罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)致病性豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)的分离鉴定及其特性分析

近年来细菌性疾病因病原菌种类繁多、覆盖区域广而影响了其养殖业的健康发展,造成较大的经济损失。从体表具有黑斑、肢体残损症状的罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)肝胰腺组织中分离得到1株病原菌,通过形态学观察、生理生化特性鉴定、16S rRNA序列和特定毒力基因检测鉴定,以及人工回归感染试验和药敏试验分析其致病性和耐药性。结果表明,该菌为豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae),含有aer、lip、gcat、ser和OMPA I等毒力基因;药敏试验显示其对头孢曲松、氯霉素等7种抗生素高度敏感,对恩诺沙星、阿米卡星及复方新诺明3种抗生素中度敏感,对四环素、环丙沙星等10种抗生素具有耐药性;人工回归感染实验表明该菌具有较高的致病性,对罗氏沼虾的半致死浓度为6.54×10⁵ CFU/mL。豚鼠气单胞菌作为水产养殖中的条件性致病菌,研究结果揭示了该菌株的部分生物学特性,有利于丰富豚鼠气单胞菌属的基础数据,同时也为罗氏沼虾养殖过程中的病害防控提供了一定参考依据。     

香鱼(Plecoglossus altivelis)致病性类志贺邻单胞菌的分离与生化药敏鉴定

香鱼(Plecoglossus altivelis)是名贵洄游性鱼类,由于高密度养殖等因素导致病害频发。2021年7月强台风"烟花"过境后浙江省宁海县养殖香鱼暴发体表溃烂病,死亡严重。病鱼皮肤、肌肉溃烂并伴有周围皮肤充血。组织切片观察显示病鱼患处肌纤维断裂,周围红细胞、炎性细胞浸润;鳃丝和鳃小片中红细胞增多;肝细胞核呈空泡,部分细胞核染色质边集;脾脏内红细胞数量减少,部分白细胞聚集;肠黏膜上皮细胞脱落。从患病香鱼肠中分离到一株菌(编号NH21),其菌落低突、边缘光滑表面湿润,该菌株为革兰氏阴性菌,菌体呈短杆状、端圆。经生化特性和16S rDNA序列分析鉴定NH21菌株为类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)。用该菌株对健康香鱼进行回归感染后,人工感染香鱼呈现与本次体表溃烂病香鱼相似的症状,经计算NH21菌株对香鱼的半致死剂量(LD₅₀)为2.51×10⁷ CFU/mL。25种抗生素的药敏试验显示NH21菌株对阿奇霉素、头孢氨苄、新生霉素、多黏菌素B、头孢西丁、呋喃唑酮6种抗生素敏感。从NH21菌株中检出了毒力基因9个、耐药基因8个。综合分析表明,分离得到的类志贺邻单胞菌NH21菌株是本次宁海县香鱼体表溃烂病的病原菌,研究结果为香鱼出现类似病症的预防和治疗提供了基础资料。     

褐点石斑鱼脱鳞病病原菌的分离与鉴定

从海南陵水新村港网箱养殖脱鳞病濒死褐点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus)体内分离到3 株优势菌株XC08061、XC08062 和XC08063, 经回归感染试验确定为致病菌。这3 株细菌经生化鉴定以及16S rDNA 测序分析, 确定均为哈氏弧菌(Vibrio harveyi)。其中, XC08061 对体长为12～14 cm 褐点石斑鱼的半致死剂量为5.8×10² CFU/g 鱼体质量。药敏试验表明, 该菌具有较强的耐药性, 在所检测的25种抗菌药物中, 仅对新生霉素、头孢噻肟、先锋必/舒巴坦、诺氟沙星、依诺沙星和庆大霉素6 种抗菌药物敏感。     

香鱼(Plecoglossus altivelis)致病性类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)的分离与生化药敏鉴定*

香鱼(Plecoglossus altivelis)是名贵洄游性鱼类,由于高密度养殖等因素导致病害频发。类志贺邻单胞菌广泛存在于养殖水环境中,给香鱼养殖业造成严重经济损失。对患体表溃疡病的香鱼进行病原分离和鉴定,从患病鱼体表和肠道组织中分离到一株优势菌(NH21),其菌落低突,边缘光滑,表面湿润。革兰氏染色结果显示NH21为革兰氏阴性菌,菌形态为短杆状,端圆。经生化特性和16S rDNA序列分析鉴定为类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)。回归感染后,香鱼呈现与发病鱼相似的症状,皮肤、肌肉溃烂并伴有周围皮肤充血,组织切片可观察到病鱼肌纤维断裂,周围红细胞、炎性细胞浸润;鳃丝和鳃小片中红细胞增多;肝细胞核呈空泡,部分细胞核染色质边集;脾脏内包细胞增多,红细胞呈梭形;肠黏膜上皮细胞脱落。经计算其半致死量LD50为1.99×10⁷ CFU/mL。25种抗生素的药敏试验显示NH21菌株对阿奇霉素、头孢氨苄、新生霉素、多粘菌素B、头孢西丁、呋喃唑酮6种抗生素敏感。检出NH21菌株毒力基因9个,耐药基因8个。综合分析表明,分离菌株NH21为类志贺邻单胞菌属,是本次香鱼体表溃烂病病原菌,研究结果为香鱼出现类似病症的预防和治疗提供了基础资料。     

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)致病性维氏气单胞菌的分离鉴定与药敏特性研究

本研究从自然发病的养殖大黄鱼(Pseudosciaena crocea)肝脏处分离得到1株优势菌9L2,经形态学观察和传统生理生化鉴定,显示该菌为发酵型革兰氏阴性短杆菌,有动力,氧化酶阳性,水解赖氨酸及色氨酸等。利用Biolog细菌鉴定方法进行种属鉴定,确定9L2为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii),相似性达100%。同时对其16S rDNA基因进行PCR扩增、测序和系统发育分析,结果表明该菌与气单胞菌属的菌株亲缘关系最近,与维氏气单胞菌(登录号为LMG13695)的16S rRNA基因序列相似性达99.79%。经人工腹腔注射感染吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)的试验结果表明,9L2对罗非鱼的半数致死剂量LD_(50)为1.08×10~3CFU/g。24种抗生素药敏试验结果表明,该菌株对诺氟沙星、新生霉素、呋喃妥因、头孢曲松等13种药物高度敏感,对洛美沙星、卡那霉素等5种药物中度敏感,对利福平、青霉素等6种药物产生耐药性。20种中药体外抑菌试验结果表明,其中11种对致病菌体外抑菌效果较好,平均抑菌浓度范围为0.11—7.20mg/mL。     

克氏原螯虾源维氏气单胞菌分离鉴定及药敏特性研究

本试验通过对从患病的克氏原螯虾(Procambarus clarkii)肝胰腺中分离得到的一株优势菌X4进行鉴定,旨在确定病因并筛选出敏感药物,为今后克氏原螯虾维氏气单胞菌的防治提供参考。从患病克氏原螯虾肝胰腺分离致病菌,通过对其生理生化特征与16S rRNA基因序列分析进行鉴定,并通过纸片扩散法进行药敏试验。用菌株X4进行人工回归感染试验后,克氏原螯虾发病症状与自然发病症状相似。根据该菌株的形态特征、生化特性、16S rRNA与gyrB基因序列分析结果鉴定为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)。该菌株对庆大霉素、多西环素、新霉素及氟苯尼考等15种抗生素敏感,对阿莫西林、克林霉素及苯唑西林3种抗生素耐药。分离得到的菌株X4对克氏原螯虾有致病性,生产中可选用氟苯尼考、新霉素、多西环素等药物进行防治。     

小黄鱼(Larimichthys polyactis)鰤鱼诺卡氏菌的分离及鉴定

为探明舟山海域网箱养殖小黄鱼(Larimichthys polyactis)暴发的以体表溃疡、眼球溃烂、内脏出现白色结节为主要症状的疾病病因, 对患病小黄鱼体表溃疡处和结节病灶处采集组织样本, 在血琼脂平板上划线培养, 通过分离、纯化到同一优势菌株ZHNK2101。经形态学观察、生理生化鉴定、16S rRNA基因片段扩增及序列比对,确定该菌株为鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)。药敏试验结果显示, 菌株ZHNK2101对哌拉西林、头孢曲松、丁胺卡那、庆大霉素等16种抗生素敏感。回归感染试验表明, 该菌株可以感染小黄鱼并引起和自然感染相同的症状, 半致死浓度LD₅₀为7.28×10⁴ CFU/尾。另外,该病株会引起小黄鱼鳃、肝、肾和脾脏发生病理变化, 主要表现为鳃丝紊乱,肝脏、肾脏、脾脏组织细胞纤维化形成病理性结节。试验首次报道了小黄鱼感染鰤鱼诺卡氏菌的病例, 并从理化特性、药敏试验、回归感染及组织病理变化等方面对该菌株的特性进行了初步研究, 为小黄鱼养殖过程中由鰤鱼诺卡氏菌引起的内脏白点病的早期预防和治疗提供基础数据。     

斑点叉尾鮰(Ictalunes punctatus)源中间气单胞菌(Aeromonas media)分离鉴定及药敏特性

从湖南常德某养殖场死亡的斑点叉尾（Ictalunes punctatus）肝脏、肾脏、腹水及血水中分离到一株致病性菌株zy02。对该菌进行了形态特征观察、理化特性测定及分子生物学方法鉴定,用PCR方法同时扩增其16S rDNA和gyrB基因,分析了16S rDNA和gyrB两种基因序列的同源性,并构建了系统发生树。经生理生化测定和16S rDNA与gyrB基因序列分析,zy02株为中间气单胞菌。人工感染该菌后发病鱼表现为与自然发病类似症状,且从组织中再分离的细菌特性与原感染菌相同。腹腔注射后该菌株对斑点叉尾的半致死浓度为3.89×10⁶CFU/mL。菌株zy02对多西环素、庆大霉素及左氧氟沙星等高度敏感;对红霉素中度敏感;对阿莫西林、磺胺异噁唑、克林霉素及利福平等5种药物耐药。本研究为斑点叉尾该病防控提供了理论依据。     

致病性海洋弧菌对氨基糖苷类药物的耐药传递机制初步研究

随着抗菌药物在水产养殖中用量的增加及混合使用现象的出现，水产病原菌表现出更强的耐药性甚至是多重耐药性，大大增加了水产养殖中细菌性病害防治的难度。细菌耐药性最常见的传递方式是耐药质粒的转移。本研究通过对多个水产致病弧菌质粒上新霉素及卡那霉素的耐药基因aph（3''）-IIa进行检测分析，并利用电穿孔法将筛选得到的3个受试菌株上的质粒分别转入大肠杆菌中，结果从3个转化子中检测到目的基因。进一步的药敏测试结果显示，3个转化子的最小抑菌浓度（MIC值）以及最小杀菌浓度（MBC值）均明显上升。可见，在特定条件下，水生致病性弧菌对氨基糖苷类（新霉素和卡那霉素）的耐药质粒可转移至大肠杆菌并参与介导其耐药性，大大降低了受体菌对新霉素和卡那霉素的敏感性。本研究将为环境弧菌与临床细菌对氨基糖苷类药物的抗性传递研究提供数据基础和参考依据。     

斜带髭鲷内脏白点病病原的分离鉴定及耐药性分析

本研究采用平板分离法对具有典型症状的斜带髭鲷（Hapalogenys nitens）进行病原微生物的分离培养,结合形态学、生理生化特征和分子生物学技术对病原进行种属鉴定,并对分离得到的病原菌进行了药物敏感性试验。病理切片结果显示,病鱼肝脏、脾脏、鳃、头肾、心脏均可观察到明显的白色炎性肉芽肿病灶,从患病鱼脾脏、肝脏和头肾的白色结节处均分离到单一外观的细菌菌落hn-1。通过生理生化特征鉴定、16S rRNA基因测序和回归感染实验证实斜带髭鲷内脏白点病的致病菌为哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）。透射电镜观察显示分离菌具有极生鞭毛及侧鞭毛;毒力基因检测显示分离菌携带toxR、luxR、vvh、vhh和trh基因;药敏试验结果显示,分离菌株主要对喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类等药物具有较强的敏感性。研究结果可为斜带髭鲷的内脏白点病的病害防控提供科学依据。     

太平洋双色鳗鲡(Anguilla bicolor pacifica)致病性类志贺邻单胞菌的鉴定和中药敏感性研究

从发病死亡的养殖太平洋双色鳗鲡(Anguilla bicolor pacifica)肝脏中分离到一株优势菌AMSH1,为研究其种属、毒力及中药敏感性,结合BIOLOG微生物鉴定系统和16S r DNA序列分析对该菌株进行鉴定,并通过人工回归感染试验确定其致病性。此外,还研究了10味中药单用、10种双联用和4种三联用对该菌株的体外抑菌作用。结果显示该菌株为类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)。经人工腹腔注射感染健康太平洋双色鳗鲡,证实该菌具有致病性,半致死量LD50为3.2×105CFU/g。药敏试验结果表明,10味中药均有较好的抑菌效果,其中五倍子(Galla chinensis)、丁香(Eugenia caryophllata)和生地榆(Sanguisorba officinalis)的效果最好,7种双联用复方和1种三联用复方均具有协同抑菌作用。本次引起太平洋双色鳗鲡发病的病原为类志贺邻单胞菌,该菌对太平洋双色鳗鲡的致病性及其中药药敏的研究属首次报道。建议选用含五倍子的中药双联用复方或三联用复方进行防治,皆绿色环保。     

GFP标记的迟缓爱德华菌感染诸氏鲻虾虎鱼后组织分布研究

为探讨迟缓爱德华菌(Edwarsiellatarda)入侵途径,建立感染模型,作者通过电转化法构建GFP标记的迟缓爱德华菌EtMc1512(质粒PMDpp-EGFP),实验设立浸泡组、腹腔注射组和肌肉注射组,感染后采集各组实验诸氏鲻虾虎鱼(Mugilogobius chulae)血液、鳃、肝脏、肠、肌肉,培养法统计分析各组织中的荧光细菌数;浸泡组取样时间为0、2、4、6、8、12、24 h,腹腔注射组和肌肉注射组取样时间为6、12、24、48、72、96h。结果显示,构建的EtMc1512-GFP具有较强荧光,GFP标记前后菌株毒力基因(citC、mukF、esrB、katB、fimA、gadB)检测结果均为阳性。浸泡感染后实验鱼各组织内的荧光菌随时间表现为先升后降的趋势,最高菌量出现在肠道(2.51×106CFU/g),其次为鳃(4.19×104CFU/g)、血液(1.65×104CFU/g),肠道荧光菌显著高于其他组织(P0.05);腹腔注射感染后肝脏(4.55×106CFU/g)和血液(4.65×106CFU/g)菌量最高;肌肉注射感染后肌肉在48h首先检出荧光菌,血液(2.93×104 CFU/g)菌量最高。结果表明,肠道、肝脏和肌肉分别是迟缓爱德华菌浸泡感染、腹腔注射感染和肌肉注射感染诸氏鲻虾虎鱼的主要组织器官,在自然条件下迟缓爱德华菌经口感染诸氏鲻虾虎鱼风险较高。     

泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)病原温和气单胞菌(Aeromonas sobria)分子鉴定及耐药性研究

采用常规生理生化特性测定及16SrRNA、gyrB及rpoD基因同源性检索与系统发育学分析等分子生物学方法,对引起养殖泥鳅大量死亡的病原细菌进行了综合鉴定。生理生化特性结果表明,分离菌株NQ090701与气单胞菌属的温和气单胞菌相近;16SrRNA、gyrB及rpoD基因Blast序列同源性检索与系统发育学分析均与温和气单胞菌相似性最高;综合形态与生理生化特征及16SrRNA、gyrB与rpoD基因的分子特征,确认分离菌株NQ090701为温和气单胞菌(Aeromonas sobria)。同时,采用试管稀释法测定了养殖生产中常用的10种抗菌药物对病原温和气单胞菌的体外最小杀菌浓度(Minimal Bactericidal Concentration,MBC),结果表明氟哌酸杀菌作用最好,其次为盐酸沙拉沙星;甲砜霉素和复方磺胺甲恶唑在所试验的药物浓度范围对温和气单胞菌无杀菌效果。     

石斑鱼及暂养环境中副溶血弧菌分离鉴定与毒力评价

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)存在于海洋环境和海产品中,可引起人的食物中毒。本研究的目的是对某地石斑鱼暂养环境的副溶血弧菌的致病风险进行评价。结合弧菌选择性培养基TCBS、gyr B基因和16Sr RNA特定片段的序列分析方法对分离菌株进行鉴定;通过PCR检测毒力基因,血琼脂平板溶血实验、细胞感染实验、KM鼠灌胃实验分别检测各菌株的致病性、溶血性、细胞毒性与肠毒性。共鉴定出4株具有毒力的副溶血弧菌,分别为HS51-5、HS54-4、MJ01-1和MJ03-1。所有菌株都检测到溶血素基因(tdh和tlh)、三型分泌系统(T3SS)基因簇1(T3SS-1)的4个效应蛋白基因(vop Q、vop R、vop S和vpa0450)、和基因簇2(T3SS-2)的1个效应蛋白基因(Vop A)的分布,同时在HS51-5和HS54-4还检测到T3SS-2中的其他3个效应蛋白基因(vop C、vop T和vop L)。所有菌株都具有溶血现象、细胞毒性以及对小鼠的致死能力,而HS54-4、MJ01-1、MJ03-1对小鼠的毒力明显强于HS51-5。因此,从毒力基因检测、神奈川溶血、细胞毒性和对小鼠的毒力等4个方面的结果都表明副溶血弧菌具有致病性,说明石斑鱼暂养环境的副溶血弧菌具有致病风险,应加强对这些环境的监测。