细基江蓠及其繁枝变种的RAPD和ITS分析

对细基江蓠及其繁枝变种各12个个体进行随机扩增多态性(RAPD)DNA分析,对比多态位点比例、平均杂合度以及遗传距离,并构建UPGMA聚类图;通过PCR扩增出核糖体RNA基因(rDNA)转录间隔区(ITS),纯化后直接测序,利用生物信息学方法进行序列分析和核苷酸变异研究.比较分析结果表明,细基江蓠的杂合度和多态位点比例均高于细基江蓠繁枝变种,其遗传多样性相对较丰富;实验中8条随机引物扩增出特异的RAPD带,可用做细基江蓠及其繁枝变种的分子鉴定标记;ITS序列在这两种海藻中变异极小;RAPD和ITS聚类分析研究结果表明,细基江蓠及其繁枝变种均聚集为一枝,与同属不同种的龙须菜和真江蓠分开,提示细基江蓠和及其繁枝变种为同一个种,从而在DNA水平上支持了传统形态分类的观点.     

几种江蓠属海藻3个分子序列的系统学分析

分析了我国沿海几种常见的江蓠属(Gracilaria)海藻的18S rRNA 基因、cox2-3间隔区以及RUBISCO间隔区的分子序列,并结合GenBank现有的相关数据进行了分子系统学关系分析,为江蓠属的系统进化和分类地位提供了新的佐证。结果表明,基于cox2-3间隔区、以及 RUBISCO间隔区序列构建的MP (Maximum parsimony)进化树较为相似,而与基于18S rRNA构建的进化树略有不同。这主要是由于18S rRNA更为保守的原因;扁江蓠与脆江蓠在3个系统树中均聚合成支,显示了它们之间具有较近的亲缘关系;龙须菜与江蓠属海藻具有较远的遗传距离,在3个进化树中,龙须菜也均位于进化树的基部,单独成支,证实龙须菜并不隶属于江蓠属,且分化相对较早。     

龙须菜5.8S rRNA和ITS区的克隆与系统学分析

研究青岛产龙须菜居群内的遗传多样性和系统学分类,通过对龙须菜居群内不同个体的5.8S rRNA-ITS区(包括ITS1-5.8S rRNA-ITS2)进行PCR扩增和序列分析,得到扩增DNA片段长度均为1 066 bp,包含完整的ITS1(250 bp)、5.8S(159 bp)和ITS2(657 bp);利用GenBank数据库对Cracilaria(江蓠属)和Gracilariopsis属共20个物种的rRNA-ITS相应序列进行了比较和系统进化分析.结果表明,龙须莱和江蓠科19个物种中rRNA的5.8S区的长度和序列非常保守,而ITS区的长度和序列则变异较大,20种江蓠科物种的遗传距离在0.013～0.596之间,龙须菜在5.8S rRNA-ITS区特性上相比江蓠属物种与Gracilariopsis属物种更为相似;采用UPGMA法构建了这20种江蓠科物种的系统发育树;分析结果表明青岛产龙须菜的居群内不存在遗传差异,且应属于Gracilariopsis属,并且在江蓠科中较早分化,而龙须菜处于Gracilariopsis属中比较古老的位置.     

基于ITS序列分析的赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)分子鉴别

对五株赤潮异弯藻核糖体转录单元内间隔区(ITS区)进行了PCR扩增和序列测定,并结合GenBank中收录的所有赤潮异弯藻ITS序列信息,比较了它们的遗传距离和相似系数,同时结合GenBank中发布的针胞藻纲其他三个属的代表种ITS序列信息,采用邻接法(neighbour-joining,NJ)和最小进化法(minimum evolution,ME)构建系统发育树。结果表明,五株赤潮异弯藻ITS全序列总长度及碱基组成完全一致,均为538 bp,与GenBank中收录的四株赤潮异弯藻仅有一个碱基不同,遗传距离和相似系数分别为0.002和0.980,而与其他赤潮异弯藻ITS序列完全相同,遗传距离和相似系数分别为0.000和1.000。用两种方法构建的系统发育树结构完全一致,赤潮异弯藻属与海洋卡盾藻属亲缘关系较近,而与另外两属的亲缘关系较远。     

海带孤雌生殖和染色体自然加倍的研究

以野生杂种海带雌配子体为材料,对孤雌生殖和染色体的自然加倍进行了研究.结果表明,来自野生杂种海带的雌配子体并非都能孤雌生殖.孤雌生殖的孢子体大多数均能成熟.成熟的孢子体产生的孢子全部发育成雌配子体,形成雌孢子体.海带孤雌生殖的孢子体,染色体的自然加倍,主要发生在第1、2次细胞分裂时期.研究者认为,海带的孤雌生殖是遗传的,其有关基因与控制染色体自然加倍和雌性的基因是紧密联系在一起的.     

基于18S和ITS-5.8S rDNA基因序列的白色霞水母(Cyanea nozakii)的分子鉴定与检测

采用通用引物PCR扩增法,测定了辽东湾海域的白色霞水母(Cyanea nozakii)螅状体、碟状体及水母体的18S以及ITS-5.8S r DNA序列,同时利用Gene Bank数据库中已有同源序列对其进行序列分析及系统分析。结果显示,白色霞水母3个个体的18S和ITS-5.8S r DNA序列完全一致。白色霞水母样品的ITS-5.8S r DNA序列与Gen Bank中未知真核生物的序列高度相似(≥99%),推测该物种可能是早期发育阶段(卵、浮浪幼虫或碟状体)的白色霞水母样品。霞水母属不同种间18S r DNA序列经比对后同源序列长度为1709bp,多态位点数33个;比对后ITS1同源序列长度为368bp,其中变异位点203个,简约信息位点数178个,单变异位点21个。基于18S r DNA基因序列的霞水母属种内和种间平均遗传距离分别为0、0.008,而基于ITS1序列的霞水母属种内和种间平均遗传距离分别为0.019、0.284。基于ITS1的种间遗传距离是种内遗传距离的15倍,适合于进行物种鉴定。NJ系统树的结果也表明同种的不同个体各自聚枝,其聚类结果大致与形态分类吻合。研究表明,ITS基因片段在霞水母不同种间变异较大,更适于大型水母种类鉴定、检测及属内种间水平的系统进化研究。     

东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)和海洋原甲藻APBM(P.micans APBM)的5.8S rDNA及其转录间隔区(ITS)的克隆和序列分析

对东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)和海洋原甲藻APBM(P．micans APBM)的5.8SrDNA及其转录间隔区(ITS)序列进行了PCR扩增、克隆和序列测定，并分析了甲藻属9株赤潮藻(7株从GenBank获得)的系统进化关系。结果表明，海洋原甲藻APBM的ITS片段(含5.8S区)为631bp，东海原甲藻的(含5.8S区)为552bp；东海原甲藻与从GenBank中获得的微小原甲藻相似程度较高，与甲藻属其他原甲藻相似程度较低；本文研究的海洋原甲藻APBM的ITS序列与其他原甲藻相似程度都较低并且在进化树上距离也较远。用ITS1或．ITS2序列构建的系统树与用ITS 5.8SrDNA序列构建的系统树反映的结果基本一致，5.8S区因过于保守似乎不适于构建系统树反映种下的亲缘关系。     

我国珠母贝属(Pinctada)主要种类亲缘关系的初步分析

采用核糖体DNA内部转录间隔子1(ITS1)序列初步分析了珠母贝属8个种的亲缘关系。结果表明,ITS1长度范围分布在402—474bp之间,大珠母贝的ITS1序列最长,黑珠母贝的最短。作为外群的企鹅珍珠贝ITS1长385bp。系统发育分析表明,所研究种类聚合成3个类群。类群I包括合浦珠母贝Pinctadafucata和覆瓦珠母贝P.imbricata。类群II包括白珠母贝P.albina、黑珠母贝P.nigra、长耳珠母贝P.chemnitzi和射肋珠母贝P.radiata,其中前2个种聚合成1枝,后两个种聚合成另一枝,分别形成两个亚群类群IIA和类群IIB。类群III包括珠母贝P.margaritifera和大珠母贝P.maxima。类群IIA与类群IIB之间、类群III的大珠母贝与珠母贝之间的遗传距离较近(0.080—0.100),类群I与类群II之间遗传距离较远(0.250—0.270),类群III与类群I和类群II之间的遗传距离最大(0.400—0.570)。类群I中我国的P.fucata和澳大利亚的P.imbricata之间遗传距离很小(0.000—0.013),而两者的种内遗传距离分别为0.002—0.013和0.005,种内与种间遗传距离相重叠,表明P.fucata和P.imbricata应为同种。类群IIA的P.albina与P.nigra之间的遗传距离为0.013,可能为两个亚种。类群IIB中的P.radiata与P.chemnitzi之间的遗传距离只有0.005—0.007,而本研究的P.chemnitzi的ITS1序列与GenBank中的P.chemnitzi的ITS1序列高度一致,表明P.radiata的鉴别可能有误。     

三株赤潮硅藻5.8S rDNA及转录间隔区(ITS)的克隆及序列分析

对引发赤潮的3株硅藻——1株尖刺拟菱形藻(Pseudo-nitzshia pungens)和2株中肋骨条藻(Skeletonema costatum)的5.8SrDNA和ITS(internal transcribed spacers)序列进行了PCR扩增、克隆和序列测定,并分析了硅藻门10株赤潮藻(7株从GenBank获得)的系统进化关系.研究结果表明,尖刺拟菱形藻的ITS和5.8SrDNA的长度为693bp,SK-1(分离自东海赤潮暴发区)测序得到715bp,除ITS和5.8SrDNA外,还包含部分18SrDNA和28SrDNA;SK-2(分离自青岛养殖场)的ITS和5.8SrDNA的长度为331bp,尖刺拟菱形藻与从GenBank中获得的2株尖刺拟菱形藻相似程度最高,为100%,与该属的多列拟菱形藻相似程度稍低,为82.9%.SK-2的ITS序列与SK-1的相似程度很低,只有51%,但与拟中肋骨条藻的ITS序列相似程度高,为95.5%.SK-1的ITS序列与拟中肋骨条藻的相似程度也低,为56.7%.系统进化树反映的结果与相似性反映的结果一致.研究的该株尖刺拟菱形藻从根据ITS序列研究的结果与形态鉴定的结果看是一致的;SK-2可能属于拟中肋骨条藻;SK-1比较特殊,有待于用其他的方法进一步研究确定其分类地位.     

2种分子标记应用于澄黄滨珊瑚群体遗传多样性研究中的可行性

利用PCR技术对澄黄滨珊瑚的2种分子标记（线粒体细胞色素氧化酶亚基1基因COI和核糖体RNA内转录间隔区基因ITS）进行测序,探讨COI序列和ITS序列在澄黄滨珊瑚（Porites lutea）群体研究中的适用性,并从中选出最适合研究澄黄滨珊瑚群体遗传多样性的分子标记．结果显示COI序列变异位点少,成对序列差异在群体内、群体间都很小,不适于澄黄滨珊瑚的群体研究;而ITS区序列个体内成对的序列差异仅为0．35％,可以作为研究澄黄滨珊瑚群体遗传多样性的分子标记;通过对ITS1、ITS2、5．8SrRNA、ITS1＋ITS2及ITS区序列的比较,认为ITS1＋ITS2序列是最适合研究澄黄滨珊瑚群体遗传多样性的分子标记．本研究为以后研究我国沿岸造礁石珊瑚澄黄滨珊瑚的群体遗传结构提供方法依据,从而为保护管理扣恢复受损珊瑚礁生态系统提供遗传学数据支持．     

Stage-V copepodites of Calanus sinicus and Calanus jashnovi (Copepoda: Calanoida) in mesopelagic zone of Sagami Bay as identified with genetic markers, with special reference to their vertical distribution

We applied genetic makers to identify Calanus species occurring in Sagami Bay, Japan, in order to investigate their vertical distribution in the upper 1000 m. First, interspecific genetic distances of three gene loci, mitochondrial small ribosomal RNA (srRNA), nuclear internal transcribed spacers 1 (ITS1) and 2 (ITS2), were estimated from morphologically distinguishable adult females of Calanus sinicus, Calanus jashnovi and Calanus pacificus that were collected from Sagami Bay, the Kuroshio Extension and the Oyashio region, respectively. The highest levels of interspecific genetic distance were observed in srRNA, followed by ITS1 and ITS2. The intraspecific genetic distances within C. sinicus were much lower than the interspecific genetic distances, indicating that DNA sequences in these loci are consistent with the morphological differences. This information was used as a criterion for species identification based on DNA sequence variation, and allowed us to identify the fifth copepodites (CVs) or younger stages of these species. Next, the vertical distribution of Calanus species was investigated in Sagami Bay in May 2006, on the basis of a stratified sampling in the upper 1000 m. By applying the genetic markers, 23 individuals comprising all copepodite stages were allocated into either C. sinicus or C. jashnovi, and the small- and large-sized CVs were identified as C. sinicus and C. jashnovi, respectively. The total abundance of C. sinicus was highest at 0-50 m and decreased with depth. On the contrary, CV individuals of C. sinicus were abundant not only in 0-50 m but also below 200 m with minimum occurrences in 150-200 m depth. C. jashnovi was much less abundant than C. sinicus and comprised of only CIV and CV which occurred in the upper 100 m and deeper than 50 m depths, respectively. The abundance of C. sinicus in the 1000-m water column of Sagami Bay was at a level comparable to that in shelf waters, suggesting the importance of off-shelf individuals in the biological production and organic transport in the respective areas.     

基于线粒体COI基因序列的中国鲷科鱼类系统进化关系

采用PCR特异性扩增了采集于中国沿海的鲷科5属11种鱼类的线粒体COI基因序列,并结合Gen Bank已有的同源序列,对中国鲷科6属12种鱼类的分子系统进化关系进行研究。结果表明,中国鲷科6属12种鱼类的COI基因序列的平均碱基组成为T 30.4%、C 27.7%、A 23.5%、G 18.4%;属间Kimura双参数平均遗传距离为9.5%—19.7%,种间平均遗传距离为2.2%—21.8%,其中四长棘鲷属、赤鲷属和犁齿鲷属间的遗传距离(8.2%—13.8%)接近于棘鲷属多数种间遗传距离(6.5%—12.2%);分子系统树显示中国鲷科鱼类分为两大类群,类群I包括四长棘鲷属、犁齿鲷属、赤鲷属、牙鲷属等红体色种类,类群Ⅱ含平鲷属、棘鲷属等银灰体色种类,其中棘鲷属的冲绳棘鲷和黄鳍棘鲷先聚为姐妹群,澳洲棘鲷、黑棘鲷、灰鳍棘鲷和台湾棘鲷聚为另一支。本文结合已有研究结果得出:中国鲷科鱼类属间是先按体色、后按牙齿分化的,四长棘鲷属、犁齿鲷属和赤鲷属有相当密切的亲缘关系;中国棘鲷属是一个有共同祖先的单系群,属内存在两个平行进化的分支,两分支的种间关系具有明显的分化。     

基于16S rRNA基因的三种枝吻纽虫系统发育关系分析

测定了湛江枝吻纽虫（Dendrorhynchus zhanjiangensis）、中华枝吻纽虫（Dendrorhynchus sinensis）及疣多枝吻纽虫（Polydendrorhynchus papillaris）线粒体16S rRNA基因部分片段序列,结合从GenBank下载的其他纽虫序列,对它们之间的系统发育关系进行了分析.26个中华枝吻纽虫个体共检测到长度为467-468 bp的9个单倍型,5个湛江枝吻纽虫个体的长度均为469 bp,共检测到3个单倍型,2个疣多枝吻纽虫个体的长度均为474 bp,共享1个单倍型;核苷酸序列A、T、G、C的含量相似,碱基组成均表现出AT含量偏倚,即AT含量明显高于GC含量.中华枝吻纽虫9个单倍型之间的遗传距离和湛江枝吻纽虫3个单倍型之间的遗传距离均为0.002 1-0.004 3;而3种枝吻纽虫16S rRNA基因序列彼此之间的遗传距离却均超过0.24,显示它们之间的遗传差异特别大,分子系统树（NJ）的拓扑结构也显示,3种枝吻纽虫没有聚成1支,而是各自成支,结果支持3种枝吻纽虫分别为独立有效物种.中华枝吻纽虫与2种脑纹纽虫（Cerebratulus lacteus、C.marginatus）的遗传距离分别为0.154、0.169,明显低于与其同属的湛江枝吻纽虫的遗传距离（0.242）,表明中华枝吻纽虫与前两者的亲缘关系相对较近,而与后者的亲缘关系相对较远;在NJ树上,中华枝吻纽虫没有与湛江中华枝吻纽虫聚为1支,而是其9个单倍型聚为1支后,与2种脑纹纽虫（C.lacteus、C.marginatus）聚为1支,且有高达94%的支持率,这表明枝吻纽虫属（Dendrorhynchus）并非单系,也提示将中华枝吻纽虫划入脑纹纽虫属（Cerebratulus）会更合适.     

利用rDNA和ITS序列对1株裸甲藻的初步鉴定

测定了 1株分离自青岛胶州湾海水样品、从形态上初步确定为裸甲藻属 (Gymnodiniumsp,编号为 GYN- 1 5)的核糖体基因 (r DNA)和转录单元内间隔区 (Internal Transcribed Spacer,ITS)序列 ,并利用该序列对该藻进行了初步鉴定。测定的序列长 2 658bp,涵盖了小亚基 (smallsubunit,SSU) r DNA基因 3'端 1 747bp,ITS1 - 5.8S r DNA- ITS2全长和大亚基 (large subunit,LSU) r DNA基因 5'端 337bp。同源性分析该序列发现 GYN- 1 5与共生甲藻属 (Symbiodinium)中的 2个种 (Symbiodinium californium和 Gymnodinium varians)的对应序列具有很高的相似性 ;3株藻的各段 r DNA和 ITS序列的相似性均为 99%以上 ;以 SSU r DNA序列中的 3个可变区 (V1 V2 V3)和邻接法构建的系统树表明 ,GYN- 1 5与 S.californium和 G.varians构成 1个独立的新的子类群 ,该子类群属于共生甲藻属 ,而与各种裸甲藻的亲缘关系较远。根据这些结果可将GYN- 1 5初步鉴定为属于共生甲藻属。鉴于 GYN- 1 5和其它 2个种所构成的分支明显与 5个已知的子类群 (A,B,C,D,E)不同 ,因此将该分支命名为子类群 F。     

On four closely related hypotrichous ciliates (Protozoa, Ciliophora, Spirotrichea): molecular characters, interspecific relationships and phylogeny defined with multigene sequence information

In order to clarify the phylogeny and relationships of the most confused hypotrichous ciliates, Holosticha-complex, four closely related holostichids (five populations), Holosticha bradburyae, H. diademata, Anteholosticha sp., and A. manca, were compared and analyzed using ITS2 secondary structures, ITS1-5.8S-ITS2 region and SSrRNA gene sequences. The ITS1-5.8S-ITS2 region sequences of these four species were first sequenced, and they shared sequence identities ranging from 68.0% to 90.1%, while two populations of Anteholosticha sp. differed in three nucleotides (sequence identity 99.8%). There were several minor differences among ITS2 secondary structures of these species, while two populations of Anteholosticha sp. had the identical secondary structure. Phylogenetic trees inferred from the ITS1-5.8S-ITS2 region sequences of stichotrichs using multiple algorithms (Neighbor-Joining, Maximum Parsimony and Bayesian) revealed similar topologies. The results show that:(1) Holosticha bradburyae and H. diademata firmly clustered together with strong bootstrap supports, forming a sister clade with Anteholosticha sp., (2) Anteholosticha appeared to be a paraphyletic assemblage, in which the morphotype A. manca was more closely related to Diaxonella trimarginata than to its congener Anteholosticha sp. Phylogenetic analyses based on the SSrRNA gene and the combined sequences of SSrRNA gene and ITS1-5.8S-ITS2 region revealed the similar relationships between Holosticha and Anteholosticha, nevertheless their positions within the subclass Stichotrichia differed from each other inferred from different genes.