香鱼Apo-14基因的克隆、序列分析及其mRNA表达与盐度适应性的关系

14 kDa载脂蛋白（Apo-14）是鱼类一种特有的载脂蛋白,是鱼类高密度脂蛋白（HDLs）的重要成分,其生物学功能目前还不明确.本研究采用简并引物,从香鱼（Plecoglossus altivelis）肝脏cDNA文库中筛选香鱼Apo-14基因,该基因cDNA序列全长905个核苷酸,开放阅读框编码一个有144个氨基酸,分子量约为15.9 kDa的蛋白.香鱼Apo-14基因mRNA主要在香鱼肝脏中表达,在肠、肾和鳃中也有少量表达.同源性分析揭示,香鱼Apo-14与已知鱼类中虹鳟（Oncorhynchus mykiss）Apo-14最相似,氨基酸序列同源性为70%.qRT-PCR表明,咸淡水处理组（盐度为10）的肝、肠、肾、鳃中,该基因mRNA均比淡水处理组（盐度为0）明显下调（p〈0.05）,揭示载脂蛋白Apo-14可能与盐度适应相关.     

半滑舌鳎的一种细胞凋亡抑制因子的克隆、鉴定与分析

克隆半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的1种细胞凋亡抑制因子survivin基因,并对其序列及表达模式进行分析.结果表明,该基因cDNA 序列全长704 bp(GenBank登录号为EU499314),包括86 bp5'非翻译区,444 bp开放阅读框以及含 poly(A)信号的174 bp的3'非翻译区,编码147个氨基酸.氨基酸序列同源性分析表明,半滑舌鳎survivin氨基酸序列与斑马鱼、非洲爪蟾、鸡、小鼠和人survivin氨基酸序列的同源性分别达到了63.3%,49.0%,43.7%,43.6%和41.5%.RT-PCR分析表明,survivin基因在半滑舌鳎成体雌鱼卵巢中大量表达,在雌鱼的肾脏中微量表达,在其它雌鱼的组织中无表达,在雄性的任何组织中均无表达.该基因在受精卵、多细胞和囊胚3个胚胎发育的早期阶段,大量表达,而随着胚胎发育的进程,survivin基因的表达逐渐减少,在孵化前尾芽期胚胎中只有微量表达,在孵化后5 d的仔鱼中,几乎检测不到survivin基因的表达.表明该基因可能参与卵子形成和胚胎的早期发育.     

缢蛏生长因子受体结合蛋白2基因克隆、时空表达及SNP筛查

为了探索生长因子受体结合蛋白2（GRB2）在缢蛏生长发育中的作用，本实验基于缢蛏转录组文库，利用SMART RACE技术克隆缢蛏GRB2（Sc-GRB2）基因的cDNA全长序列，分析其在不同组织和发育时期的表达差异，并在外显子中进行了SNP位点筛选。结果表明，Sc-GRB2基因cDNA全长1 223 bp，开放阅读框711 bp，编码236个氨基酸；氨基酸序列比对发现，缢蛏与文蛤、泥蚶等双壳贝类同源性较高（64%、59%），而与其他物种的同源性为45%~58%，表明GRB2基因比较保守；不同组织的荧光定量PCR （qRT-PCR）结果显示，Sc-GRB2基因在缢蛏7个组织中均有表达，其中足中的表达量极显著地高于其他6个组织（P<0.01）；在8个发育时期的表达差异分析发现，该基因在稚贝期表达量极显著地高于其他7个时期（P<0.01）。SNP位点筛选结果表明，在Sc-GRB2基因的外显子区域共发现11个SNP位点。     

二种多管水母光蛋白基因的分离、表达及生物活性初步研究

分别从厦门东海域的大型多管水母和细小多管水母中分离到了新的光蛋白基因aeqxm和aeqxxm,并在大肠杆菌中进行了表达.aeqxm和aeqxxmDNA序列的编码区总长均为585bp,无内含子序列,推导的氨基酸序列总长均为195个氨基酸.aeqxm,aeqxxmDNA和AEVAQ440XcDNA之间的核苷酸序列同源性分别为80.7%,85.1%,aeqxm和aeqxxmDNA的核苷酸序列同源性为87.2%.原光蛋白apoaeqxm,apoaeqxxm与AEVAQ440X编码的氨基酸序列之间的同源性分别为84.7%,84.2%,apoaeqxm和apoaeqxxm的氨基酸序列之间的同源性为94.4%.分别将aeqxm和aeqxxm基因克隆至pTO-T7表达载体,apoaeqxm,apoaeqxxm在大肠杆菌中的表达量都达到40%左右.取菌体超声上清与腔肠动物荧光素f、巯基乙醇混合再生后,加入CaC_l2,用荧光全谱仪检测到470nm处的瞬时发光,表明表达的apoaeqxm,apoaeqxxm具有正常的生物学功能.     

哈维氏弧菌FlaA基因的克隆、序列分析及真核表达质粒的构建

哈维氏弧菌是水产病害中常见的致病菌.参照基因库上登录的弧菌鞭毛丝蛋白FlaA基因序列设计简并引物,PCR扩增哈维氏弧菌TS-628株的FlaA全基因,并克隆到pMD 18-T载体中测序,经序列分析该基因全长1 140 bp,编码379个氨基酸.与基因库中其他弧菌的同源基因序列比较显示,哈氏弧菌FlaA基因与霍乱弧菌FlaA基因的同源性最高(79.5%),该基因编码的多肽缺乏半胱氨酸,并在N-,C-两端的氨基酸序列较为保守,中间区域的变异较大.对该蛋白的氨基酸组成及空间结构进行了分析和预测,并推测该蛋白质的平均分子量为40.6 kDa.在该基因末端加上一段编码Flag短肽的核苷酸序列后克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),获得带哈氏弧菌鞭毛丝蛋白FlaA基因的真核表达重组质粒pcDNA-FlaA-tag,为其DNA疫苗的进一步研究奠定了基础.     

第1期

论文与报告基于连续沥取的富钴结壳成凶机制的探讨………………………………………………………………………………蔡毅华,黄奕普,邢娜（1）饥饿对斜带石斑鱼稚鱼胃肠道内分泌细胞的形态、定位和分布密度的影响…………………………………………………翁幼竹,方永强（10）地芽孢杆菌属DYth03DNA聚合酶基因的克隆、表达及性质分析……………………………………………………罗淑娅,李侃,徐丽美（17）杂色鲍血蓝蛋白HtHI基因第16内含子SNP密度的分析…………………………………………梁翠,陈军,游伟伟,王德祥,柯才焕（21）大亚湾大鹏澳海域表层沉积物中浮游植物休眠体集群的季节变化…………………………………………付永虎,王朝晖,康伟,杨宇峰（27）     

海水养殖花鲈鳃组织hepcidin-like抗菌肽基因克隆与序列分析

本研究利用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）和cDNA末端快速扩增技术（3’RACE）克隆出海水养殖花鲈（Lateolabrax japonicus）鳃组织hepcidin-like抗菌肽基因cDNA（523bp），包含完整的编码区、3’端非翻译区（3’UTR）和典型的多腺苷酸化信号（AATAAA）．该基因编码86个氨基酸，由信号肽、优势域和成熟肽组成．与花鲈肝脏分离到hepcl及国外发表白鲈（Morone chrysops）hepcidin氨基酸序列进行比较，结果显示花鲈鳃hepcidin-like基因编码的氨基酸与它们在27个位点上存在着差异；该hepcidin-like基因可能为hepcidin的不同变体，属于hepcidin抗菌肽家族的新成员．     

脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)ferritin 基因克隆及表达分析

采用RT-PCR及RACE技术获得了总长度为755bp的脊尾白虾ferritin基因cDNA序列。该基因序列5’和3’的非编码区分别为112bp和146bp,开放阅读框497bp,推测编码169个氨基酸,预测蛋白分子量19.1kDa,等电点5.46,该基因命名为Ecfer基因。利用Neighbor-joining法构建系统进化树分析结果表明,Ecfer基因氨基酸序列与无脊椎动物中的甲壳动物聚为一支(同源性为64%—67%)。此外,Ecfer基因氨基酸序列与脊椎动物铁蛋白H链同源性为53%—57%。采用荧光定量RT-PCR研究Ecfer基因在组织中以及经WSSV刺激后血淋巴、肝胰腺中的表达变化情况。研究结果表明,Ecfer在肝胰腺、卵巢、肌肉、鳃和血淋巴中均有分布。注射WSSV后3h和6h,肝胰腺和血淋巴Ecfer基因表达较对照组均显著上调(P<0.05),并具有显著的时间差异性。说明Ecfer基因可能参与了脊尾白虾抵抗WSSV入侵的免疫反应。     

花鲈Syntaxin 4基因及其在免疫应答反应中的表达特征

采用RT-PCR技术,从花鲈(Lateolabrax japonicus)中克隆得到膜蛋白Syntaxin 4基因近85%的CDS序列.同源性分析表明,该序列与斑马鱼以及哺乳动物的Syntaxin 4 基因的有较高相似性.利用实时定量PCR技术分析Syntaxin 4基因在mRNA水平上的相对表达量.结果表明,该基因在脑组织和免疫相关组织中都有表达,以脑组织的表达量最多,在免疫相关组织中的表达量由多到少依次是脾脏、头肾和血液.在LPS刺激24 h后,脾脏和头肾中的表达量分别是对照组的7.83倍和10.41倍,表明免疫组织中Syntaxin 4基因的相对表达量随诱导增强,提示该基因在花鲈免疫应答反应中可能起重要作用.     

CLONINGAND EXPRESSION OF TWO GENES ENCODING TYPE I CRUSTACEAN HYPERGLYCEMIC HORMONE FAMILY FROM THE MUD CRAB SCYLLA

采用RT-PCR及RACE技术,从拟穴青蟹眼柄组织中克隆了两种I型高血糖激素CHH基因（分别命名为C1与C2）cDNA全序列。序列分析结果表明：Cl基因全长1859bp,开放阅读框长420bp,编码139个氨基酸,分子量为15．326kDa,等电点为5．540;C2基因全长1739bp,开放阅读框长426bp,编码141个氨基酸,分子量为15．621kDa,等电点为7．618。与其它物种CHH氨基酸序列进行同源性比较分析显示,拟穴青蟹CHH基因与榄绿青蟹CHH基因同源性最高（92％）,依次为日本鲟（80％）、三疣梭子蟹（78％）。聚类分析表明,拟穴青蟹CHH氨基酸序列与榄绿青蟹和日本鲟紧密聚为一支。经荧光定量检测,拟穴青蟹CHH基因在眼柄、肝胰腺、心脏、肠中表达量较高,鳃、胃中表达量很少,肌肉中表达极少。盐度骤变试验结果表明：盐度胁迫24h后,c2的表达量是C1的30倍以上;C2基因盐度5时与对照组的表达量差异不显著（P〉0．05）,盐度15时差异显著（P〈0．05）,盐度22、25、30时差异极显著（P〈0．01）;盐度变化越大,C2的表达量越大。上述结果为进一步深入研究CHH基因的功能及调控机理奠定基础。     

沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶(RubisCO)(EC4.1.139)是光合细菌通过卡尔文循环固定二氧化碳的关键酶。本文采用PCR方法,从沼泽红假单胞菌株No.9中克隆到RubisCO基因(cbbM)序列(该序列已提交GenBank,登录号:GU061327)。采用同源建模法,建立了该RubisCO蛋白的三维结构模型,预测其活性位点。将cbbM基因亚克隆到表达载体pTV118N上,构建表达质粒pTV-CBBM,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达菌株BL21(DE3)/pTV-CBBM,该菌株经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE检测。采用气相色谱法测定破菌上清中的RubisCO酶活。结果表明:①cbbM基因编码461个氨基酸,与沼泽红假单胞菌株DCP3和DH1的RubisCO蛋白序列相似性分别为98%和99%;②推测沼泽红假单胞菌No.9中RubisCO蛋白的活性中心由Asn112、Lys192、Asp194、Glu195、His288、Arg289、His322、Gly424、Ser369、Gly370和Gly394等氨基酸残基组成;③重组蛋白分子量约为50kDa左右,与预测相符;④破菌上清中的RubisCO酶比活高于原始菌株中的酶活,说明目的基因在大肠杆菌中得到了有效表达。     

致病性鳗弧菌W-1外膜蛋白ompU基因克隆及在大肠杆菌中的表达

从致病性鳗弧菌W-1基因组DNA扩增并克隆了1 156bp的特异性片段,含有完整的外膜蛋白ompU基因阅读框,由993个核苷酸组成,编码330个氨基酸残基的蛋白质。与国外已发表的鳗弧菌外膜蛋白基因的序列同源性为100%,与创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、费氏弧菌(Vibrio fischeri)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的序列同源性分别为72%,69%,68%和64%。将该外膜蛋白基因克隆于pBV220表达质粒,在大肠杆菌中得到了表达,SDS-PAGE分析表明表达蛋白分子量约38kDa,Western blot分析发现表达蛋白能与鳗弧菌外膜蛋白抗体很好的反应。     

Identification of a marine agarolytic bacterium Agarivorans albus QM38 and cloning and sequencing its beta-agarase genes

A total of 117 agar-decomposing cultures were isolated from coastal seawater around Qingdao,China.The phenotypic and agarolytic features of an agarolytic isolate,QM38,were investigated.The strain was gram negative,strictly aerobic,curved rod and polar flagellum.On the basis of several phenotypic characters,biochemical and morphological characters and phylogenetic analysis of the gene coding for the 16S rRNA,the strain was identified as Agarivorans albus strain QM38.This strain can liquefy the agar on the solid agar plate.An excellular agarase activity was determined in liquid culture.The enzyme exhibited maximal activity at 40℃,pH 7.6.Its activity was greatly affected by different concentrations of agarose.The highest activity 32 U/ml was achieved in the culture supernatant.The hydrolytic product was analyzed by fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE).After complete hydrolysis of agarose,a series of agaro-oligosaccharides were produced.The main products of the enzymes were oligosaccharides in the degree of polymerization (DP) of 2,4,6 and 8.Three genes agaD01,agaD02 and agaD03,encoding β-agarases,had been cloned from genomic DNA of Agarivorans albus strain QM38.The open reading frame of agaD01,consisted of 2 988 bp,and shared 95.5%-98.9% identity to the β-agarase genes of some strains of Vibrio and Agarivorans.Gene agaD02 comprised 2 868 bp and encoded a 955-amino-acid protein.It showed 97.4% and 98.7% identity to the β-agarase genes of strain Vibrio sp.PO-303 and strain Vibrio sp.JT0107,respectively.Only partial sequence of agaD03 gene has been cloned.It showed 96.5% identity to β-agarase gene (agaB) of Pseudoalteromonas sp.CY24,and shared 96.8% identity to β-agarase-c gene of Vibrio sp.PO-303.     

副溶血弧菌trh基因的克隆、表达及基因缺失株的构建

利用PCR方法从VP基因组DNA中扩增出trh溶血素基因,构建了大肠杆菌原核表达载体,对trh进行了表达和纯化,经溶血活性检测,复性蛋白具有溶血活性.同时还构建了trh基因缺失株,对trh基因进行了基因敲除研究.结果表明,单独敲除trh基因并不能够影响菌株的溶血活性,说明副溶血弧菌还存在其它溶血素基因.     

Molecular cloning and expression analysis of Crustin-like gene from Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis

A new member of antimicrobial protein genes of the Crustin family was cloned from haemocytes of the Chinese shrimp Fennero- penaeus chinensis by 3 ′and 5′ RACE. The full-length cDNA of Crustin-like gene contains a 390 bp open reading frame, encoding 130 amino acids. The deduced peptide contains a putative signal peptide of 17 amino acids and mature peptide of 113 amino acids. The molecular mass of the deduced mature peptide is 12. 3 ku. It is highly cationic with a theoretical isoelectric point of 8.5. The deduced amino acids sequence of this Crustin showed high homology with those of Penaeus （ Litopenaeus ） setferus. Northern blotting showed that the cloned Crustin gene was mainly expressed in haemocytes, gill, intestine, and RNA in situ hybridization indicated that the Crustin gene was constitutively expressed exclusively in haemocytes of these tissues. Capillary elec- trophoresis RT-PCR analysis showed that Crustin was up-regulated dramatically from 12 to 48 h after a brief decrease of mRNA during first 6 h in response to microbe infection. The level of Crustin mRNA began to restore at 72 h post-challenge. This indicated that Crustin gene might play an important role when shrimps are infected by bacterial pathogen.     

鳜(Siniperca chuatsi)生长激素基因克隆和原核表达

采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从鳜脑垂体总RNA中扩增生长激素(GH)成熟肽基因,将成熟生长激素的cDNA定向克隆到表达载体pET-32a(+),并转入大肠杆菌BL21(DE3)中。结果表明,鳜生长激素(GH)基因含开放阅读框(ORF)615个核苷酸,编码204个氨基酸,蛋白分子量为23kDa,等电点为7.07,其中酸性氨基酸占10.78%,碱性氨基酸占12.74%,疏水氨基酸为占44.12%,极性氨基酸占32.35%。在IPTG终浓度1.0mmol/L、温度37℃和培养时间4h的最佳诱导表达条件下,鳜生长激素基因(GH)在大肠杆菌中获得高效表达,重组菌体裂解物经SDS-PAGE可检测到分子量约为43kDa的鳜生长激素与硫氧还蛋白(Thioredoxni,Trx)融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白58%。Western印迹分析也证实含6×His标签的重组融合蛋白能够很好地与抗6×His单抗发生反应。本研究为下一步鳜生长激素基因(GH)的生物学功能及应用奠定了基础。     

Protective immunity of orange-spotted grouper(Epinephelus coioids) against a nervous necrosis virus isolated from China,and determination of the complete sequences of the virus

1 IntroductionNervous necrosis virus( NNV) is one of theworldwide pathogens in cultured species and breed-ing from the late 1980s (Bovo et al.,1999; Tan etal., 2001; Breuil et al., 2001; Munday et al.,2002; Lin et al., 2001). The virus is isometric andnon…     

副溶血弧菌一种糖蛋白酶(复苏促进因子)在大肠杆菌中的表达及性质

用PCR方法从副溶血弧菌8621.4基因组中扩增出1种细胞复苏促进因子家族的糖蛋白酶(Glycoprotease,Gcp)基因,核酸序列分析表明其含有完整的gcp基因开放阅读框,编码233个氨基酸组成的蛋白质.核酸序列与副溶血弧菌糖蛋白酶家族基因的序列相似性为100％.其氨基酸序列与哈维氏弧菌HY01、弧菌Ex25、溶珊瑚弧菌、拟态弧菌和杀鲑弧菌LFI1238等糖蛋白酶的序列相似性为67％～92％.将该基因克隆到表达载体pET28a,在大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达,用Ni琼脂糖亲和柱层析纯化的蛋白为单一条带,利用纯化的Gcp免疫新西兰大白兔制备特异性抗体,Western-Blotting分析发现正常生长及活的非可培养状态(VBNC)诱导过程中的副溶血弧菌细胞内表达的Gcp蛋白为1条带,分子量约为27 kDa,而在VBNC状态的菌体中检测到2条蛋白带.研究结果为进一步探索海洋弧菌活VBNC的形成和复苏机制奠定基础.     

大黄鱼(Larimichthys crocea)IGF-Ⅰ基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR和RACE技术克隆了大黄鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)cDNA的全序列,序列全长2027bp,由57bp的5’非翻译区、1409bp的3’非翻译区和561bp的开放阅读框组成。序列分析表明,大黄鱼IGF-Ⅰ编码区包括信号肽、成熟肽(B、C、A、D)和E等6个区域的186个氨基酸,形成成熟肽时,信号肽和E区被切除,成熟肽分子量7.5kDa,等电点(pI)为7.76,成熟肽的B区和A区有6个保守的半胱氨酸残基,形成3对二硫键,起到了稳定IGF-Ⅰ三维结构的作用。与其它物种的IGF-Ⅰ比对后发现A、B区域比较保守,C、D区域保守性较差;E区域的分析结果表明,大黄鱼IGF-ⅠcDNA序列为Ea-4亚型。核苷酸同源性分析发现,大黄鱼IGF-ⅠcDNA与美国红鱼同源性最高,为99.47%;与斜带石斑鱼、金头鲷和褐牙鲆的同源性依次降低,分别为97.68%、97.50%和95.90%。