麻痹性贝毒毒素研究Ⅱ.麻痹性贝毒毒素纯化产品的高效液相色谱和质谱分析

麻痹性贝毒(Paralytic Shellfish Poisoning， PSP)毒素由石房蛤毒素(saxitoxin， STX)及其衍生物组成，目前已发现20余种，在赤潮研究、分子生物学和神经生物学基础研究、医药、军事防化等方面均有应用潜力。由于PSP毒素的稀有来源和国际社会对STX交易的禁止，限制了国内PSP毒素应用及研究的全面深入展开，因此本文作者对PSP毒素进行了自行制备，并采用不同方法对制得的PSP毒素进行了分析研究。 目前已建立了多种PSP毒素的生物和化学分析方法。小鼠法作为PSP毒素监测和定量的标准方法已有60余年的历史(Sommer et al.，1937；McFarren et al.1958；Helich，1990)，它对海产品毒性的测定是很有效的方法，但难以揭示毒素的化学本质。其他生物分析方法如免疫分析等尽管灵敏度比小鼠法有所提高，但同样都面临难以揭示毒素的化学本质的难题。因此，对PSP毒素的分析还需借助仪器分析进行确证。尽管现在已针对PSP毒素建立了薄层色谱、毛细管电泳、高效液相色谱等多种化学分析方法，但真正得到广泛应用的只有高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)方法。对于这类PSP毒素的分离是基于离子对反相色谱原理，采用磷酸四丁基铵、己基磺酸盐、庚基磺酸盐、辛基磺酸盐等做离子对，在C-8或C-18反相色谱柱上进行分离。检测手段是基于PSP毒素在碱性条件下氧化——酸化后可以生成荧光衍生物这一原理(Bates et al.，1975)，将PSP毒素衍生生成荧光物质，用荧光检测器进行检测。 Oshima(1989)用三个等梯度洗脱法分别成功地分离分析了PSP毒素中的N-磺酰氨甲酰基类毒素(C1-C4)，膝沟藻毒素(GTX1-6)和石房蛤类毒素(STX，dcSTX和 neoSTX)，全部分析采用C-8反相柱。由于这种方法几乎可以分析已知的绝大多数PSP毒素，因而被广泛接受。     

麻痹性贝毒毒素研究Ⅰ.塔玛亚历山大藻的麻痹性贝毒毒素对运动神经末梢和全细胞钠离子通道的抑制作用研究

麻痹性贝毒 (ParalyticShellfishPoisoning ,PSP)毒素由石房蛤毒素 (saxitoxin ,STX)及其衍生物组成 ,目前已发现 2 0余种 ,在赤潮研究、分子生物学和神经生物学基础研究、医药、军事防化等方面都有应用潜力 [其结构、类型和应用见本集刊王云峰等 (2 0 0 3 )“麻痹性贝毒毒素的     

麻痹性贝毒毒素研究Ⅰ.塔玛亚历山大藻的麻痹性贝毒毒素对运动神经末梢和全细胞钠离子通道的抑制作用研究

麻痹性贝毒(Paralytic Shellfish Poisoning，PSP)毒素由石房蛤毒素(saxitoxin，STX)及其衍生物组成，目前己发现20余种，在赤潮研究、分子生物学和神经生物学基础研究、医药、军事防化等方面都有应用潜力[其结构、类型和应用见本集刊王云峰等(2003)“麻痹性贝毒毒素的应用研究进展”一文]。由于PSP毒素的稀有来源和国际社会对STX交易的禁止，限制了国内PSP毒素应用及研究的全面深入展开，因此本文作者对PSP毒素进行了制备，并采用不同方法对制备的PSP毒素进行了研究。 PSP毒素能够选择性地可逆抑制可兴奋膜的电压依赖钠离子通道的开放，从而阻止神经冲动的发生和传导，使神经、肌肉丧失兴奋性(Frace et al.，1986；Penzotti et al.，1998)。本文利用神经束膜下记录和全细胞膜片钳技术，报道了从塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)中提取的PSP粗毒素对小鼠运动神经末梢膜电流和NG108-15细胞钠离子通道的作用研究结果，并与STX标准毒素的作用结果进行了比较。 NG108-15细胞是由小鼠神经母细胞瘤和大鼠胶质细胞瘤融合的杂交细胞，经分化剂分化后，显示诸+L1196如兴奋性、合成和释放乙酰胆碱、与培养肌细胞形成突触联系等多种神经细胞的基本特性(Hamprcht，1977)和Na+、K+、Ca2+等多种离子通道，已作为神经细胞模型被广泛应用于分析药物对离子通道作用的研究(Enomoto et al.，1992； Docherty et al.，1992；Shi et al.，1993；Hu et al.，1997a；Hu et al.，1997b)；发育出具有Na+内流支持的锋电位(Hamprecht,1977)，该电位是分析作用于膜钠离子通道药物的好材料。     

麻痹性贝毒毒素的应用研究进展

由于有害赤潮的发生日趋频繁，对养殖业、自然生态系统和人类健康的危害越来越大，造成的经济损失也逐渐增加，因而有害赤潮问题成为人们关注的焦点。藻毒素是有害赤潮致害的重要因子之一，而麻痹性贝毒(Paralytic Shellfish Poisoning，PSP)毒素又是藻毒素中分布最广、危害最大的一类毒素。随着科学家们对PSP毒素的来源(Steidinger，1993)、结构和作用方式(Penzotti et al.,1998)的深入研究，PSP毒素在赤潮研究、分子生物学和神经生物学基础研究、医药、军事防化等的应用也逐渐受到重视。本文作者针对这些问题进行了综合评述，以期为深入开展PSP毒素应用研究提供参考依据。     

麻痹性贝毒毒素的应用研究进展

由于有害赤潮的发生日趋频繁 ,对养殖业、自然生态系统和人类健康的危害越来越大 ,造成的经济损失也逐渐增加 ,因而有害赤潮问题成为人们关注的焦点。藻毒素是有害赤潮致害的重要因子之一 ,而麻痹性贝毒 (ParalyticShellfishPoisoning ,PSP)毒素又是藻毒素中分布最广、危害最大的一类毒素。随着科学家们对PSP毒素的来源 (Steidinger,1 993 )、结构和作用方式 (Penzottietal.,1 998)的深入研究 ,PSP毒素在赤潮研究、分子生物学和神经生物学基础研究、医药、军事防化等的应用也逐渐受到重视。本文作者针对这些问题进行了综合评述 ,以期…     

渤海裸甲藻和链状亚历山大藻的麻痹性贝毒毒素分析

目的:分析渤海裸甲藻(Gymnodinium sp.)和链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)的麻痹性贝毒毒素,为渤海天津海域的赤潮研究积累基础数据。方法:通过实验室培养裸甲藻和链状亚历山大藻,选取对数生长期、平台生长期的裸甲藻以及平台生长期的链状亚历山大藻,利用高效液相色谱法(HPLC)对这两种微藻进行麻痹性贝毒(PSP)毒素分析。结果:裸甲藻细胞内不含有麻痹性贝毒(PSP);链状亚历山大藻细胞内含有C毒素和GTX1-4毒素,该微藻每个细胞毒素含量约为10.81 fmol/cell。结论:裸甲藻细胞内虽不含有麻痹性贝毒(PSP),但不能排除其含有其它毒素的可能。链状亚历山大藻细胞内含有麻痹性贝毒(PSP),属于有毒微藻,需要对其进行密切监测。     

中国沿海部分海域麻痹性贝毒研究

采用美国分析化学家协会推荐的小白鼠生物检测法,对产于大连、深圳、广西北海和福建厦门海域的贝类进行麻痹性贝毒检测,选取部分有毒样品进行高效液相色谱毒素成分分析。小白鼠生物检测法检测结果表明,样品消化腺毒素含量为0—25.3MU/g,剔除消化腺的其他贝类软组织均没有检测到PSP的存在。消化腺和其他软组织的毒力加权平均值为0—2.6MU/g,低于联合国粮农组织制定的贝类安全食用标准的限定值4MU/g。大连海域染毒样品的检出率为50%,在四个海域中最高,福建海域检出率则最低。高效液相色谱毒素成分分析结果表明,深圳和广西北海海域贝类所含PSP成分相似,包含有C毒素(C1/2),GTX毒素(GTX1—4)和STX,而大连海域贝类含有的毒素组分与前两者有较大差异,且随贝类采集的不同时期而变化。     

福建漳州海域麻痹性贝毒的污染状况调查

本文通过对漳州海域的养殖区栉孔扇贝扣僧帽牡蛎为期1a的麻痹性毒素（PSP）污染状况的调查分析，以了解贝类海产品的安全性．贝毒测定按照AOAC小白鼠法进行，利用高效液相色谱（HPLC）进行贝毒成分分析．结果表明：漳州海域的栉孔扇贝为该海域轻微PSP染毒贝类，含量为1．83～3．23MU／g；漳浦古雷和东山铜陵的栉孔扇贝样品检出率分别为66．7％和16．7％．高效液相色谱分析表明，样品中PSP成分为B1、GTX1／4、GTX2／3及STX和C毒素．漳州海域贝类PSP含量很低，未超出安全食用标准；但毒素分布存在季节差异，春季检出率较高．因此有针对性的加强贝毒监测非常必要．     

栉孔扇贝体内麻痹性贝毒的累积与排出过程研究

通过室内摄食实验,研究了栉孔扇贝(Chlamys farreri)对麻痹性贝毒(PSP)产毒藻的敏感性及其累积和排出毒素的特征.有毒微小亚历山大藻(Alexandrium minutum)在短时间内可对栉孔扇贝的摄食有一定的抑制作用,且投喂毒藻的浓度越大,对摄食作用的抑制越明显.栉孔扇贝对PSP贝毒的累积能力很强,实验中,48 h后内脏累积毒素就高达5000μg STXeq100g-1,但其毒素排出速率较慢,在24d解毒阶段后内脏中的毒素还没有下降至国际贝毒食用安全标准水平的80μg STXeq 100g-1.各毒素组成比在整个累积与排除过程中有较大变化,GTX1,GTX4在累积阶段比例下降,同时GTX2,GTX3比例上升;内脏中GTX2:GTX3的比值逐渐增加.毒藻中PSP贝毒毒素组成和贝体中PSP贝毒毒素组成之间的主要差别是GTX4含量的减少和GTX1含量的升高;而扇贝粪便中的毒素组成却与对数生长期的毒藻极为接近.     

麻痹性贝毒PSP在紫贻贝体内的累积、转化与排出

于1998年9月在青岛鲁迅公园附近礁石区采集紫贻贝（Mytilus edulis)，采用实验室培养的方法，初步研究了塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense,ATHK)产生的麻痹性贝毒（Paralytic Shellfish Poison,PSP)在其体内累积、转化与排出的规律。结果表明，在累积实验阶段，紫贻贝内脏的和肌肉中的PSP毒素含量均随实验时间的延长而逐渐增加，累积实验结束时，平均每只贝体内的PSP毒素含量为13.40nmol，毒性水平为12.24ugSTXEq/100g，紫贻贝内脏中的毒素含量远远高于肌肉，内脏中PSP毒素占贝体内PSP毒素总量的97.5%。在8天的排出实验阶段，贝体内的PSP毒素总量呈下降趋势，实验结束时，PSP毒素共排除了约50%，每天排除率约为9%。     

麻痹性贝毒研究进展

根据８０－９０年代中际上对麻痹性贝毒研究的最新进展,就研究中的几个热点问题进行综合评述,包括：麻痹性贝毒产毒藻的识别;毒素产生机制;毒素监测和分析方法;麻痹性贝毒对海洋生物的影响;麻痹怀贝毒对水产养殖业的影响及对策等。概括了麻痹性贝毒研究的现状和研究中的亟待解决的问题。中国在麻痹性贝毒毒素研究领域只进行了一些初步的工作,本文结合中中国的研究现状,提出以后在此领域内的重点研究方向。     

基于SPE与SPATT的水体中麻痹性贝类毒素检测方法构建与应用

为实现麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish poisoning,PSP)的实时监控与提前预警,本研究构建了基于固相萃取技术(solid phase extraction,SPE)与固相吸附毒素跟踪技术(solid phase adsorption toxin tracking,SPATT)的水体中PSP检测方法,重点优化了吸附材料及前处理方法,评价了回收率、检出限等指标,并将方法应用于2019年春季秦皇岛山海关海域PSP消长过程的监测中,比较评估了两种方法的监控预警效果。结果表明:SPE方法选用ENVI-Carb 500mg/6mL固相萃取柱,过样体积为50mL,13种PSP组分的平均回收率为82.2%±10.0%、检出限为4.0-20.0ng/L;SPATT方法选用SP207大孔吸附树脂,洗脱时间为静置Id最佳,整体回收率约为9.2%;在实际应用中,结合产毒藻密度及贻贝富集毒素含量的变化,发现SPE方法的检测结果可实时表征海域PSP风险状况,对于贻贝中PSP的预警效果也显著优于SAPTT方法,后者不仅因监控方式相对滞后一个监测周期,且灵敏度及准确性均较差。对于秦皇岛海域,当SPE方法检测结果达到100ng STX eq/L时,该海域贻贝中PSP残留将具有潜在的食用安全风险,跟踪过程表明这一阈值可提前两周预警贻贝富集毒素含量超出我国限量标准(800μg STX eq/kg),这对于强化风险警示并制定防范措施具有积极作用。     

麻痹性贝毒对肝脏和肾脏氧化损伤的影响

为了探讨麻痹性贝毒(PSP)对肝脏和肾脏损伤的机制,采用膝沟藻毒素GTX-1,4对小鼠进行急性暴露,剂量为1μg/kg,时间分别为60、90、120min。结果发现,与对照组相比,肝脏染毒组中的还原型谷胱甘肽(GSH)含量没有显著变化;在肾脏中,60 min时染毒组GSH含量没有明显变化,90、120 min时GSH含量降低;两器官中抗氧化酶(GSH-Px、SOD)活性与对照组相比均无显著变化(P0.05)。从而推断,GSH参与了PSP对肾脏损害的毒性过程;肾中GSH含量有可能作为PSP早期检测的敏感指标。     

黄渤海海域贝类麻痹性贝毒的检测与分析

采用小白鼠生物测试法和高效液相色谱法对2002~2005年我国黄渤海海域采集的贝类样品进行了麻痹性贝毒毒性检测,结果显示大连海域的虾夷扇贝含有麻痹性贝毒,有毒样品均出现在5月和6月,部分虾夷扇贝样品的毒素含量已经超过食用安全标准。通过高效液相色谱法分析了有毒虾夷扇贝体内的毒素成分,共检出了6种麻痹性贝毒组分,主要以毒性较低的C1和C2毒素为主,GTX3和GTX2次之,STX和neoSTX含量很低。通过高效液相色谱法分析得到的各毒素组分毒性总和与小白鼠生物测试法毒性测试结果基本相当。     

麻痹性贝毒素产毒藻工程化培育技术取得突破

2008年12月31日，从福建省科技厅在厦门组织的“麻痹性贝毒素产毒藻全封闭工程化培育关键技术研究”项目验收会上获悉，国家海洋局第三海洋研究所的科技人员根据产毒藻的生理特性，研究开发了一种适合产毒藻培育的光生物反应器，解决麻痹性贝毒素产毒藻全封闭工程化培育的关键技术难题，     

麻痹性贝毒在文蛤体内的累积及净化技术研究

试验研究分毒素累积和解毒两个阶段,丈蛤（Meretrix meretrix）对麻痹性贝毒（Paralytic Shellfish Poisoning,PSP）的累积能力试验中每天投喂一定量塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense）,定期测定丈蛤体内的毒素含量;解毒试验通过投喂饵料和水体消毒的“内排外解...     

麻痹性贝毒毒素在中华哲水蚤体内的累积及排出

本文研究了中华哲水蚤对可产生麻痹性贝毒毒素的塔玛亚历山大藻的摄食情况,以及麻痹性贝毒毒素在中华哲水蚤体内的累积和排出过程。实验发现,中华哲水蚤可以摄食有毒塔玛亚历山大藻,并在体内累积麻痹性贝毒毒素;麻痹性贝毒毒素各成分在中华哲水蚤体内发生相互转化的现象,同时中华哲水蚤又可通过自身代谢作用降解掉大部分毒素;中华哲水蚤可通过其排泄物在空间上转移麻痹性贝毒毒素。     

微小亚历山大藻投喂量与菲律宾蛤仔对麻痹性贝毒累积"转化和排出的动态

选用高毒性微小亚历山大藻台湾株和菲律宾蛤仔为研究对象,研究了不同毒藻投喂量对贝类累积和排出麻痹性贝毒(PSP)的影响.实验分为累积和排出2个部分,累积实验设计了4个投喂梯度(A组:2.0×107cell/d、B组:7.0×107cell/d、C组:1.1×108cell/d和D组:2.0×108cell/d),在排出毒素阶段,每实验组又分成投喂无毒饵料藻组和饥饿组并进行比较.结果显示不同投喂梯度组间PSP毒素累积存在明显差异.随着毒藻投喂量的增加,PSP毒性增加,但毒素累积率下降,这说明在一定范围内毒藻投喂量的大小对蛤仔的毒素累积有影响.A组、B组、C组的最高累积量依次为6.5,82.9,113.9μgSTXeq/100g,D组达到本实验的最高累积量154.1μgSTXeq/(100g),但累积率却随着投喂量的增加而递减,分别为1.79%,0.92%,0.42%和0.39%.停止投喂毒藻后蛤仔体内的PSP毒性迅速下降,在排出阶段,对投喂饵料组和饥饿组的比较结果用单因素方差分析(ANOVA)得出P＜0.05,结果差异显著,饥饿组的毒性均高于投喂饵料藻组,说明投喂无毒饵料有助于菲律宾蛤仔体内的毒素排出.其中D饵料组和饥饿组间排出速率差异最明显,饵料组的排出速率为13.2 μgSTXeq/(100g·d),饥饿组的仅为8.3μgSTXeq/(100g·d),因此将菲律宾蛤仔归属于快速排毒者.     

微小亚历山大藻投喂量与菲律宾蛤仔对麻痹性贝毒累积、转化和排出的动态关系

选用高毒性微小亚历山大藻台湾株和菲律宾蛤仔为研究对象,研究了不同毒藻投喂量对贝类累积和排出麻痹性贝毒(PSP)的影响。实验分为累积和排出2个部分,累积实验设计了4个投喂梯度(A组:2.0×107cell/d、B组:7.0×107cell/d、C组:1.1×108cell/d和D组:2.0×108cell/d),在排出毒素阶段,每实验组又分成投喂无毒饵料藻组和饥饿组并进行比较。结果显示不同投喂梯度组间PSP毒素累积存在明显差异。随着毒藻投喂量的增加,PSP毒性增加,但毒素累积率下降,这说明在一定范围内毒藻投喂量的大小对蛤仔的毒素累积有影响。A组、B组、C组的最高累积量依次为6.5,82.9,113.9μgSTXeq/100g,D组达到本实验的最高累积量154.1μgSTXeq/(100g),但累积率却随着投喂量的增加而递减,分别为1.79%,0.92%,0.42%和0.39%。停止投喂毒藻后蛤仔体内的PSP毒性迅速下降,在排出阶段,对投喂饵料组和饥饿组的比较结果用单因素方差分析(ANOVA)得出P0.05,结果差异显著,饥饿组的毒性均高于投喂饵料藻组,说明投喂无毒饵料有助于菲律宾蛤仔体内的毒素排出。其中D饵料组和饥饿组间排出速率差异最明显,饵料组的排出速率为13.2μgSTXeq/(100g.d),饥饿组的仅为8.3μgSTXeq/(100g.d),因此将菲律宾蛤仔归属于快速排毒者。     

2005年春季广东近岸海域麻痹性贝毒素的特征分析

于2005年3~5月,在广东省近岸海域的27个采样点(从东到西覆盖整个广东省沿海,包括了广东省的12大重点海湾海水养殖区)进行了贝类样品采集,共采集了35个品种120个样品。采用小白鼠生物检测法对麻痹性贝毒素(PSP)的检测结果表明,其3、4和5月采集的样品均检测出毒性值,2005年春季广东近岸海域的PSP呈现出以下主要特征:(1)PSP的检出率和含量值均较低。在120个检测的样品中,只有13个样品检测出PSP毒性数据,检出率为10.8%;检出PSP范围为每100 g贝类软组织含152~198 MU。其中北津港(东平)的托氏毛蚶和神泉港(神泉)的近江牡蛎样品,在1 h内小白鼠的致死率都非常高,但毒性并不强。所有检测出的PSP毒性数据值均大大低于我国目前暂定的警戒标准:每100 g贝类软组织含80μg STXeq(对KM系小白鼠而言,相当于每100 g贝类软组织含约423 MU)。2005年春季广东近岸海域海水水温偏低可能是一个重要原因。(2)感染PSP毒性的生物品种不多。在已检测的35个贝类品种中,只有8个品种检测出PSP毒性数据,占被检测总品种数的22.8%。牡蛎的PSP检出率相对较高,而其它常见品种如文蛤和翡翠贻贝的PSP检出率均较低,华贵栉孔扇贝未检出PSP。(3)PSP的地理分布范围较广。从检测出PSP毒性数据的样品的地理分布来看,范围较广,从东到西几乎包括了整个广东省沿海。其中北津港6个样品中,有2个检测出PSP毒性数据,PSP最高值也出现在北津港(东平)。广东12个大重点海湾海水养殖区,除红海湾、大亚湾、大鹏湾及海陵湾4个大重点海湾海水养殖区外,其它8个大重点海湾海水养殖区均检测出PSP,占12个大重点海湾海水养殖区总数的66.7%。在以前未检出的多处海水养殖区也能检出PSP。并就有关问题进行了讨论。