长牡蛎(Crassostrea gigas)两个Dmrt家族基因的时空表达

本文以长牡蛎27个幼虫发育阶段个体以及成体的5个组织织作为实验材料,采用实时荧光定量PCR技术对其Dmrt家族中的2个基因(CgDsx和CgDmrtA2)的表达模式以及在性别决定中的作用进行了研究。结果表明,长牡蛎CgDsx基因在胚胎发育初期有大量表达,从囊胚期到担轮幼虫初期表达量最高,之后表达量开始降低,在D形幼虫后一直维持在极低的表达水平,此后仅在成体的雄性性腺中具有高度表达。由此可见,CgDsx可能也对早期胚胎发育起一定调控作用,同时参与了性别决定。CgDmrtA2在长牡蛎所有组织中均有表达,各组织间表达差异不显著,在D形幼虫至壳顶后期表达量较高,说明它参与了胚胎中后期的发育过程,可能与神经的形成相关,但是其具体功能还需要进一步研究。     

长牡蛎Fem-1基因cDNA克隆和表达分析

本研究通过RACE技术获得了长牡蛎(Crassostrea gigas)Fem-1b和Fem-1c基因cDNA全长序列,并分析了其编码蛋白和系统进化关系。通过RT-PCR技术对采集的长牡蛎周年样品(2015年5月~2016年4月的性腺样品,2015年夏季各组织样品以及不同胚胎幼虫发育时期的样品)进行了表达分析。研究显示,长牡蛎Fem-1b全长2 580bp,编码636个氨基酸;Fem-1c全长2 417bp,编码622个氨基酸。蛋白结构预测显示,两基因分别含有6和7个典型的锚定蛋白重复序列(Anyrin repeat)。RT-PCR结果显示,目的基因在精巢中的表达量显著高于其他组织(P0.05);Fem-1b在6、7月的精巢中和Fem-1c基因在3、4月的精巢中的表达量显著高于在其他组织中的表达量(P0.05)。胚胎幼虫表达分析显示,目的基因在胚胎发育早期的表达量显著高于胚胎发育中后期,并在囊胚期达到最高值。我们推测Fem-1b和Fem-1c可能参与了性别决定和性别分化的过程。     

栉孔扇贝胚胎和幼虫中的17β-HSD8表达分析

17β-羟类固醇脱氢酶8(17β-HSD8)广泛分布在脊椎动物体内的多种组织中,调节类固醇激素代谢和脂肪酸代谢。本文采用荧光定量RT-PCR和原位杂交技术,对栉孔扇贝胚胎和幼虫中17β-HSD8mRNA的时空表达进行了分析。研究结果表明,栉孔扇贝17β-HSD8在未受精卵中高水平表达,受精卵和卵裂期胚胎中表达量显著下降,囊胚中的表达量显著提高。提示栉孔扇贝17β-HSD8是一个母源表达的基因,其合子基因在囊胚时期开始表达。原位杂交结果显示,17β-HSD8mRNA阳性信号在各发育阶段的胚胎和担轮幼虫中均匀分布,在D形幼虫中主要定位在内脏团附近,提示17β-HSD8可能参与起始器官发生。     

长牡蛎(Crassostrea gigas)Wnt4基因cDNA克隆与表达分析

Wnt4作为Wnt基因家族的重要成员,在动物的生长发育过程中起重要调控作用。本文利用RACE技术克隆了长牡蛎Wnt4基因c DNA全长序列,该序列全长1999bp,开放阅读框为1068bp,编码355个氨基酸,该蛋白序列与人(Homo sapiens)、沙蚕(Platynereis dumerilii)和栉孔扇贝(Chlamys farreri)Wnt4蛋白的相似性分别为44%、48%和46%。通过荧光定量RT-PCR分析长牡蛎Wnt4基因在成体不同组织和不同发育阶段的表达情况,发现长牡蛎的Wnt4基因具有广泛的组织表达特点,在所检测的多种组织中(外套膜、鳃、唇瓣、消化腺、雄性性腺、雌性性腺)均有表达,推测长牡蛎的Wnt4以信号分子的形式参与多种组织细胞的生命过程;长牡蛎个体发育过程中Wnt4基因的高表达主要集中在胚胎发育的早期(桑葚期最高,原肠胚期次之),幼贝期该基因的表达量很低,说明Wnt4基因可能在早期发育阶段参与了某些器官的形成。     

栉孔扇贝骨形态发生蛋白Ⅰ型受体基因的克隆及表达分析

首次在栉孔扇贝(Chlamys farreri)中克隆了骨形态发生蛋白I型受体(Bone morphogenetic protein type Ⅰ receptor,cfBMPR1)基因cDNA全长序列,该基因开放阅读框长1560bp,编码为519个氨基酸。实时荧光定量反转录PCR(real-time qRT-PCR)分析结果显示,cfBMPR1基因在栉孔扇贝受精卵、4细胞期、囊胚、原肠胚、担轮幼虫期、D型幼虫期和壳顶幼虫期等发育时期均有表达,其中胚胎时期表达量高于幼虫期,提示该基因在扇贝早期发育及幼虫形态形成过程中的重要作用;在成体组织,包括外套膜、鳃、性腺、肾、横纹肌和消化腺中也均检测到了cfBMPR1的表达,其中以性腺和横纹肌中表达量最高,暗示其参与了扇贝包括繁殖和肌肉生长发育等在内的多种生物学过程。研究结果为进一步研究TGF-β信号通路在扇贝生长发育中的功能提供了基础数据。     

长牡蛎dpp同源基因的克隆及其在贝壳发生中的功能研究

dpp是转化生长因子β家族的重要成员,在胚胎发育中作为形态发生子参与体轴形成及附肢发育等过程。为了研究牡蛎dpp同源基因在贝壳发生中的作用,揭示贝壳发生的分子机理,作者克隆了一种长牡蛎(Crassostrea gigas)的dpp基因,命名为cgdpp。序列和进化分析显示,cgdpp分子中不同位点的氨基酸残基变异程度不同。作者用整装原位杂交的手段研究了dpp同源基因在长牡蛎早期发育中的表达情况。结果表明,dpp同源基因参与了从贝壳形成区开始分化到早期贝壳形成的全过程。在担轮幼虫(Trochophore)中,dpp同源基因似乎调控了贝壳的形状与扩张速度;在早期D形幼虫中,dpp同源基因表达量突然下降至痕量水平,并与贝壳发育区无明显的关联,提示dpp同源基因可能仅仅参与了贝壳的发生,不参与其进一步的发育过程。     

虾夷扇贝Smad基因家族的鉴定及表达分析

Smad基因介导的细胞信号在调节动物发育和细胞干性方面起着至关重要的作用。由于其功能的多样性和重要性,Smad基因家族一直受到广泛的研究。然而,双壳贝类Smad基因家族缺乏系统的鉴定和分析。为了理解双壳贝类Smad基因家族的进化和生物学功能,本文在虾夷扇贝基因组鉴定出4个Smad基因,并对其遗传和表达特征进行了分析。时空表达谱显示,Smad3基因在虾夷扇贝受精卵和2~8细胞时期有较高的表达量,而在胚胎及幼虫阶段该基因表达量迅速降低,推测其在胚胎早期细胞分裂和分化过程中发挥重要作用。Smad6在胚胎发育早期表达量较低,在囊胚期及原肠胚时期表达量显著升高,可能与母源调控向合子型调控过渡的“中期囊胚转换”有关。Smads基因在各组织中也呈现了独特的表达模式,其中Smad3、Smad5和Smad6分别在肌肉、血细胞和鳃中表达量最高。而Smad4在各个组织内均有表达且表达量相似。实验结果暗示了Smad基因在虾夷扇贝中不仅参与协调了早期胚胎的发育,也与组织器官的形成和稳态有关。本研究有助于理解贝类Smad基因的进化及功能,为深入研究该基因家族在贝类中的生物学功能和调控机制奠定基础。     

一种酪氨酸酶基因在笠贝初生壳形成中的表达分析

软体动物初生壳形成是贝壳早期发育研究的重要内容。目前,初生壳形成的机制尚不清晰。本文从笠贝(Lottia goshimai)中克隆了一个酪氨酸酶基因(lgo-tyr1),聚类分析表明其与长牡蛎基因cgi-tyr1是直系同源基因。Lgo-TYR1的序列分析显示它具有两个典型的铜离子结合结构域和一个信号肽。通过整装原位杂交和电子扫描显微镜观察,检测到lgo-tyr1在担轮幼虫的圆形贝壳区以及紧邻的环状细胞带中表达,表明lgo-tyr1可能参与了担轮幼虫初生贝壳的生物合成以及贝壳区边界的确立。     

企鹅珍珠贝Dmrt2基因的克隆及表达分析

本研究利用RACE-PCR技术获得企鹅珍珠贝(Pteria penguin)一个Dmrt2基因cDNA的全长序列,通过荧光定量PCR分析Dmrt2基因在各组织中的表达特征,以及在早期卵巢、成熟期卵巢、早期精巢、成熟期精巢和排放期精巢中的表达变化。结果表明,Dmrt2基因全长1 257bp,其中开放阅读框(open reading frame,ORF)为951 bp,编码316个氨基酸,5′非编码区(untranslated region,UTR)为52 bp,3′UTR为254 bp,第20位到第73位氨基酸为DM结构域。预测其分子质量为36.61ku,等电点为9.80。氨基酸序列比对显示该企鹅珍珠贝Dmrt2基因与黑蝶真珠蛤(Pinctada margaritifera)和马氏珠母贝(Pinctada martensii)的Dmrt2基因同源性(identity)最高,分别为46.0%和45.7%。其中在DM结构域高度同源。荧光定量PCR分析组织表达特征显示,Dmrt2在企鹅珍珠贝的外套膜、鳃、消化盲囊、足、精巢和卵巢均有表达,其中在精巢中表达量最高(P0.05),足为其次,在闭壳肌中没有检测到Dmrt2表达。对性腺发育不同时期的表达量分析发现,Dmrt2在发育早期和成熟期卵巢中表达量都很低,在发育早期精巢中表达量较高,在成熟期精巢检测到最大表达量(P0.05),到精巢排放期表达显著下降,推测Dmrt2可能与企鹅珍珠贝精巢的发育有关,可能参与了企鹅珍珠贝雄性性别分化和性腺发育这一生理过程。     

泥蚶HDAC1基因cDNA全长、内含子克隆及时空表达特征分析

HDAC1作为HDACs家族中重要成员,可使组蛋白去乙酰化进而调节基因表达,在细胞分化和胚胎早期发育中起重要作用。本文利用SMART RACE技术克隆得到泥蚶HDAC1(Tg-HDAC1)基因的cDNA全长序列,并对其内含子进行扩增及不同组织、不同发育时期的定量表达。结果发现:Tg-HDAC1基因的cDNA序列全长为2275 bp,开放阅读框(ORF)1587 bp,编码528个氨基酸;Tg-HDAC1蛋白序列与斑马鱼、鸡、小鼠等的相似性都在80%以上,表明该蛋白氨基酸序列在物种进化过程中具有保守性;在Tg-HDAC1基因中扩增出13个内含子,均存在于开放阅读框中,且都遵循GT-AG原则;荧光定量PCR(qRT-PCR)分析结果显示,Tg-HDAC1基因在成体血液、内脏团、外套膜、鳃、斧足和闭壳肌6个组织中均有表达,而在足中的表达量最高,且与其余5组织中的表达量有极显著差异(P<0.01),说明它对该组织生长具有重要作用。不同发育时期的表达差异结果表明,Tg-HDAC1基因在担轮幼虫期表达量最高,显著高于其他发育时期(P<0.05)。     

黄条鰤MSTN基因的克隆及其在早期发育中的表达特征

为解析肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因在黄条鰤(Seriola aureovittata)生长发育过程中作用机制。本研究采用cDNA末端快速扩增法,克隆了黄条鰤MSTN基因的全长cDNA序列,采用荧光定量PCR(RT-qPCR)技术对MSTN mRNA在黄条鰤不同组织、胚胎发育过程以及仔稚幼鱼发育过程中的差异表达特征进行了研究。序列分析结果显示,MSTN基因全长cDNA为1828 bp,开放阅读框为1131 bp,编码了376个氨基酸。RT-qPCR分析表明,在检测的脑、垂体、肝脏、肌肉、脾脏、肾脏、鳃、心脏、胃、肠、头肾组织中MSTN mRNA均有表达,其在肌肉中表达量最高(P<0.05)。MSTN mRNA在胚体下包2/3时期至孵化期表达量显著升高,且在孵化期达到峰值(P<0.05)。MSTN mRNA在孵化后3天前表达量显著升高(P<0.05),在第20天降低至较低水平,25天后表达量再次显著升高,在第30天达到峰值(P<0.05)。研究结果首次揭示了MSTN基因在黄条鰤的胚胎及早期生长发育过程中发挥着重要作用,本研究为开展黄条鰤繁养殖、育种提供了理论参考。     

大菱鲆2种类胰岛素样生长因子结合蛋白基因克隆及在成鱼和早期发育期中的表达

类胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)在调节IGF的生物学功能上起着重要的作用,利用简并引物扩增及RACE克隆技术,首次克隆得到大菱鲆IGFBP-1,-2基因cDNA全长序列。两个基因氨基酸序列都分为保守的N端和C端以及高度特异的L区域3个部分,其中N端和C端共包含18个半胱氨酸残基,N端存在一段保守的(GCGCCXXC)结构,C端存在一段保守的(CWCV)结构,这些结构在与IGF相互作用以及调节与IGF结合的亲和性和稳定性起重要作用。组织表达分析表明,igfbp-1主要在肝脏及脾中大量表达,在其他组织中表达量较少,igfbp-2除在肌肉中没有检测到表达外,在其他组织中均有表达,其中肝脏脑、心、肾、肠中表达量较高。广泛的组织表达模式表明IGFBP是通过自分泌和旁分泌来调节IGF的功能。对于胚胎发育期表达分析表明,igfbp-1在整个发育期均检测到表达,igfbp-2在胚体期开始有表达,结果表明igfbp-1和igfbp-2在胚胎发育过程中的细胞生长以及组织器官分化都起着重要的生理学作用。     

黄鳍棘鲷IGF-2基因克隆及IGF-1/2在胚胎发育过程中的表达特性分析

类胰岛素样生长因子（Insulin-like Growth Factors,IGFs）是生物生长轴下游的关键调控因子,其对促进细胞分化与机体生长具有重要的作用。为深入研究IGF-1和IGF-2基因在黄鳍棘鲷（Acanthopagrus latus）胚胎发育过程中表达机制及可能发挥的作用,本文利用分子克隆技术分离鉴定了黄鳍棘鲷IGF-2基因cDNA序列,并对其进行了生物信息学分析。同时,在对其胚胎发育过程连续观察的基础上,利用实时荧光定量PCR的方法,测定并分析了黄鳍棘鲷胚胎发育不同时期IGF-1和IGF-2基因m RNA的表达情况。实验结果表明,IGF-2基因cDNA序列全长为1 736 bp,其中开放阅读框648 bp,共编码215个氨基酸。多重序列比对分析发现,黄鳍棘鲷IGF-2氨基酸序列与同属鲷科鱼类的大西洋鲷（Sparus aurata）相似性为99.95%,与三长棘赤鲷（Pagrus auriga）相似性为98.14%,与其他硬骨鱼类的IGF-2也有较高的相似性,显示出IGF-2在硬骨鱼类进化关系上的保守性。在水温为（26.5±0.5）℃,p H为8.0和盐度为28的条件下,...     

黄条(鰤)(Seriola aureovittata)MyHC基因克隆及其在早期发育阶段表达研究

为解析肌球蛋白重链(MyHC)基因在黄条鰤(Seriola aureovittata)生长发育过程中作用机制,本研究采用RACE技术,克隆了黄条鰤MyHC基因全长cDNA序列,采用荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对MyHC在黄条鰤不同组织、胚胎发育过程以及仔稚幼鱼发育过程中的表达特征进行了研究。结果表明:黄条鰤MyHC基因全长为6143bp,开放阅读框为5811bp,编码了1936个氨基酸,由3个保守结构域组成即MYSc-classⅡ、Myosin taill和SH3;系统进化树分析显示黄条鰤MyHC与高体鰤进化关系最近。qRT-PCR分析发现黄条鰤MyHC在各组织中均有表达,但在肌肉中表达量最高(P0.05);随着黄条鰤胚胎发育的进行,MyHC在16细胞期之前表达量较高,在胚体下包2/3时期表达量显著升高,且在孵化期达到峰值(P0.05:);在仔稚幼鱼发育阶段,MyHC在孵化后20d后表达量显著升高,30d表达水平达到峰值(P0.05),随后的35d到40d表达水平略有下降但仍保持较高表达趋势,黄条鰤MyHC表达具有发育阶段表达的特异性。MyHC表达特征揭示其参与了调控黄条鰤的早期生长发育。     

眼斑双锯鱼(Amphiprion ocellaris)发育中体色花纹时序发生的色素细胞变化和控制基因表达的分析I.胚胎时期

眼斑双锯鱼(Amphiprion ocellaris)属于鲈形目、雀鲷科、双锯鱼属, 是热带珊瑚礁观赏鱼类的首选品种。不同体色和花纹与色素细胞相关基因的表达直接相关, 在其胚胎发育的过程中, 色素细胞的形态和数量一直在变化, 但不同发育时期各种色素细胞的动态变化及其控制基因表达情况等仍需明确研究。记录了眼斑双锯鱼胚胎时期色素细胞变化较为明显的6个发育时期, 观察了不同时期的体色及色素细胞的变化特点, 并利用荧光定量PCR检测了各发育时期的10个体色控制基因的表达情况。结果显示: 在胚胎发育阶段, 整个胚胎的颜色从橙黄逐渐转变为暗红、黑红、黑色到最终透明, 观察到卵黄囊表面幼体黑色素细胞到成体黑色素细胞的转变过程, 鱼体表面在翻转期出现成体黑色素细胞、在器官形成期出现红色素细胞, 眼睛及腹部在孵化期出现虹彩色素细胞。结合荧光定量PCR结果分析发现: 卵黄囊表面幼体黑色素细胞推测是外胚层中的神经嵴细胞直接发育而成, 不需要迁移过程; Ednrb、TYR、Tbx2b基因对幼体黑色素细胞的形成和发育有重要作用, Pax3、Dct、Aim1基因与成体黑色素细胞的分化、迁移、形成过程密切相关; 其中TYR基因的相对表达量在体节期出现显著增加, 说明TYR基因在胚胎发育初期就参与黑色素细胞的形成; Tbx2b基因不仅对黑色素细胞形成有影响, 对眼斑双锯鱼心脏的形成也有一定作用; Fms基因对红色素细胞形成有重要作用; Ltk基因的表达要早于虹彩色素细胞的出现; 相关性分析发现各基因之间存在相互作用。     

文蛤亮氨酸氨肽酶LAP3的基因克隆及其在幼体不同发育时期、成体不同组织的表达分析

为探索贝类LAP3基因的结构和功能特征以及在生长发育过程中的作用,利用cDNA末端快速扩增（RACE）法获得文蛤LAP3（Mm-LAP3）基因的cDNA全长序列,并对其生物信息学、组织及发育时期表达特征进行了分析。结果显示,Mm-LAP3基因cDNA全长2 037 bp,ORF区1 254 bp,编码417个氨基酸;Mm-LAP3蛋白由Peptidase_M17超家族序列的N-端结构域和Peptidase_M17催化结构域组成。荧光实时定量PCR结果表明,Mm-LAP3基因在文蛤成体6个组织和幼体10个发育时期中均有表达,其中在斧足中的表达量显著高于其他组织（P<0.05）,这与斧足蛋白含量丰富、代谢旺盛相关;在幼体10个发育时期中的表达量呈现逐渐升高的趋势,在D形幼虫时期达到最高,随后又有所降低,推测Mm-LAP3基因在早期发育时期参与了某些组织器官的形成。     

长牡蛎两种engrailed同源基因的鉴定及其与贝壳发育相关性的研究

engrailed基因属于同源异形基因家族成员,在许多动物的分节、附肢发育、神经系统发育和贝壳形成过程中发挥作用。本研究克隆了长牡蛎两个engrailed同源基因,命名为cgi-eng1和cgi-eng2。序列分析表明,两个基因均具备典型engrailed基因保守的5个EH结构域。利用整装原位杂交技术检测了cgi-eng1和cgi-eng2在贝壳形成的关键时期早期D形幼虫时期的表达情况。结果显示,cgi-eng1和cgi-eng2 m RNA高表达于贝壳外缘,可能与早期贝壳形成过程有关。此外,两个基因的在贝壳外缘的表达模式亦有区别,提示两个基因的功能可能存在一定程度的分化。本研究首次系统鉴定了长牡蛎engrailed基因的成员,并发现它们可能均参与幼虫贝壳形成,研究结果有助于加深对贝类早期发育及贝壳形成的理解。     

双锯鱼(Amphiprion)胚胎不同发育阶段和成鱼不同组织中内参基因的筛选及应用

双锯鱼(Amphiprion)亦称为海葵鱼,又称为小丑鱼,是一类经济价值较高的海水观赏鱼。目前国内在双锯鱼的胚胎发育、人工饲养以及形态学观察等方面已经取得了有效成果,但在分子生物学水平上对其基因表达的研究较少。为了筛选出适用于双锯鱼胚胎不同发育阶段以及成鱼组织的内参基因,分析酪氨酸酶(TYR)基因的表达情况,以眼斑双锯鱼(A.ocellaris)和白条双锯鱼(A.frenatus)为材料,利用实时定量聚合酶链式反应(qPCR)对18SrRNA、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因)、Ef-1α(转录延伸因子基因)和β-actin(β-肌动蛋白基因)这4个候选内参基因的表达水平进行检测,同时通过geNorm和Norm Finder软件对其稳定性进行评估,最后以合适的内参基因作为参考,研究TYR mRNA的表达水平。结果表明,在双锯鱼胚胎的不同发育阶段,18S和β-actin的表达量相对于其他基因较为稳定;在双锯鱼的不同组织中,稳定性依次为18S>β-actin>Ef-1α>GAPDH。以18S作为内参基因时分析发现TYR基因的表达在双锯鱼胚胎发育过程中呈先上升后下降的趋势,在体节期表达量最高;在双锯鱼各组织中均有表达,且在眼、尾和红皮中表达量最高。