黑鲷三倍体的人工诱导研究

分别于1989年3—6月、1990年3—5月在天津和青岛两地采用冷、热休克法对黑鲷进行三倍体的人工诱导研究。结果表明,冷休克法诱导三倍体的效果好于热休克法,其最适诱导条件为卵子在受精后5min,温度为3—4℃的海水中处理10—20min,三倍体诱导率最高可达50.35％;正交试验证明,三倍体率受冷、热休克法的三因素影响程度的顺序由大到小依次为,处理时间、处理时刻、处理温度;黑鲷染色体数目:2n=48,3n=72,它们的染色体组型也同时获得。     

诱导三倍体太平洋牡蛎群体发育过程中三倍体率的变化

借助染色体计数和流式细胞计数计对 6 - DMAP处理和冷休克两种诱导方法获得太平洋牡蛎 (Crassostrea gigas)三倍体群体在各个发育时期三倍体率进行了系统检测。结果发现 ,在 4～ 8细胞时期 ,6 - DMAP诱导三倍体率为 75 % ,冷休克诱导三倍体率为 5 0 % ,在发育至 D形幼虫期和稚贝期 ,两类三倍体群体的三倍体率均有所下降。如从 4～ 8细胞期发育至稚贝期 ,冷休克诱导群体下降了 5 3.0 8%以上 ,6 - DMAP诱导群体三倍体率下降了 2 7.36 %。养殖一年后 ,6 - DMAP诱导群体三倍体率仍保持在 6 0 %以上 ,而冷休克诱导群体三倍体率已下降至不足 10 %。这一结果说明 ,利用 6 - DMAP诱导来获得三倍体是比较理想的方法     

静水压法人工诱导牙鲆(♀)×圆斑星鲽(♂)杂交三倍体的探索

开展了牙鲆(Paralichthys olivaceus)(♀)和圆斑星鲽(Verasper variegatus)(♂)杂交,通过静水压抑制受精卵第二极体的释放来诱导杂交三倍体,设计单因素分析实验,筛选出当前试验条件下的最佳诱导条件。结果表明:静水压法可成功诱导出杂交三倍体,诱导率主要受到受精后处理起始时刻、处理压强和压强处理时间3个因素的影响。静水压法的最佳诱导条件为:海水温度(15.0±0.2)℃,受精后3 min起,以70 MPa压力处理6 min。此时相对孵化率为(24.06±1.10)%,利用倍性分析仪对其进行倍性鉴定,三倍体率为(26.67±6.67)%。染色体分析表明,三倍体胚胎的染色体数目为71条,对照组二倍体胚胎的染色体数目为47条。还发现有少量染色体数目为24条的单倍体胚胎。研究结果为鲆鲽鱼类异源多倍体的培育提供了参考。     

低渗诱导栉孔扇贝三倍体及与其它方法的比较

采用低渗抑制受精卵第2极体(PB2)的释放诱导栉孔扇贝(Chlamys farreri)三倍体。水温20℃时,分别进行不同盐度处理(8~20)、不同起始处理时间(受精后15~40 min)和不同持续处理时间(10~25 min)的实验,对三倍体处理组和对照组幼虫的生长进行观察,同时将低渗、6-DMAP、热休克、冷休克4种诱导方法进行对比。结果表明:受精后30 min开始处理20 min,诱导率最高,可达(92.36±2.41)%,卵裂率为(49.78±6.51)%,孵化率为(61.82±1.63)%;D形幼虫期,处理组幼虫表现出明显的生长优势(P0.01),不仅生长速度快,而且发育到变态时个体比二倍体大;低渗诱导的三倍体率与6-DMAP相比无显著差异(P0.05);与热休克和冷休克相比差异显著(P0.01)。     

半滑舌鳎雌性特异fosmid克隆的筛选及FISH定位

通过对半滑舌鳎雌鱼fosmid文库进行有序混合,成功构建了两步-三维PCR筛选体系,为后续的基因筛选奠定了基础。通过对半滑舌鳎W染色体文库序列进行引物设计,并分别在雌、雄鱼基因组DNA中筛选,获得1对雌鱼特异性引物。使用该引物对fosmid文库进行筛选,得到1个雌鱼特异性克隆,并通过荧光原位杂交技术将克隆定位到了W性染色体上,证实了使用该体系进行文库筛选的有效性以及雌鱼引物的特异性,建立了半滑舌鳎遗传性别的分子及细胞遗传学鉴定方法,为后续半滑舌鳎基因组及性染色体的研究奠定了基础。     

利用咖啡因和热休克诱导太平洋牡蛎三倍体

报道采用咖啡因和热休克相结合的方法 ,抑制受精卵第二极体释放诱导太平洋牡蛎三倍体的优化方案。实验结果表明 ,三倍体诱导率随着咖啡因浓度的增高而增高 ,D形幼虫的孵化率却随着咖啡因浓度的增高而降低 ;所进行 30～ 36℃热休克温度试验 ,其对三倍体诱导率影响不大 ,但对孵化率影响明显。在 2 3～ 2 5℃条件下 ,当 50 %受精卵出现第一极体时 ,用浓度为 2 g/ L的咖啡因 ,结合 33℃± 1℃的热休克 ,处理牡蛎受精卵 15min,三倍体诱导率达 80 %以上 ,孵化率在 4 5%左右。通过此法诱导的三倍体群幼虫的成活与生长情况与其二倍体群体无明显差异。     

大菱鲆三倍体人工诱导条件优化及规模化诱导

大菱鲆(Scophthalmus maximus)是我国重要的海水养殖鱼种,三倍体诱导对其种质改良、产业提升和生态安全具有重要的价值。目前有关大菱鲆三倍体的人工诱导虽已有报道,但对其诱导条件缺乏细致的研究。本文采用冷休克法抑制第二极体排放,通过对诱导处理起始时刻、温度和持续时间3个主要因素的单因子实验,筛选其最佳诱导条件。结果显示,在受精和孵化水温为15.0±0.5℃条件下,受精后6 min,用–2～–1℃处理25 min可获得较好的诱导效果,流式细胞仪检测其诱导率可达100%。随后在最适条件下进行了规模化诱导,获得鱼苗200万尾以上,其诱导率高于98%。跟踪观察发现,三倍体诱导组胚胎的形态及孵化时间与二倍体对照组基本一致。本研究结果可为大菱鲆三倍体的产业化应用提供基础。     

华贵栉孔扇贝三倍体的研究

本文报道了用细胞松驰素B、高温和低温休克等方法诱导华贵栉孔扇贝（Chlamys nobilis）三倍体的实验结果。在26.0～28.0℃条件下，选用不同浓度的细胞松驰素B0.1、0.3、0.5、0.7和1.0mg/dm^3，在受精后15min，处理受精卵15min，三倍体诱导率分别为12.5%、37.5%、68.0%、66.6%和81.0%，其中0.5～1.0mg/dm^3浓度的细胞松驰素B对改变倍性最有效。高温休克选用31.0、33.0、35.0和37.0℃处理受精卵，最高三倍体诱导率达46.7%（33.0℃,处理15min）。低温休克选用6.0、8.0、10.0和12.0℃处理受精卵，最高三倍体诱导率为40.7%（10.0℃，处理20min）。实验结果表明，随着处理强度的增大和处理时间的延长，三倍体诱导率增高、但孵化率下降，畸型率上升。用高温休克处理的实验组幼虫生长速度较对照组快。作者认为，在商业性生产中，温度休克是诱导扇贝三倍体的一种简便、有效的方法。文中还就细胞松驰素B与温度休克诱导三倍体的机制进行了讨论。     

两种方法诱导太平洋牡蛎三倍体在生产上的应用效果

本文就太平洋牡蛎三倍体育苗中，常用的低温休克法和6－DMAP法进行了生产性试验比较。其结果为：在三倍体诱导率方面，低温休克的三倍体率低且不稳定，6－DMAP法诱导三倍体率高且稳定；在生长方面，低温休克法诱导的三倍体在养成期的生长和成活均差于6－DMAP法诱导的，三倍体率差异明显，但在幼虫期二者差异不显著。     

半滑舌鳎雌鱼基因组Fosmid文库构建及分析

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是我国的大型经济鱼类,其养殖发展迅速。有关半滑舌鳎的基因组文库构建和分析等方面的研究,目前尚未见报道。用流式细胞仪检测雌性半滑舌鳎基因组大小。从半滑舌鳎雌鱼肌肉提取基因组DNA,选取大小合适的DNA片段,经末端修复并回收后,再以Fosmid作为载体,构建半滑舌鳎雌鱼基因组文库。经检测,雌性半滑舌鳎基因组大小约为606.36 Mb。所构建的Fosmid文库含有49 920个克隆,重组率为96.88%;插入片段长度分布在33~45 kb之间,平均为39.2 kb;覆盖雌性半滑舌鳎基因组3.12倍;从文库中筛选得到单拷贝DNA序列的概率为95.6%。对培养第1天和第6天的克隆进行比较,结果表明文库稳定性高,培养过程中没有发生变化。     

温度对半滑舌鳎的生长、生化组成和能量收支的影响

研究了不同温度(16,19,22,25,28和31 ℃)对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)幼鱼的生长、体成分组成和能量收支的影响.结果表明,随温度的升高,半滑舌鳎幼鱼生长率总体呈现先升高后降低的趋势.其中,在19～25 ℃温度范围内,半滑舌鳎幼鱼的特定生长率相对较高,在16和28 ℃下则有所降低,而在31 ℃下,半滑舌鳎幼鱼特定生长率则显著降低.本研究表明半滑舌鳎幼鱼特定生长率与温度符合二次曲线模型.半滑舌鳎摄食量随温度升高而逐渐增大,但在31 ℃时显著减小,饵料转化率则随温度的升高而降低.鱼体脂肪与能值均随温度升高而降低,蛋白质含量受温度影响不显著.温度对半滑舌鳎的能量收支影响显著,其中,生长能和代谢能主导半滑舌鳎的能量分配,生长能占摄食能比例则随温度的升高而降低,呼吸能占摄食能比例则随温度的升高而升高.本研究表明,半滑舌鳎幼鱼(13～37 g)适宜生长温度范围为18～25 ℃,而不同温度导致的半滑舌鳎摄食量和能量收支的差异可能是温度影响其生长的主要生理生态学机制.     

10 个半滑舌鳎家系 MHC IIB 基因多态性初步研究

为检测10个半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)家系MHCⅡB(Cyse-DAB)基因的多态性水平、MHCⅡ类B位点数目以及平衡选择的作用,作者利用多聚酶链式反应(PCR)和直接测序的方法对10个半滑舌鳎家系MHCⅡB基因位点遗传变异和平衡选择进行了研究。用特异性引物和PCR扩增的半滑舌鳎MHCⅡB基因片段大约397 bp,包含一部分第一外显子,全部第一内含子和全部第二外显子。10个半滑舌鳎家系中,每家系选取5个体,每个体5个克隆序列分析发现60个不同序列,代表60个等位基因,其中有28个是新发现的,已提交到Gen Bank。同源分析表明60个等位基因相似性为89.36%。共50个个体中,有6个存在5个不同等位基因,表明在半滑舌鳎至少存在3个座位。有9个家系的MHCⅡB序列多肽结合区(PBR)的非同义替换(dN)显著高于同义替换(dS)。     

半滑舌鳎肾脏组织结构与细胞种类研究

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是中国重要的海水养殖鱼类品种,目前对于其肾脏结构与细胞种类的研究较少。本研究以半滑舌鳎肾脏为研究对象,通过切片技术、免疫组织化学与显微镜观察,描述半滑舌鳎肾脏结构与细胞分布情况。结果显示,半滑舌鳎的肾脏可以分为头肾与体肾两部分;头肾较小,具有独立的结构,位于肾脏前部,靠近脑,形态上呈分叉状;头肾由淋巴髓样细胞构成,无肾小球等分泌结构,免疫细胞丰富,包括淋巴细胞、单核细胞、颗粒细胞,是半滑舌鳎免疫细胞的主要生发部位之一,是免疫系统的重要组成;半滑舌鳎的体肾与头肾后部分叉处相连,呈纺锤状,紧贴腹腔背部,向后延伸;体肾主要由肾单位组成,有丰富的肾小囊、近曲小管、远曲小管和集合管结构,表明其具有排泄功能。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)GnRHR基因全长cDNA 的克隆与组织表达分析

采用同源克隆和末端快速扩增(RACE)方法, 克隆了半滑舌鳎中 GnRHR 全长 cDNA。通过基因全长以及推断的氨基酸序列分析, 得知该序列包含一个 7tm-1 保守结构域, 为 G 蛋白偶联受体家族成员。利用 PHYLIP 3.5c 邻位相连法以及 DNAstar 中的 CLUSTAL W 方法对相应的氨基酸序列进行了聚类分析和序列相似度分析。结果表明, 半滑舌鳎 GnRHR 鳉 与鲈鱼、琥珀鱼、虹鳟以及青 等鱼类中的 GnRHR聚为一支, 亲缘关系较近, 且相似度较高, 分别为 90.1%、 89.7%、 79.0%以及 78.3%, 而与高等哺乳动物人、小鼠相似性仅分别为 18.8%和 16.2%, 亲缘关系较远。应用半定量 RT-PCR 技术分析其组织表达, 发现 GnRHR 广泛表达于各个组织, 但表达量差异较大, 在性腺、脑和肾中表达量较高, 其它组织较弱。     

盐度突变对半滑舌鳎血浆渗透压和鳃丝Na+/K+-ATP酶活性的影响

研究了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)由盐度30突变至0、1O、20、35和40盐度后血浆渗透压和鳃丝Na+/K+-ATP酶活性的变化.结果表明,盐度对半滑舌鳎血液渗透压和鳃丝Na+/K+-ATP酶活性均有显著影响(P＜0.05).盐度突变后,各处理组的血液渗透压和鳃丝Na+/K+-ATP酶活性...     

半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）促性腺激素受体在雄性生殖周期中的表达

采用RT-PCR方法,研究了促性腺激素受体（FSHR和LHR）基因在雄性半滑舌鳎繁殖周期中的季节表达规律。结果表明,FSHR mRNA在雄鱼精巢、脑和脾中及LHR mRNA在雄鱼的精巢和脾中均呈季节规律性变化。3月份样品中,FSHR mRNA在精巢表达量最低,12月份,表达量最高;FSHR mRNA在脑中表达模式与精巢...     

Age compositions of flatfish stocks as determined by a new otolithometric method, its application in the estimation of growth, spawning potential and fisheries management

We developed an ageing methodology and examined age composition of three flatfish stocks inhabiting the Seto Inland Sea, Japan. Ages were difficult to determine for three-lined tongue sole (Cynoglossus abbreviates) and ridged-eye flounder (Pleuronichthys cornutus) because the first year annulus ring was often indistinct; therefore, we used directional change in otolith growth to distinguish it. Sectioning and etching methods were powerful tools for identifying annual checks for red tongue sole (Cynoglossus joyneri). Using these ageing methods, we determined age–length relationships and growth curves. The age composition of the populations studied and of the landings showed that a large proportion of the latter consisted of individuals under the mean age of sexual maturity, thereby reducing the percent spawning potential ratio (%SPR) to ≈ 20% for all species. These findings suggest that fishing pressure on immature fish is leading to overfishing of these flatfish stocks.     

Age compositions of flatfish stocks as determined by a new otolithometric method,its application in the estimation of growth,spawning potential and fisheries management

We developed an ageing methodology and examined age composition of three flatfish stocks inhabiting the Seto Inland Sea, Japan. Ages were difficult to determine for three-lined tongue sole (Cynoglossus abbreviates) and ridged-eye flounder (Pleuronichthys cornutus) because the first year annulus ring was often indistinct; therefore, we used directional change in otolith growth to distinguish it. Sectioning and etching methods were powerful tools for identifying annual checks for red tongue sole (Cynoglossus joyneri). Using these ageing methods, we determined age–length relationships and growth curves. The age composition of the populations studied and of the landings showed that a large proportion of the latter consisted of individuals under the mean age of sexual maturity, thereby reducing the percent spawning potential ratio (%SPR) to ≈ 20% for all species. These findings suggest that fishing pressure on immature fish is leading to overfishing of these flatfish stocks.