栉孔扇贝、虾夷扇贝及其杂交子代线粒体COI和Cytb基因遗传多样性分析

为了解栉孔扇贝(Chlamys farreri)、虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)及其杂交子代(F1)的种群遗传多样性和遗传结构,对3个群体的线粒体COI和Cytb基因的部分序列进行了扩增和分析。经比对分别获得781bp和725bp核苷酸片段,74个样本共检测到47个单倍型;F1群体的单倍型数、单倍型多样性指数、核苷酸多样性及平均核苷酸差异数都是最高的,而双亲的较低;F1和栉孔扇贝间的遗传距离最小,其次为栉孔扇贝和虾夷扇贝群体之间,F1和虾夷扇贝群体之间的遗传距离最大;F1和栉孔扇贝之间的遗传分化系数较小而两者间的基因流比较大,F1和栉孔扇贝与虾夷扇贝之间的遗传分化系数较大而基因流较小,说明栉孔扇贝和虾夷扇贝群体群体很早就发生了遗传分化;采用UPGMA法和简化的中介网络法构建的系统树表明,3个群体的所有个体被分为2个族群,栉孔扇贝和F1交叉聚为一类,虾夷扇贝独自聚为一类,2个分支间没有交叉;使用特异性引物分别对3个群体进行PCR扩增检验,结果栉孔扇贝的特异引物能在杂交子代中扩增,而虾夷扇贝的特异引物不能在子代中扩增出条带,说明栉孔扇贝和虾夷扇贝杂交,其子代的线粒体遗传模式为严格的母系遗传。本研究结果表明杂种优势的形成与线粒体遗传多样性的变化有关。     

4种养殖扇贝的群体遗传多样性及特异性AFLP标记研究

应用AFLP技术对我国4种主要养殖扇贝进行了遗传分析.虾夷扇贝、海湾扇贝、华贵栉孔扇贝、栉孔扇贝4种养殖扇贝群体中,种内遗传相似度依次分别为0.841 5,0.786 3,0.719 0和0.673 1,香侬氏指数分别为43.52,58.87,80.16和92.83,栉孔扇贝和华贵栉孔扇贝的遗传多样性水平明显高于海湾扇贝和虾夷扇贝;AFLP标记共享位点分布表明,在4种扇贝中栉孔扇贝与华贵栉孔扇贝之间的共享位点最多,同时4种扇贝的种间遗传相似度也以栉孔扇贝和华贵栉孔扇贝之间为最高(0.769 5),海湾扇贝和虾夷扇贝之间为最低(0.662 6),揭示所研究的几种扇贝中栉孔扇贝和华贵栉孔扇贝的遗传关系最近(遗传距离为0.262 1);找到了21个种内特异性AFLP标记和种间共享标记,可用于种质鉴定和分子辅助分类.     

虾夷扇贝性腺和闭壳肌蛋白质双向电泳分析

本研究建立了虾夷扇贝性腺、闭壳肌蛋白质双向电泳体系,比较分析了不同等电聚焦时间对虾夷扇贝性腺、闭壳肌蛋白质双向电泳结果的影响,进一步利用该双向电泳系统分离了性腺和闭壳肌可溶性全蛋白,并利用计算机图像分析软件对虾夷扇贝性腺和闭壳肌蛋白质双向电泳图谱进行了检测分析。实验结果表明,采用细胞超声破碎-丙酮沉淀除盐–50 mmol/L Tris-HCl(pH6.8)复溶,1000V,3 h等电聚焦,12%SDS-PAGE和高灵敏度银氨染色,可获得分辨率较高、重复性良好的双向电泳图谱。通过PDQuest8.0图像分析软件检测分析,发现pH5~8条件下,虾夷扇贝性腺和闭壳肌组织的蛋白质主要分布于pH5~7,相对分子质量97~20.1 ku范围,性腺组织双向电泳图谱检出的蛋白质斑点数为265个,闭壳肌组织检出161个蛋白质斑点。结果显示,虾夷扇贝性腺、闭壳肌可溶性蛋白质表达谱各具特点,性腺组织可溶性蛋白种类较闭壳肌组织丰富。本研究实验结果可为进一步研究扇贝蛋白质组学以及功能基因组学奠定一定的基础。     

栉孔扇贝与虾夷扇贝杂交生产性育苗技术的研究

本文以栉孔扇贝♀与虾夷扇贝♂为试验材料,进行二者之间杂交育苗生产,并与栉孔扇贝自交生产比较,生产结果表明:二者的杂交是可行的,在幼虫阶段表现出一定的生长优势,幼虫成活率间没有差异,但在幼虫附着变态方面,杂交组低于自交组,二者之间有明显的差异。然后以具有生长优势的栉孔扇贝♀×虾夷扇贝♂组进行了生产性育苗实验,取得明显的经济效益。     

应用酵母双杂交系统筛选虾夷扇贝FOXL2的相互作用蛋白

FOXL2是脊椎动物的雌性决定基因,在多种无脊椎动物中也被认为是雌性决定与分化的关键基因,但其在无脊椎动物中的作用机制目前尚不清晰。本文利用Clontech酵母双杂交系统筛查虾夷扇贝FOXL2的相互作用蛋白。研究首先构建诱饵质粒pGBKT7-FOXL2,并检测诱饵蛋白的毒性及自激活活性,结果显示诱饵蛋白对酵母菌株无毒,也无自激活活性。利用该诱饵质粒,本研究从虾夷扇贝酵母双杂交cDNA文库筛选得到17个阳性克隆,测序验证得到12个读码框正确的阳性克隆,它们来自4种蛋白:COP9信号复合体亚基5、钠/钾ATP酶β3、哺乳动物室管膜相关蛋白1和胰脂肪酶相关蛋白2。研究进一步将诱饵质粒与4种蛋白的猎物质粒进行共转化验证,结果均为阳性,表明这4种蛋白与虾夷扇贝FOXL2都可能存在相互作用。本文为研究FOXL2在无脊椎动物性别决定与分化中的作用提供了参考。     

栉孔扇贝NDPK 基因的BAC-FISH 定位研究

栉孔扇贝(Chlamys farreri)是我国北部沿海一个非常重要的养殖种类。核苷二磷酸激酶(NDPK)是一类广泛存在、高度保守,在细胞能量和信息传递中具有重要作用的酶。作者利用BAC-FISH技术将两个包含栉孔扇贝NDPK基因的BAC克隆定位到染色体同一位置上,该结果验证了物理图谱相关contig组装的可靠性,同时NDPK基因的染色体定位将对深入研究该基因的结构、功能以及应用于生产实践提供理论支撑。本研究结果将对栉孔扇贝染色体的深入研究以及染色体鉴别、图谱整合等工作提供重要参考。     

控制虾夷扇贝闭壳肌积累类胡萝卜素相关基因的筛查

利用抑制性差减杂交技术(Suppression subtractive hybridization,SSH)对虾夷扇贝闭壳肌积累类胡萝卜素相关基因进行筛查和分析。以虾夷扇贝橘红色闭壳肌和白色闭壳肌cDNA构建正反向差减文库,结合454测序技术在正向差减文库中测序得到2 640条序列,拼接得到50个contigs(重叠群);反向差减文库中测序得到2 496条序列,拼接得到187个contigs。经过同源性比对分析,共获得150多个差异表达基因,从中选择3种清道夫受体SRB1、SRF2和SRCR作为候选基因进行研究,对其在虾夷扇贝各组织中的表达量水平进行检测,初步阐述了其在虾夷扇贝中的组织表达规律。根据结果推测在虾夷扇贝橘红色闭壳肌中,清道夫受体有可能是调节类胡萝卜素累积和转运的关键基因。本研究为虾夷扇贝闭壳肌类胡萝卜素累积相关通路的探索提供了初步研究的基础数据。     

栉孔扇贝氨基酸组份与含量的比较研究

本文指出栉孔扇贝干贝氨基酸含量较高,次于虾夷扇贝,高于海湾扇贝。其氨基酸的含量与个体大小成反比。在软体部中以闭壳肌的氨基酸含量最高:闭壳肌的平滑肌的氨基酸含量高于横纹肌。从分析栉孔扇贝的17种氨基酸中以谷氨酸含量最高。栉孔扇贝外套膜和内脏块均含有相当量的氨基酸,可加以利用     

虾夷扇贝不同性别类型2 个Dmrt基因DM 结构域分析

为探讨虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)性别决定和雌雄同体形成的分子机制,利用兼并引物,以闭壳肌基因组DNA为实验材料,扩增和克隆了虾夷扇贝Dmrt基因的DM结构域,雌性、雄性和雌雄同体3种性别共获得2个具有不同DM序列的克隆,序列长度均为141bp,分别命名为Py Dmrt3和Py Dmrt4。Py Dmrt3在3种性别类型中均有克隆,而雄性中还克隆出Py Dmrt4。结果表明,在虾夷扇贝不同性别中,Dmrt基因家族的成员可能会有不同;雄性py Dmrt3的DM结构域核苷酸和氨基酸变异频率高,其次是雌雄同体,雌性的较保守,与其他软体动物DM结构域比对,该基因家族在进化上仍然高度保守,由此推测,部分雄性可能是发生了性逆转的雌雄同体,这种较高的变异性可能也是雌雄同体的一个特点,Py Dmrt4可能参与调控雄性性别的形成。     

应用MSAP技术研究扇贝全基因组DNA甲基化水平

DNA甲基化作为真核生物基因组重要的表观遗传学修饰,对生物体基因的表达有重要的调控作用。为获得扇贝基因组DNA甲基化修饰水平及模式等表观遗传学信息,以栉孔扇贝(Chlamys farreri)、海湾扇贝(Argopecten irradians)、虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)以及本课题组培育的"海大金贝"为材料,建立了甲基化敏感扩增多态性方法(Methylation-sensitive amplified polymorphism,MSAP)的反应体系,利用该方法对其基因组DNA CCGG区域的甲基化水平进行分析。结果表明,本研究筛选得到的引物组合可用于贝类DNA甲基化的研究,在栉孔扇贝、海湾扇贝、普通虾夷扇贝和"海大金贝"的甲基化比例分别为32.08%、25.99%、32.88%和34.97%。几种扇贝基因组CCGG序列中,胞嘧啶的全甲基化率要高于半甲基化率,推测扇贝基因组中主要的甲基化模式是CpG型。通过对"海大金贝"和普通虾夷扇贝闭壳肌甲基化谱进行比较,筛查得到46个差异位点,这些位点可能参与"海大金贝"闭壳肌积累类胡萝卜素的调控。     

三种扇贝挥发性风味物质指纹图谱分析

为探究海湾扇贝(Argopecten irradians)、栉孔扇贝(Chlamys farreri)、虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)三种扇贝闭壳肌的挥发性风味物质差异,采用气相色谱-离子迁移谱(gas chromatography-ion mobility spectroscopy,GC-IMS)技术,对三种扇贝闭壳肌在新鲜(40℃)和加热(100℃)情况下进行挥发性成分分析。结果表明:在新鲜状态下,海湾扇贝(HWSB-F)、栉孔扇贝(ZKSB-F)、虾夷扇贝(XYSB-F)闭壳肌中,共定性出27种挥发性风味物质,其中醛类8种,醇类5种,酮类5种,酯类3种,以及醚类、苯类、酸类、烯类和噻唑等。在加热情况下,海湾扇贝(HWSB-C)、栉孔扇贝(ZKSB-C)、虾夷扇贝(XYSB-C)闭壳肌中共定性出52种挥发性风味物质,其中醛类20种,酯类5种,酮类7种,醇类8种,烯类4种,酸类2种,醚类2种,还包括吡嗪、胺类、苯类、含氧杂环等物质。对三种扇贝闭壳肌新鲜组和加热组指纹图谱进行分析,发现新鲜扇贝原有的挥发性风味物质加热后减少,且产生了新的其他种类的挥发性风味物质。扇贝闭壳肌加热组的挥发性风味物质种类较多,组成比较复杂,新鲜组的扇贝闭壳肌挥发性风味物质种类较少,组成简单。通过主成分分析,可在新鲜状态和加热状态下,有效区分三种扇贝闭壳肌组织。三种扇贝闭壳肌挥发性风味物质指纹图谱的建立,丰富了不同扇贝呈味物质的组成成分研究内容,证明GC-IMS技术可快速鉴别三种去壳扇贝闭壳肌的种类,为不同种扇贝闭壳肌以次充好提供检测依据。     

中国北方沿海3种养殖扇贝碳、氮稳定同位素的组成特征

应用元素分析和稳定同位素质谱联用技术(EA-IRMS)对中国北方不同养殖地区的虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)、栉孔扇贝(Chlamys farreri)和海湾扇贝(Argopecten irradians)闭壳肌的碳、氮稳定同位素进行了测定,分析3种养殖扇贝的碳、氮稳定同位素组成特征。结果显示,青岛和獐子岛虾夷扇贝闭壳肌的?13C和?15N均差异性显著,长岛和旅顺栉孔扇贝闭壳肌的?15N差异性显著,莱州、牟平和旅顺海湾扇贝闭壳肌的?13C和?15N均差异性显著。闭壳肌的碳、氮稳定同位素组成能有效区分不同产地来源的3种养殖扇贝。     

使用多普勒超声成像比较栉孔扇贝与虾夷扇贝循环生理特征

将先进的多普勒超声成像技术运用于栉孔扇贝(Chlamys farreri)和虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)循环生理学的研究中,首次量化了扇贝心率(HR)、血流加速度(ABF)、收缩峰值速度(PS)、舒张末期速度(ED)、血液最大瞬时血流量(Max-IBF)、血液最小瞬时流量(Min-IBF)、收缩期与舒张期流速比(S/D)和阻力指数(RI)等指标,对比了两种不同耐温性扇贝的循环生理指标差异。结果表明,两种扇贝HR、ABF、PS、ED、Max-IBF、Min-IBF与水温均呈正相关;在10—25°C间,栉孔扇贝和虾夷扇贝HR范围分别为16—39、14—31次/min,ABF范围分别为1.75—15.84、0.99—7.41cm/s2,PS范围分别为3.54—8.09、2.32—8.85cm/s,ED范围分别为1.51—3.15、1.09—4.23cm/s,Max—IBF范围分别为0.051—0.193、0.137—0.316m L/s、Min—IBF范围分别为0.025—0.072、0.022—0.131m L/s、RI范围分别为0.49—0.69、0.42—0.54,S/D范围为2.28—2.83、1.75—2.12。同一温度下栉孔扇贝的HR、ABF、PS、ED指标水平均高于虾夷扇贝,Max-IBF、Min-IBF水平均低于虾夷扇贝;两种扇贝RI和S/D指标均在一定范围内波动。研究显示,虾夷扇贝在较低的心脏和血流搏动节律下保持了高效的血液流通,从而以相对较少的能量消耗维持了其机体代谢对血液循环的需求,这也与其冷水性的生态习性相适应。     

雌性虾夷扇贝与雄性栉孔扇贝杂交子代及其亲本的核型研究

采用滴片法制片-吉姆萨染色对雌性虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)与雄性栉孔扇贝(Chla-mysfarreri)杂交子代及其双亲的核型进行了研究,报道了在扇贝杂交过程中产生的特殊的细胞遗传学现象,结果表明,栉孔扇贝染色体核型2n=38=6m+10sm+22st;虾夷扇贝染色体核型2n=38=6m+10sm+16st+6t;两者杂交子代染色体数目2n=38,但其染色体组型不符合预期型,不是简单地由两个亲本各自一套染色体组型组合而成,呈现出复杂的形态多态性,端部着丝点染色体明显增多.     

海洋贝类功能基因的研究进展

本世纪初人类基因组序列图谱的完成从分子水平上揭示了DNA内部结构和遗传机制的本质,极大地推动了生命科学的发展,同时也使人们意识到基因资源的巨大科研和商业价值.在此后的10年间,基因组测序及分析技术取得了一系列重大突破,大量模式生物基因组数据库相继发布,生物信息量呈爆发式增长.在海洋贝类方面,有太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)全基因组序列图谱的完成[1]、文蛤(Meretrix meretrix)[2]和虾夷扇贝(Patinopecten yes-soensis)[3]转录组以及虾夷扇贝[4]、文蛤[5]、泥蚶(Tegillarca granosa)[6]、 缢蛏(Sinonovacula constricta)[7]等多种贝类eDNA文库的成功构建等.     

虾夷扇贝育苗适温问题的初步探讨

虾夷扇贝(Pecten yessoensis)属冷水性海产贝类,其生长最适水温为5—20℃,正常活动的温度上限为23℃,下限为0℃,主要产于日本北部沿岸及朝鲜北部日本海侧,为日本第二大养殖贝类。日本自六十年代中期开展人工养殖以来,扇贝产量迅速上升,从1967年的8000多吨上升至1980年的12—13万吨,占世界扇贝年产量的1/4左右,其中养殖产量约占总产量的2/3。 近年来,我国在发展栉孔扇贝(Chlamys for reri)人工增养殖的同时,辽宁和山东两省又先后从日本引进虾夷扇贝苗种和成贝,进行了采卵、育苗和     

栉孔扇贝(♀)×虾夷扇贝(♂)子一代杂种优势的SRAP分析

采用新型的分子标记技术(Sequence-related amplified polymorphism,简称SRAP)对栉孔扇贝(Chlamys farreri)(♀)×虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)(♂)子一代及其双亲的遗传变异进行分析.从不同的引物组合中筛选出9对条带清晰、多态性丰富的组合,9对引物共产生了121条扩增带,其中多态性条带107条,平均每对引物组合产生11.89条多态标记.Shannon信息指数I分别为0.299 9、0.218 9、0.334 3,Nei's基因多样性指数h分别是0.196 4、0.141 1、0.218 9,栉孔扇贝与杂交后代的遗传距离是0.107 4,虾夷扇贝与杂交后代的遗传距离是0.228 7,聚类分析也显示了这一特点.从变异贡献率来看,3个群体的总变异中,有37.31%的变异来源于群体间,62.69%的变异来源于个体间.     

西北太平洋沉积物中细菌多样性的研究

利用提取且纯化的西北太平洋地区深海沉积物DNA为模板,利用细菌通用PCR引物扩增16S rDNA片段,构建其文库,建立阳性克隆子RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)酶切图谱.据酶切图谱选择部分克隆测序,并与数据库中的序列进行比对.结果表明,测序的27个序列分属于4个类群:变形细菌(Proteobacteria)、绿屈挠菌(Chloroflexi)、浮游霉菌(Planctomycetes)和酸杆菌(Acidobacteria);其中以变形细菌最多,占62.96%.     

栉孔扇贝Fosmid文库的构建及基因组结构特征分析

研究构建第一个栉孔扇贝的fosmid基因组文库,该文库包含133 851个克隆,插入片断平均长度为40 kb,覆盖栉孔扇贝基因组的4.3倍.栉孔扇贝DNA在fosmid传代中表现得较为稳定,没有发现插入片段的丢失或重排.所有的克隆进行了超级池和二级池的构建,并筛选了2个基因和7个微卫星,结果阳性克隆数介于2到8之间.由此可见,该文库可以很好的用于目的基因或标记的筛选,将有利于物理作图和基因的图位克隆研究.2 016个克隆进行双末端测序,获得3 646 条序列.序列总长2 286 986 bp,大约占栉孔扇贝基因组的1.84‰.共得到2 500条串连重复序列,其中微卫星序列371条,小卫星序列1 816条,卫星序列313条.共得到317条散布重复序列,总长97 412 bp,占测序总长的4.26%.查找到的散布重复序列共有4种类型:DNA 转座子、LTR 反转座子、LINE反转座子和滚环转座子,其中LINE反转座子的数目最多.BLAST比对共有1 383条序列与数据库现有的序列有明显的相似性(E＜e-5),占测序总数的37.93%.BLASTN比对有明显相似性的1 036条序列中,与nr数据库序列相似的有113条,与EST数据库序列相似的有923条.BLASTX比对有明显相似性的序列有347条,占序列总数的9.52%.     

几何形态学对8种扇贝的形态分类的应用

几何形态学(morphometrics)是基于笛卡尔地标点的统计分析方法,主要运用广义普鲁克分析(GPA)、薄板样条分析(TPS)、主成分分析(PCA)、典型变量分析(CVA)等方法,定量的对形态变化进行识别,结果更为客观。本研究运用几何形态学方法对8种常见扇贝(栉孔扇贝Azumapecten farreri、虾夷盘扇贝Mizuhopecten yessoensis、海湾扇贝Argopecten irradians、平濑掌扇贝Volachlamys hirasei、北海道扇贝Swiftopecten swiftii、荣套扇贝Gloripallium pallium、华贵类栉孔扇贝Mimachlamys nobilis、美丽环扇贝Annachlamys striatula)间形态关系进行研究,运用界标点和半界标点对扇贝的壳盘和壳耳进行数字化标点,利用PCA、CVA、TPS方法,获得8种扇贝的形态差异并进一步分析,建立系统发育树。PCA和CVA分析结果表明可以通过几何形态测量学分析方法将8种扇贝基于形态差异进行有效区分。此外,结合TPS的分析结果,发现壳耳和壳盘在扇贝中具有种间规律性差异。通过其形态分异进行表型聚类,从结果可知:美丽环扇贝、虾夷盘扇贝和海湾扇贝距离较近,壳型有共同的特征:扇贝壳盘较椭圆,壳耳相对较小;荣套扇贝和华贵类栉孔扇贝距离较近,壳型有共同的特征:扇贝壳盘更扁平,前耳相对较大;北海道扇贝、平濑掌扇贝和栉孔扇贝与其他种类没有交集。在聚类过程中,华贵类栉孔扇贝和荣套扇贝有交集,10个标本混淆,其他标本均成功聚类,正确率为95.5%。