状体)的条斑紫菜外生菌种群组成差异较大。许多外生细菌对常见测试菌、海水养殖动物致病菌和人致病菌具有抑菌活性,其抑菌特点与紫菜生理性状相关。从健康条斑紫菜样品分离的外生菌中假交替单孢菌占优势,病烂紫菜未分离到假交替单孢菌,提示假交替单孢菌可能与紫菜健康生长有密切关系。     

文蛤鳃组织内共生菌分离鉴定和多样性分析

为探究文蛤（Meretrix petechialis）鳃组织内共生菌群的群落组成及结构，采用纯培养方法，对文蛤鳃组织的内共生菌进行了分离、纯化和16S rRNA鉴定，共筛选到215株细菌，分属于变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门4个门级类群中，其中变形菌门是实现纯培养菌株数量最多的类群。基于16S rRNA序列信息，进一步对变形菌门的系统演化关系进行了分析，结果显示不同纲级类群的菌株分别聚集在了相应的分支内。另外，对获得的具有潜在抑菌活性或致病性的共生细菌进行了探讨，为后续对文蛤鳃内生菌的深入研究奠定了基础。     

光棘球海胆(Strongylocentrotus nudus)酚氧化酶氧化产物的抗菌特性研究

本文通过线性连续梯度非变性电泳结合邻苯二酚发色法分离纯化了光棘球海胆(Strongylocentrotus nudus)体腔液上清中的酚氧化酶(PO),然后通过生长曲线测定法进行了光棘球海胆PO氧化产物的抗菌特性分析。结果显示:(1)光棘球海胆体腔液上清中存在3种PO(Sn PO1,Sn PO2,Sn PO3),在聚丙烯酰胺凝胶中与邻苯二酚反应分别呈现褐色、黄色和紫色;(2)以多巴胺为底物时,Sn PO1的氧化产物对灿烂弧菌Vibrio splendidus、哈维氏弧菌Vibrio harveyi和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus有抗菌作用,Sn PO2氧化产物对哈维氏弧菌、金黄色葡萄球菌和拟诺卡式菌Nocardiopsis sp.有抗菌作用,Sn PO3氧化产物仅对哈维氏弧菌和拟诺卡式菌有抗菌作用;(3)以左旋多巴为底物时,仅Sn PO2氧化产物对拟诺卡式菌有抗菌作用;(4)光棘球海胆PO氧化产物对假交替单胞菌Pseudoalteromonas nigrifaciens、希瓦氏菌Shewanella baltica和溶壁微球菌Micrococcus lysodeikticus的生长无明显影响。上述结果表明,在光棘球海胆中,PO氧化产物具有窄谱抗菌活性,多巴胺氧化产物的抗菌活力高于左旋多巴氧化产物,并且不同PO亚型的氧化产物具有不同的抗菌谱和抗菌特性。     

针胞藻海洋卡盾藻(Chattonella marina)和硅藻中肋骨条藻(Skeletonema costatum)藻际细菌的分离、鉴定及影响研究

对实验室培养的两株海洋微藻海洋卡盾藻和中肋骨条藻的可培养细菌进行了分离鉴定，分别在海洋卡盾藻和硅藻中肋骨条藻不同生长时期分离得到48株和34株可培养细菌，去除重复序列后得到12株不同的菌株。这些菌株分属α-变形杆菌纲、γ-变形杆菌纲、拟杆菌和放线菌。α-变形杆菌纲在两种藻的藻际环境中占据优势，其中红杆菌科是最为常见的科，中肋骨条藻的藻际细菌比海洋卡盾藻更为多样化。海洋卡盾藻生长后期细菌密度大幅度上升，可能导致了藻细胞的衰亡。中肋骨条藻相关细菌中有一株对旋链角毛藻的生长具有明显抑制作用，而大部分海洋卡盾藻相关细菌对角毛藻的生长具有抑制作用。本研究结果说明海洋卡盾藻的藻际细菌也许对其与硅藻的种间竞争中具有一定作用。     

海带褐藻多酚对绿烂海带表面分离的一株细菌的抑菌效果研究

海带苗绿烂病暴发严重威胁海带养殖生产,给海带养殖业造成巨大经济损失.研究发现,海带中的多酚化合物可以抵御海带病害初期病原体侵入.为研究多酚对绿烂海带表面附生菌的抑菌效果,在病烂部位分离出一株细菌,通过16s rRNA基因测序的方法,证实该细菌为小孔芽孢杆菌(Bacillus foraminis).进一步以健康海带为原料...     

斜带髭鲷内脏白点病病原的分离鉴定及耐药性分析

本研究采用平板分离法对具有典型症状的斜带髭鲷（Hapalogenys nitens）进行病原微生物的分离培养,结合形态学、生理生化特征和分子生物学技术对病原进行种属鉴定,并对分离得到的病原菌进行了药物敏感性试验。病理切片结果显示,病鱼肝脏、脾脏、鳃、头肾、心脏均可观察到明显的白色炎性肉芽肿病灶,从患病鱼脾脏、肝脏和头肾的白色结节处均分离到单一外观的细菌菌落hn-1。通过生理生化特征鉴定、16S rRNA基因测序和回归感染实验证实斜带髭鲷内脏白点病的致病菌为哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）。透射电镜观察显示分离菌具有极生鞭毛及侧鞭毛;毒力基因检测显示分离菌携带toxR、luxR、vvh、vhh和trh基因;药敏试验结果显示,分离菌株主要对喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类等药物具有较强的敏感性。研究结果可为斜带髭鲷的内脏白点病的病害防控提供科学依据。