环介导恒温扩增技术快速检测米氏凯伦藻方法的建立

米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi,Hansen)属于裸甲藻目(Gymnodiniales),裸甲藻科(Gymnodi-niaceae),凯伦藻属(Karenia)。它能产生溶血性(hemolytic)毒素和鱼毒(ichthyotoxins),溶解鱼类细胞,破坏鱼鳃组织结构,使鱼类无法正常呼吸而窒息死亡[1]。近年来,米氏凯伦藻引起的赤潮在世界各海域屡次发生,日本海域,墨西哥湾,新西兰、韩国、苏格兰和澳大利亚海域都有米氏凯伦藻引发赤潮的报道,对渔业造成很大损失[2]。     

米氏凯伦藻的研究进展

<正>米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)常见于温带和热带浅海水域,是一种典型的鱼毒性赤潮藻。近几年来,米氏凯伦藻与其他藻类多次在渤海引发赤潮,污染面积和次数逐渐增大。作为一种有毒藻类,米氏凯伦藻能分泌溶血性毒素,危害鱼类和无脊椎动物,引起养殖生物死亡,造成渔业经济损失[1],严重破坏了海洋生态系统,甚至通过食物链的传播,威胁到人类的健康。因此,对米氏凯伦藻的监测和研究一直是     

2012年三沙湾米氏凯伦藻赤潮的生态特征及成因分析

为了理清米氏凯伦藻赤潮形成与环境因素的关系,掌握其发生、发展规律,本文分析了2012年春末夏初三沙湾海域米氏凯伦藻赤潮期间的气象、水文和营养盐情况,并结合室内模拟培养实验,探讨了米氏凯伦藻赤潮形成与各环境因素的相关性。结果显示米氏凯伦藻赤潮通常发生在温度为20.5~25.0℃和盐度为24.3~32.3的海域,其细胞生长的最适温度和最适盐度分别为:22.0~25.0℃和26.0~30.0;Pearson相关性分析显示,米氏凯伦藻细胞密度与叶绿素a、无机磷、化学需氧量呈极显著正相关,与透明度、氨氮呈显著负相关;另外,米氏凯伦藻对磷酸盐的需求较低,其赤潮的形成可能主要受水体中氨氮的影响。基于现场调查和模拟实验结果,综合分析认为稳定的水文和气象条件、发生前期降雨输入的无机氮,以及由于持续阴雨导致的较低光照条件是此次米氏凯伦藻赤潮形成和维持的重要条件。     

米氏凯伦藻(Km02)共培养细菌群落的研究

米氏凯伦藻作为我国沿岸典型的有毒赤潮甲藻,近年来赤潮频度越来越密,赤潮规模越来越大,持续时间也越来越长,造成了严重的经济损失,并且威胁到海洋生态系统的健康。众多研究表明藻际细菌可能是影响赤潮生消与有毒藻产毒的关键生物影响因子。为揭示米氏凯伦藻共培养菌群的物种多样性信息,本文通过高通量测序技术手段,分析了我国沿岸产米氏凯伦藻(Km02)共培养菌群的种类、丰度、多样性及系统发育信息。结果显示,米氏凯伦藻(Km02)共培养菌群共有40个种与已有数据库匹配,隶属于4个门(Phylum),11个纲(Class),21个目(Order),26个科(Family),37个属(Genus)。其中优势菌属有8个(5%),分别为Balneola(20.28%)、 Marinobacter(19.25%)、Rhodobacteraceae科下的未知属(13.15%)、Alteromonas (8.88%)、Methylophaga (8.17%)、Thalassospira(6.24%)、Reichenbachiella (5.92%)及Mesoflavibacter (5.41%)。研究结果表明我国沿岸产米氏凯伦藻(Km02)含有生物多样性较高的共培养菌群,且具有探寻未知海洋细菌的潜力,同时该研究结果也为未来更进一步研究细菌群落对米氏凯伦藻赤潮暴发与消亡,以及产毒特性等机制的研究提供了实验方法与奠定了理论基础。     

米氏凯伦藻细胞表面膜蛋白质组及其对温度变化的响应研究

米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)近年在我国福建、浙江和广东沿海经常形成赤潮,其赤潮不仅影响到海洋生态系统的稳定,也严重威胁到水产养殖以及人类生命健康安全。本论文以米氏凯伦藻为研究对象,建立了米氏凯伦藻细胞表面膜蛋白质荧光标记技术和细胞膜蛋白质提取方法,运用荧光差异凝胶电泳技术(2-DDIGE)对膜蛋白质进行了分析,并研究了米氏凯伦藻的膜蛋白质组及其对环境温度变动的响应。实验共鉴定到44个细胞表面膜蛋白,其中有效注释27个,主要为转运蛋白、HSP70蛋白家族和捕光蛋白等。米氏凯伦藻在20°C条件下的细胞生长和光合作用要明显好于16°C和12°C,但16°C和12°C条件下的差别不大,表明低温限制了米氏凯伦藻的生长。当米氏凯伦藻从12°C快速转移至16°C和20°C时,藻细胞密度和光合作用效率短时间迅速降低,但细胞很快即适应温度变化。细胞膜上的转运蛋白和光合作用蛋白在其适应温度变化中起着重要作用。     

中国南海四种凯伦藻种间作用与溶血活性初步研究

凯伦藻属种类广布于世界沿海海域甚至大洋,属广域分布种。该属下多个种类曾在全球近岸海域暴发有毒有害赤潮,造成巨大的经济损失,其中不乏由多种凯伦藻同时混合形成赤潮的现象存在。在2016年香港海域的一次凯伦藻赤潮中,本团队从赤潮海水中分离出了米氏凯伦藻（Karenia mikimotoi）、长沟凯伦藻（K.longicanalis）、鞍形凯伦藻（K.selliformis）和蝶形凯伦藻（K.papilionacea）4种凯伦藻。本研究以此4种凯伦藻进行单种藻及多种藻混合样品的培养和溶血活性研究,以探究复合型凯伦藻的种间作用及溶血活性。结果表明,4种凯伦藻间存在种间相互作用,长沟凯伦藻会促进蝶形凯伦藻的生长,鞍形凯伦藻和米氏凯伦藻会抑制长沟凯伦藻生长。4种凯伦藻对兔血红细胞均有明显溶血活性,长沟凯伦藻溶血活性最强为46.36%±1.02%。每种凯伦藻与其他凯伦藻混合培养3天后,对兔血的溶血活性会明显增加,其中含4种凯伦藻的混合组溶血活性最高,为57.05%±1.13%。     

陆源DON亲水和疏水组分对米氏凯伦藻和中肋骨条藻生长及种间竞争的影响

本文以米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)和中肋骨条藻(Skeletonema costatum)为研究对象,采用畜禽养殖源有机质为DON氮源,应用XAD-8树脂分离亲水性和疏水性组分,并进行单一藻和双藻混合DON加富室内受控培养实验。结果表明,亲水性DON组分和疏水性DON组分均可促进米氏凯伦藻和中肋骨条藻的生长,其中,亲水组分的促进作用优于疏水组分(P<0.05,α=0.05)。在溶解无机氮浓度不受限条件下,通过DON加富培养,中肋骨条藻相对于米氏凯伦藻具有竞争优势,表现为氮营养盐吸收速率常数、氮亲和力指数和浮游植物生长速率常数均大于米氏凯伦藻(P<0.05,α=0.05),这可能与米氏凯伦藻在吸收利用DON过程中,需要分泌更多的亮氨酸氨肽酶以提高其营养供应策略有关,而中肋骨条藻则可以在较低的酶活性下吸收利用不同形态和组成的氮。本文研究结果有助于从动力学上加深不同DON组分对长江口赤潮多发区中肋骨条藻赤潮爆发支撑作用的理解。     

不同磷源对米氏凯伦藻生长和碱性磷酸酶活性的影响

为了解米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)赤潮形成的磷营养机理,作者研究了不同磷源[三磷酸腺苷二钠盐(Adenosine disodium triphosphate,ATP)、甘油磷酸钠(sodium glycerophosphate,G-P)、卵磷脂(lecthin,LEC)和Na H2PO4·2H2O]对其生长和藻细胞碱性磷酸酶活性(alkaline phosphatase activity,APA)的影响。结果表明:(1)米氏凯伦藻可以有效利用无机磷(Na H2PO4·2H2O),对有机磷源如三磷酸腺苷二钠盐(ATP)、甘油磷酸钠(G-P)也能有效利用,但不能有效利用卵磷脂(LEC);(2)米氏凯伦藻碱性磷酸酶的检测中,在起始阶段,不同磷源(ATP,G-P,LEC和Na H2PO4·2H2O)的米氏凯伦藻APA达到最大值,米氏凯伦藻的APA分别为6.0,10.5,8.0和0.4 pmol/(个·h)。随培养时间的持续,各有机磷培养基中米氏凯伦藻的APA均表现出先逐渐减小,而后增强,最后在最大值维持的趋势,而以Na H2PO4·2H2O为磷源的米氏凯伦藻的APA没有明显的增加;(3)单个细胞的米氏凯伦藻的APA位点分布明显,大致位于细胞表面。通过研究发现,米氏凯伦藻在外界环境无机磷限制的条件下,能够较好地吸收利用有机磷维持生长,印证了近年来米氏凯伦藻赤潮频繁地发生在磷限制海域的事实。     

四种海洋藻华甲藻与红色赤潮藻的化学互感作用(allelopathy)初步研究

化学互感作用或化感作用(allelopathy)在浮游植物的种群相互作用及动力学过程中起着重要的调节控制作用,已经成为有害藻华生态学研究中的重要领域。但在被研究的种类和化感作用的规律等方面还存在众多空白。本研究选取分离自中国和美国近海的重要藻华甲藻多环旋沟藻(Cochlodinium polykrikoides)、米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)、剧毒卡尔藻(Karlodinium veneficum)、短沟别什莱藻(Biecheleria brevisulcate),在相同的试验条件下(72 h共培养)观察其与另一种常见的藻华甲藻红色赤潮藻(Akashiwo sanguinea)的化感作用。实验结果显示化感效应随种类和特别是起始细胞密度比率而分别表现为抑制或促进共存种的生长。与起始细胞密度为500个/m L的红色赤潮藻共培养时,多环旋沟藻起始密度为250个/m L时促进红色赤潮藻生长,米氏凯伦藻苏澳株和短沟别什莱藻在细胞密度低于1 000个/m L时促进红色赤潮藻生长,同时起始密度为5 000~50 000个/m L的剧毒卡尔藻被红色赤潮藻促进生长。但是,米氏凯伦藻深圳湾株在细胞密度500个/m L以上时均抑制红色赤潮藻生长,多环旋沟藻在起始密度大于250个/m L时开始抑制红色赤潮藻生长,且抑制效应在起始密度2 500个/m L时接近100%。米氏凯伦藻的化感作用在不同株系间表现出显著差异。结果说明有害藻华甲藻之间的化感作用表现出复杂的形式,随着作用的种类和互相之间的密度比率变化而有互相促进、抑制或一方抑制(或促进)另一方等作用,这对进一步认识藻华甲藻的种群动力学具有重要意义。     

基于水质浮标在线监测的米氏凯伦藻赤潮过程及环境因子变化特征分析

相较于船舶走航监测, 海洋水质浮标在线监测的优势在于能够获取目标海域长期、连续监测数据, 能更好地反映环境状况的动态变化。为了厘清米氏凯伦藻赤潮的发生、发展动态, 本文以2017年6月南麂附近海域米氏凯伦藻赤潮为例, 分析海洋水质浮标获取的连续监测数据, 探讨米氏凯伦藻赤潮过程叶绿素a和水环境因子动态变化特征及其与气象要素的关系。赤潮期间, 水温为22.8~26.0℃、盐度为28.8‰~31.8‰、气温为20.4~27.3℃, 该温盐范围均适宜米氏凯伦藻的细胞生长; 较高的光照强度能够支持较高的藻类细胞密度。Pearson相关性分析显示, 米氏凯伦藻细胞密度与叶绿素a浓度呈显著正相关; 溶解氧(DO)及其饱和度(DO%)、pH、水温、气温等环境因子与叶绿素a浓度呈极显著正相关, 盐度与叶绿素a浓度呈极显著负相关。向岸风生海流有利于藻种向近岸较高营养区域汇集, 为赤潮的爆发创造有利条件。赤潮过程中, 叶绿素a浓度、溶解氧饱和度、pH发生了协同变化, 据此特征可以开展赤潮短期预警。     

流式影像仪在东海海域甲藻藻华研究中的应用

有害藻华对海水养殖、人类健康和生态安全构成威胁,已成为全球性的生态灾害.近20年来,米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)、东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)等甲藻形成的有害藻华在东海海域连年暴发,其频率高、危害大,形成及演变机理复杂,对藻华原因种进行监测是开展有害藻华预警和防控的...     

海水酸化对米氏凯伦藻和盐生杜氏藻种群增长和种间竞争的影响

大气中CO_2浓度升高导致的海水酸化改变了海洋生物赖以生存的化学环境,将对其生长、繁殖和代谢产生深远影响。本研究采用实验生态学的方法,以米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)和盐生杜氏藻(Dunaliella salina)为研究对象,探究在海水酸化条件下两种微藻种群增长和种间竞争关系的变化。结果发现:(1)在单培养体系中,随着二氧化碳浓度升高,米氏凯伦藻的环境负载能力(K)升高,而对其生长率进入拐点的时间(T_p)、内禀增长率(r)、进入指数增长期(T_(Ep))和静止期的时间(T_(Sp))均无显著性影响;对盐生杜氏藻而言,二氧化碳浓度升高显著降低了盐生杜氏藻的T_p和r值,而对其K、T_(Ep)、T_(Sp)均无显著性影响;(2)在共培养体系中,两种微藻的K值均受到显著抑制,与单培养体系相比差异显著(P0.05);二氧化碳升高改变了两种微藻的竞争关系,微藻之间的竞争表现为向有利于米氏凯伦藻的方向发展。(3)米氏凯伦藻去藻过滤液对盐生杜氏藻产生抑制作用,二氧化碳浓度升高加剧了这种抑制作用。     

中国沿海球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)的分类、分布及其藻华

球形棕囊藻(Phaeocystis globosa Scherffel)是全球海洋广泛分布的有害藻华种类。1997年10月,中国东南沿海首次暴发了此种藻类的大规模藻华,其后陆续在福建、广东、广西、海南、河北及天津等省市沿海暴发多起同种藻华。中国近海的球形棕囊藻藻华呈现两大独有的特点,即藻类囊体较大(可达3厘米),以及藻华可毒害养殖业。历经20多年,球形棕囊藻在中国沿海已从一个"藻华新记录种"变成了"藻华常见种"。值得注意的是, 2014年以来,广西北部湾海域棕囊藻藻华肆虐,威胁核电冷源安全,受到了社会高度关注,也对球形棕囊藻藻华的研究提出了新的挑战与要求。针对这一生态灾害的最新发展趋势,本文总结了20年来中国球形棕囊藻及其藻华灾害的发生与发展状况,分别就棕囊藻的分类、生活史特征、营养特性、藻华形成的环境驱动因素、生态毒理等诸多方面开展简要综述,冀望为棕囊藻藻华的研究及防治提供基础资料及思路。     

改性黏土法消除球形棕囊藻赤潮的现场实验与效果评估

球形棕囊藻是一种具有复杂异型生活史的有毒有害赤潮生物,近年来在我国近海频繁暴发成灾,形成的巨大囊体为国内外罕见。迄今还未见到有效消除囊体型球形棕囊藻赤潮的方法报道。本文通过海上围隔实验和现场赤潮消除工程跟踪监测,考察了喷洒改性黏土消除囊体型球形棕囊藻赤潮的可行性与效率,并分析了改性黏土法治理赤潮时对水体及沉积环境的可能影响。围隔实验结果表明,喷洒改性黏土可以有效消除水体中过量的微藻细胞,其中以少量多次喷洒方法的效果最好,生物量(chl a)去除率90%。在对2016年2月广西防城港附近海域球形棕囊藻赤潮消除时的跟踪监测结果表明,改性黏土法适用于工程化消除赤潮作业,能够快速消除水体中的大量球形棕囊藻囊体,随改性黏土絮凝体沉入海底的赤潮藻可以快速分解而失去活性。喷洒改性黏土对于赤潮水体的主要理化指标影响不显著,所监测的水体COD、pH和不同形态氮、磷、硅等生源要素浓度都在原有水质水平范围内波动。     

Development of taxonomic rRNA-targeted probes of two harmful algae: Prorocentrum minimum and Karenia mikimotoi by fluorescence in situ hybridization

Harmful algal blooms recently have been under the spotlight throughout the world, because of their negative impact on the marine environment, aquaculture, fisheries as well as public health. The development of methods for rapid and precise identification and quantification of causative species is essential for the warning and monitoring of blooms, among which the techniques based on taxonomic probes are the most favored. In this study, two harmful algae, i.e., Prorocentrum minimum and Karenia mikimotoi were taken into consideration. The partial large subunit rDNA (D1-D2) of both species were firstly PCR-amplified, cloned and sequenced. The obtained sequences were then introduced to carry out alignment analysis for gene specific regions. Three respective candidate probes for each species were designed and used to screen the optimal probe by performing fluorescence in situ hybridization (FISH) tests. The results showed that the probes Pmin0443 and Kmik0602 displayed the best hybridization for P. minimum and K. mikimotoi, respectively. Both the specific (taxonomic) (Pmin0443 and Kmik0602) and the control probes (UniC0512 and UniR0499) were used for cross-reactivity tests with other microalgae in our laboratory. The probes Pmin0443 and Kmik0602 are specific and could be served as taxonomic probes introduced into the techniques targeting rRNA, such as FISH, sandwich hybridization, and DNA-microarray assay of P. minimum and K. mikimotoi in the future. Finally, FISH analyses with both probes were performed on the simulated field samples. The probes could hybridize exclusively with the target cells well, and no significant difference (p >0.05) was observed in the cell densities of the samples determined by FISH and light microscopy (LM). All suggest that the probes are specific and could be introduced into FISH for the monitoring of both harmful algae.     

大鹏湾夜光藻种群的季节变化和分布特征

于１９９０年３月－１９９２年６月对中国南海大鹏湾盐田附近海域的夜光藻种群动态及时空分布进行了综合调查，结果表明，夜光藻种群的出现期间一般为每年的１－６月，最早是１９９１年的１２月，娄量高峰期为３－５月，种群密度的波动极为显著；调查期间共发生８次赤潮，且都发生在３月初至５月初；大鹏湾夜光藻赤潮的发生特点是，赤潮的发生和消失突然，持续时间短，一般不超过３ｄ。     

中国新记录定鞭藻物种冠状棕囊藻的遗传进化分析

棕囊藻属(Phaeocystis)分类学上位于定鞭藻门(Haptophyta)定鞭藻纲(Haptophyceae)棕囊藻目(Phaeocystales)棕囊藻科(Phaeocystaceae)。迄今在我国海域仅分离鉴定到一种棕囊藻属物种,即自1997年以来在我国海域频繁形成有害藻华的球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)。作者从中国南海分离到一个单细胞鞭毛类株系CNS01077,结合形态特征观察及基于18S rDNA序列的系统发育分析,将其鉴定为冠状棕囊藻(Phaeocystis rex)。这是该棕囊藻物种在我国海域的首次报道。该研究构建了该物种的首个叶绿体基因组序列和首个线粒体基因组序列。与球形棕囊藻和南极棕囊藻的细胞器基因组比较分析发现冠状棕囊藻的细胞器基因组发生了显著的结构重排和序列变异。该物种在我国海域的发现及细胞器基因组的构建,将为棕囊藻的生物多样性组成和地理分布研究提供支撑。