中国北方沿海3种养殖扇贝碳、氮稳定同位素的组成特征

应用元素分析和稳定同位素质谱联用技术(EA-IRMS)对中国北方不同养殖地区的虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)、栉孔扇贝(Chlamys farreri)和海湾扇贝(Argopecten irradians)闭壳肌的碳、氮稳定同位素进行了测定,分析3种养殖扇贝的碳、氮稳定同位素组成特征。结果显示,青岛和獐子岛虾夷扇贝闭壳肌的?13C和?15N均差异性显著,长岛和旅顺栉孔扇贝闭壳肌的?15N差异性显著,莱州、牟平和旅顺海湾扇贝闭壳肌的?13C和?15N均差异性显著。闭壳肌的碳、氮稳定同位素组成能有效区分不同产地来源的3种养殖扇贝。     

几何形态学对8种扇贝的形态分类的应用

几何形态学(morphometrics)是基于笛卡尔地标点的统计分析方法,主要运用广义普鲁克分析(GPA)、薄板样条分析(TPS)、主成分分析(PCA)、典型变量分析(CVA)等方法,定量的对形态变化进行识别,结果更为客观。本研究运用几何形态学方法对8种常见扇贝(栉孔扇贝Azumapecten farreri、虾夷盘扇贝Mizuhopecten yessoensis、海湾扇贝Argopecten irradians、平濑掌扇贝Volachlamys hirasei、北海道扇贝Swiftopecten swiftii、荣套扇贝Gloripallium pallium、华贵类栉孔扇贝Mimachlamys nobilis、美丽环扇贝Annachlamys striatula)间形态关系进行研究,运用界标点和半界标点对扇贝的壳盘和壳耳进行数字化标点,利用PCA、CVA、TPS方法,获得8种扇贝的形态差异并进一步分析,建立系统发育树。PCA和CVA分析结果表明可以通过几何形态测量学分析方法将8种扇贝基于形态差异进行有效区分。此外,结合TPS的分析结果,发现壳耳和壳盘在扇贝中具有种间规律性差异。通过其形态分异进行表型聚类,从结果可知:美丽环扇贝、虾夷盘扇贝和海湾扇贝距离较近,壳型有共同的特征:扇贝壳盘较椭圆,壳耳相对较小;荣套扇贝和华贵类栉孔扇贝距离较近,壳型有共同的特征:扇贝壳盘更扁平,前耳相对较大;北海道扇贝、平濑掌扇贝和栉孔扇贝与其他种类没有交集。在聚类过程中,华贵类栉孔扇贝和荣套扇贝有交集,10个标本混淆,其他标本均成功聚类,正确率为95.5%。     

栉孔扇贝氨基酸组份与含量的比较研究

本文指出栉孔扇贝干贝氨基酸含量较高,次于虾夷扇贝,高于海湾扇贝。其氨基酸的含量与个体大小成反比。在软体部中以闭壳肌的氨基酸含量最高:闭壳肌的平滑肌的氨基酸含量高于横纹肌。从分析栉孔扇贝的17种氨基酸中以谷氨酸含量最高。栉孔扇贝外套膜和内脏块均含有相当量的氨基酸,可加以利用     

4种养殖扇贝的群体遗传多样性及特异性AFLP标记研究

应用AFLP技术对我国4种主要养殖扇贝进行了遗传分析.虾夷扇贝、海湾扇贝、华贵栉孔扇贝、栉孔扇贝4种养殖扇贝群体中,种内遗传相似度依次分别为0.841 5,0.786 3,0.719 0和0.673 1,香侬氏指数分别为43.52,58.87,80.16和92.83,栉孔扇贝和华贵栉孔扇贝的遗传多样性水平明显高于海湾扇贝和虾夷扇贝;AFLP标记共享位点分布表明,在4种扇贝中栉孔扇贝与华贵栉孔扇贝之间的共享位点最多,同时4种扇贝的种间遗传相似度也以栉孔扇贝和华贵栉孔扇贝之间为最高(0.769 5),海湾扇贝和虾夷扇贝之间为最低(0.662 6),揭示所研究的几种扇贝中栉孔扇贝和华贵栉孔扇贝的遗传关系最近(遗传距离为0.262 1);找到了21个种内特异性AFLP标记和种间共享标记,可用于种质鉴定和分子辅助分类.     

应用MSAP技术研究扇贝全基因组DNA甲基化水平

DNA甲基化作为真核生物基因组重要的表观遗传学修饰,对生物体基因的表达有重要的调控作用。为获得扇贝基因组DNA甲基化修饰水平及模式等表观遗传学信息,以栉孔扇贝(Chlamys farreri)、海湾扇贝(Argopecten irradians)、虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)以及本课题组培育的"海大金贝"为材料,建立了甲基化敏感扩增多态性方法(Methylation-sensitive amplified polymorphism,MSAP)的反应体系,利用该方法对其基因组DNA CCGG区域的甲基化水平进行分析。结果表明,本研究筛选得到的引物组合可用于贝类DNA甲基化的研究,在栉孔扇贝、海湾扇贝、普通虾夷扇贝和"海大金贝"的甲基化比例分别为32.08%、25.99%、32.88%和34.97%。几种扇贝基因组CCGG序列中,胞嘧啶的全甲基化率要高于半甲基化率,推测扇贝基因组中主要的甲基化模式是CpG型。通过对"海大金贝"和普通虾夷扇贝闭壳肌甲基化谱进行比较,筛查得到46个差异位点,这些位点可能参与"海大金贝"闭壳肌积累类胡萝卜素的调控。     

栉孔扇贝、虾夷扇贝及其杂交子代线粒体COI和Cytb基因遗传多样性分析

为了解栉孔扇贝(Chlamys farreri)、虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)及其杂交子代(F1)的种群遗传多样性和遗传结构,对3个群体的线粒体COI和Cytb基因的部分序列进行了扩增和分析。经比对分别获得781bp和725bp核苷酸片段,74个样本共检测到47个单倍型;F1群体的单倍型数、单倍型多样性指数、核苷酸多样性及平均核苷酸差异数都是最高的,而双亲的较低;F1和栉孔扇贝间的遗传距离最小,其次为栉孔扇贝和虾夷扇贝群体之间,F1和虾夷扇贝群体之间的遗传距离最大;F1和栉孔扇贝之间的遗传分化系数较小而两者间的基因流比较大,F1和栉孔扇贝与虾夷扇贝之间的遗传分化系数较大而基因流较小,说明栉孔扇贝和虾夷扇贝群体群体很早就发生了遗传分化;采用UPGMA法和简化的中介网络法构建的系统树表明,3个群体的所有个体被分为2个族群,栉孔扇贝和F1交叉聚为一类,虾夷扇贝独自聚为一类,2个分支间没有交叉;使用特异性引物分别对3个群体进行PCR扩增检验,结果栉孔扇贝的特异引物能在杂交子代中扩增,而虾夷扇贝的特异引物不能在子代中扩增出条带,说明栉孔扇贝和虾夷扇贝杂交,其子代的线粒体遗传模式为严格的母系遗传。本研究结果表明杂种优势的形成与线粒体遗传多样性的变化有关。     

栉孔扇贝×虾夷扇贝的杂交技术

以栉孔扇贝与虾夷扇贝为实验材料,进行了两者之间自交和栉孔扇贝♀×虾夷扇贝♂和虾夷扇贝♀×栉孔扇贝♂的杂交的实验。实验结果表明:两者的杂交是可行的,在幼虫阶段表现出一定的生长优势,幼虫成活率间没有差异,但在幼虫附着变态方面,杂交组低于自交组,两者之间有明显的差异。然后以具有生长优势的栉孔扇贝♀×虾夷扇贝♂组进行了生产性育苗实验,取得明显的经济效益。     

两种扇贝杂交和自交家系早期生长及甲基化的比较分析

运用杂交和自交方法建立虾夷扇贝♂(A)×栉孔扇贝♀(B)、栉孔扇贝♀(B)×栉孔扇贝♂(C)、栉孔扇贝♂(C)×栉孔扇贝♀(D)3 种组合家系, 每个组合3 个平行, 共9 个家系。对各家系卵径大小、胚胎孵化率、幼虫浮游阶段壳长生长速度等生物学参数进行比较, 建立了幼虫浮游期壳长与日龄的线性回归方程; 运用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分析了基因组DNA 胞嘧啶甲基化水平, SPSS 分析了DNA 甲基化与壳长生长的相关性。结果表明, 杂交家系的卵径大小、胚胎孵化率与自交组没有显著差异, 但壳长生长速度显著高于自交组, 这种优势可能主要来自于父本的影响; 家系AB、BC、CD 的平均DNA甲基化率分别为18.672%、22.661%和22.303%, 杂交使后代DNA 甲基化水平降低, 生长速度与DNA甲基化水平相关系数为?0.934, 相关水平极显著(P<0.01), DNA 甲基化与杂种优势具有一定的关系。     

虾夷扇贝养殖技术

虾夷扇贝是海珍品之一,是日本、朝鲜的主要海水养殖品种,为目前世界扇贝科中经济价值最高、产量最大的种类。 虾夷扇贝与栉孔扇贝在生物学上有些不同,它不是终生附着生活, 一般当壳高达7～8mm后便失去足丝。     

栉孔扇贝与虾夷扇贝杂交生产性育苗技术的研究

本文以栉孔扇贝♀与虾夷扇贝♂为试验材料,进行二者之间杂交育苗生产,并与栉孔扇贝自交生产比较,生产结果表明:二者的杂交是可行的,在幼虫阶段表现出一定的生长优势,幼虫成活率间没有差异,但在幼虫附着变态方面,杂交组低于自交组,二者之间有明显的差异。然后以具有生长优势的栉孔扇贝♀×虾夷扇贝♂组进行了生产性育苗实验,取得明显的经济效益。     

溶藻弧菌体外刺激泥蚶(Tegillarca granosa)血细胞后早期转录组研究

泥蚶(Tegillarca granosa)是我国传统养殖贝类,细菌性疾病导致的死亡已成为制约泥蚶养殖业发展的重要因素,血细胞是泥蚶免疫防御的执行者,血细胞能直接吞噬异物,能通过包囊作用将异物包裹,血细胞还在炎症反应和伤口修复中发挥作用。采用RNA-seq测序技术研究了溶藻弧菌体外刺激后泥蚶血细胞3h和6h时转录组动态变化,与未受刺激血细胞相比,3h时1790个基因表达发生显著改变,包括1319个上调基因和471个下调基因;6h时3183个基因表达发生显著改变,包括2629个上调基因和554个下调基因。KEGG通路富集分析发现溶藻弧菌刺激后免疫相关多个信号通路或生物学过程发生显著改变,如吞噬体、细胞凋亡、蛋白酶体、内质网加工、局部黏附等。部分免疫相关基因表达丰度3h时变化不显著而6h时发生显著改变,部分免疫相关基因3h和6h时表达丰度均显著改变。研究结果为泥蚶血细胞早期免疫反应提供了新的见解,为泥蚶抗病机理研究提供了理论基础。     

条斑紫菜Tubulin和Kinesin基因家族鉴定及失水胁迫表达模式分析

微管是细胞骨架的主要成分,其结构及动力学机制对提高生物体耐受性具有重要作用。微管网络如何通过结构的动态变化调控适应环境变化已成为胁迫生物学领域的研究热点之一。条斑紫菜(Pyropiayezoensis)能够适应潮间带复杂多变的环境,是研究潮间带大型海藻抗逆机制的良好材料。目前对紫菜微管相关基因家族构成及其生物学功能的研究较少。本研究利用生物信息学方法,在条斑紫菜基因组中共鉴定出4个Tubulin基因(Pyα-tubulin 1、Pyα-tubulin 2、Pyβ-tubulin和Pyγ-tubulin)和11个Kinesin基因(PyKinesin1—PyKinesin11),并对其理化性质、基因结构、蛋白特征、染色体定位、系统进化和失水胁迫下的表达模式进行了系统分析。结果显示:条斑紫菜中有3种微管蛋白(Tubulin)亚型;该家族成员散布于1号和2号染色体上, Pyα-tubulin 1和Pyα-tubulin 2为串联重复基因;PyTubulin家族成员在基因结构和蛋白特征方面均较为保守,且在转录水平对失水胁迫不敏感。条斑紫菜中有5种驱动蛋白(Kinesin)亚型,亚家族种类和基因数量均少于高等植物;该家族基因散布于1号、2号和3号染色体上,无串联重复基因; PyKinesin家族成员在基因结构和蛋白特征方面存在一定差异,PyKinesin1在中高度失水胁迫下表达量显著上调。本研究为进一步理解Tubulin和Kinesin基因家族的进化和功能、解析微管在条斑紫菜响应失水胁迫中的作用奠定了基础。     

紫锥菊提取物对大菱鲆(Scophthalmus maximus)的非特异性免疫功能的影响

本文旨在探讨肌肉注射不同浓度的紫锥菊提取物对大菱鲆(Scophthalmus maximus)的非特异性免疫功能的影响,试验选取体重(250±20)g的大菱鲆作为试验动物,分别注射10、20、40mg/m L浓度的紫锥菊提取物,试验共进行28d,每隔7d采集血液测试非特异性免疫指标,第28天用迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)攻毒,连续观察7d,测定其免疫保护率。结果显示肌肉注射紫锥菊提取物对大菱鲆超氧化物歧化酶(SOD)活力和溶菌酶活力(LSZ)的影响极显著(P0.01);对吞噬细胞吞噬率(PP)的影响显著(0.01P0.05),对吞噬细胞呼吸爆发活力的影响极显著(P0.01)。攻毒试验表明,紫锥菊提取物能够降低迟缓爱德华氏菌攻毒后鱼的死亡率,提高其免疫保护率,尤其是40mg/m L组。本试验研究表明,紫锥菊提取物能显著的提高大菱鲆的非特异性免疫功能,且以注射浓度40mg/m L的效果最好。     

青鱼(Mylopharyngodon piceus)新发病病原类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)的分离鉴定

为研究青鱼暴发性死亡原因,从病症典型青鱼(Mylopharyngodon piceus)肌肉、肝脏和肾脏处进行细菌接种,分离获得一株细菌(HZ2015),对其进行了形态观察、生化特性检测和16S r RNA序列分析,通过动物回归实验、毒力检测和药敏试验了解其对青鱼的致病性、毒力及药物敏感性。所得菌株为类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides),动物回归实验能复制出类似症状,且能从体内再次分离到该菌株;分离株对小鼠的半数致死量(LD50)为106.6 CFU;对头孢呋辛、头孢哌酮、庆大霉素、卡那霉素、复达欣高度敏感。研究表明,菌株HZ2015为青鱼体表溃烂病病原,本研究系类志贺邻单胞菌致青鱼体表溃烂病的首次报道。     

麻痹性贝毒在毛蚶体内的转化过程研究

麻痹性贝毒能够在贝类体内累积,威胁海产品消费者健康。在以往调查中,多次在毛蚶(Scapharca subcrenata)体内发现高含量的麻痹性贝毒,但对于毛蚶体内麻痹性贝毒的转化过程及其食品安全风险还缺乏认识。通过室内模拟实验,选择太平洋亚历山大藻(Alexandrium pacificum)和链状裸甲藻(Gymnodinium catenatum)作为产毒藻种,研究了两种有毒藻种所产麻痹性贝毒在毛蚶体内的转化过程。结果表明,毛蚶体内主要出现了三种麻痹性贝毒转化过程,一是R1位羟基的还原反应,二是N-磺酰氨甲酰基类毒素R4位磺酸基团的水解反应,三是含羟基苯甲酸(hydroxybenzoate)基团的链状裸甲藻毒素在R4位的水解反应。毛蚶体内麻痹性贝毒的生物转化过程复杂,对毛蚶毒性的影响具有一定的不确定性,未来仍需要进一步深化毛蚶体内毒素累积、代谢、转化过程的研究,同时加强对毛蚶体内毒素含量的全面监测,防范毛蚶可能导致的麻痹性贝毒中毒风险。     

条斑紫菜酵母双杂交文库的构建及PyMAPK5互作蛋白的筛选

为进一步研究条斑紫菜促分裂原活化激酶家族PyMAPK5的下游互作蛋白,理解其生物学功能,本研究通过酵母双杂交的方法进行其相互作用蛋白的筛选。提取不同温度和失水逆境胁迫下的RNA,利用Invitrogen体系构建条斑紫菜酵母双杂交cDNA文库,其库容为1.44×107CFU,重组率为91.8%。以pGBKT7-PyMAPK5为诱饵蛋白载体,利用共转化方法,从文库中筛选得到26个与PyMAPK5互作的候选蛋白。候选蛋白集中在光系统II相关蛋白、捕光蛋白、微管蛋白、ATP酶、GTP结合蛋白及假设蛋白等。微管蛋白、捕光蛋白、光系统II蛋白一对一验证结果为阳性,表明在酵母体内存在互作。本研究为阐明条斑紫菜PyMAPK5与其互作蛋白的关系及解析PyMAPK5下游作用机制奠定了基础。     

鳗弧菌对魁蚶血细胞形态及免疫功能的影响

本研究采用快速瑞氏-吉姆萨染色法观察鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激后魁蚶(Scapharca broughtonii)几种血细胞的形态变化,研究不同种类血细胞的免疫功能。魁蚶血淋巴液中红细胞、白细胞和血栓细胞经免疫刺激后均发生形态改变,属于免疫防御的应激反应。经鳗弧菌免疫刺激后,红细胞无丝分裂现象增多,并参与病原菌的吞噬作用;白细胞变形运动、吞噬和融合现象普遍,细胞表面具有粘性,参与血栓的形成;血栓细胞主要表现出粘连和凝血的特性,偶有吞噬病原菌的现象;研究中检测了2种常规抗凝剂的抗凝效果,结果表明,2种抗凝剂分别改变了血栓细胞和白细胞的表面粘连特性,从而阻止它们参与凝血,因而都具有抗凝效果。本研究结果表明,魁蚶血细胞分工明确,能共同防御病原菌的入侵,细胞免疫在魁蚶血淋巴液抗菌免疫中起极其重要的作用,血细胞的形态变化和免疫功能分析可为后期研究魁蚶抗菌机制和筛选抗凝剂奠定基础。     

日照沿海养殖三疣梭子蟹血卵涡鞭虫流行病发生过程研究

血卵涡鞭虫(Hematodinium spp.)是一类严重危害海洋甲壳类动物的新型寄生性病原,可引发养殖三疣梭子蟹“牛奶病”,导致梭子蟹大量死亡,造成巨大经济损失。目前,对于血卵涡鞭虫在日照养殖梭子蟹中的流行发生情况还未见报道,2020年8月和2021年5～11月期间在日照主要梭子蟹养殖区开展流行病学调查研究,通过形态学观察、组织病理检测和分子生物学鉴定发现了血卵涡鞭虫(Hematodinium perezi)在日照地区的流行分布,并发现其流行病发生在6～9月间,高发期为7～8月,感染率高达52.5%。感染宿主的血淋巴和心脏、肝胰腺、鳃、肌肉等组织中发现了丝状滋养体、类变形虫滋养体、蛛网状滋养体、团块状聚合体、孢子前细胞和孢子等血卵涡鞭虫的多个生活史阶段。在养殖池塘环境水体中检测到血卵涡鞭虫存在,水体中血卵涡鞭虫丰度与宿主感染率存在错峰现象,间隔3～4周。流行病的发生与水体温度和盐度变化密切相关,7～8月较高的水温(26.2～28.6°C)促进了血卵涡鞭虫在宿主体内快速增殖及流行病爆发,而较低的盐度(20.7～25.3)可能抑制了环境水体中血卵涡鞭虫的存活及其传播扩散。以上研究结果初步...     

大口黑鲈(Micropterus salmoides)致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及其特性分析

大口黑鲈(Micropterus salmoides)是我国重要的淡水养殖经济鱼类品种,目前包括细菌性疾病在内的诸多因素影响了其养殖业的健康发展。维氏气单胞菌是引起淡水鱼败血症和溃疡综合征的重要病原菌。从患病大口黑鲈肝脏组织中分离到1株病原菌,通过形态学观察、生理生化特性分析、16S rRNA序列和特定毒力基因分析对其进行鉴定,并通过人工回归感染试验和药敏试验分析其致病性和耐药性。结果表明该菌为致病性维氏气单胞菌(Aeromonas veronii),含有aer、act、lip、fla、gcaT和OMPA I等毒力基因;药敏试验显示其对头孢曲松、氯霉素、氟苯尼考、强力霉素、四环素、多粘菌素、复方新诺明、左氟沙星等8种抗生素高度敏感,对新霉素、恩诺沙星、庆大霉素、链霉素、阿齐霉素、环丙沙星等6种抗生素中度敏感,对其他8种抗生素具有一定耐药性;人工回归感染实验表明该菌具有较高的致病性,对大口黑鲈的半致死浓度为1.4×10⁶ CFU/mL。维氏气单胞菌是水产养殖中的条件性致病菌,研究结果揭示了该菌株的部分生物学特性,有利于丰富维氏气单胞菌属的基础数据,同时也为鲈鱼养殖过程中的病害防控提供了一定的参考依据。     

小黄鱼(Larimichthys polyactis)鰤鱼诺卡氏菌的分离及鉴定

为探明舟山海域网箱养殖小黄鱼(Larimichthys polyactis)暴发的以体表溃疡、眼球溃烂、内脏出现白色结节为主要症状的疾病病因, 对患病小黄鱼体表溃疡处和结节病灶处采集组织样本, 在血琼脂平板上划线培养, 通过分离、纯化到同一优势菌株ZHNK2101。经形态学观察、生理生化鉴定、16S rRNA基因片段扩增及序列比对,确定该菌株为鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)。药敏试验结果显示, 菌株ZHNK2101对哌拉西林、头孢曲松、丁胺卡那、庆大霉素等16种抗生素敏感。回归感染试验表明, 该菌株可以感染小黄鱼并引起和自然感染相同的症状, 半致死浓度LD₅₀为7.28×10⁴ CFU/尾。另外,该病株会引起小黄鱼鳃、肝、肾和脾脏发生病理变化, 主要表现为鳃丝紊乱,肝脏、肾脏、脾脏组织细胞纤维化形成病理性结节。试验首次报道了小黄鱼感染鰤鱼诺卡氏菌的病例, 并从理化特性、药敏试验、回归感染及组织病理变化等方面对该菌株的特性进行了初步研究, 为小黄鱼养殖过程中由鰤鱼诺卡氏菌引起的内脏白点病的早期预防和治疗提供基础数据。