瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)卵黄蛋白原的纯化、性质鉴定及ELISA检测方法的建立

腹腔注射17β-雌二醇(E2),使瓦氏黄颡鱼雄鱼在7天内产生卵黄蛋白原(Vtg)。采用凝胶过滤和离子交换两种层析技术,从E2诱导的雄性瓦氏黄颡鱼血浆中分离、纯化出Vtg,采用糖、磷、脂蛋白染色技术证明分离、纯化的蛋白为Vtg,该Vtg在非变性条件下分子量约为240kDa,在SDS变性条件下分子量约为143kDa。纯化的瓦氏黄颡鱼Vtg经检测显示可能含有类胡萝卜素,但没有二硫键,对热相对稳定。利用纯化的瓦氏黄颡鱼Vtg,制备了兔抗瓦氏黄颡鱼Vtg多克隆抗血清。用双向免疫扩散法测得抗血清的纯度较高,效价为1︰32;Western blotting检测显示抗血清的特异性较好。以瓦氏黄颡鱼Vtg多克隆抗血清为抗体,以纯化的瓦氏黄颡鱼Vtg为抗原,建立了间接酶联免疫吸附反应(ELISA)方法检测瓦氏黄颡鱼体内Vtg的含量,标准曲线线性部分的线性方程为y=0.099x+0.4529(R2=0.9327),该方法检测的灵敏度为15.6ng/ml,工作范围为31.2—4000ng/ml,在此范围内,标准曲线具有良好的线性。     

斑马鱼卵黄原蛋白的纯化鉴定及其2种ELISA的开发

斑马鱼卵黄原蛋白(Vitellogenin,VTG)是检测环境雌激素活性的重要生物标志物。为了确定最佳的斑马鱼VTG检测方法,本研究利用纯化的斑马鱼VTG及其多克隆抗体同时建立了竞争ELISA与夹心ELISA,并比较了2种方法对VTG的敏感度与精确度。采用凝胶过滤与离子交换层析相结合的方法从17β-雌二醇暴露后的斑马鱼整体匀浆液中纯化获得了2种高分子量的糖磷脂蛋白,SDS变性电泳显示分子量为180与143kDa的两条主带,证实纯化的蛋白为斑马鱼VTG。Western blot结果表明制备的抗血清对斑马鱼VTG具有很高的特异性,利用纯化的VTG及其多克隆抗体建立了定量斑马鱼VTG的竞争ELISA和夹心ELISA。与竞争ELISA相比,夹心ELISA不需要抗原抗体共孵育的过程,操作更加省时、简便,其工作范围为3.9~250ng/mL,检出限约为2.2ng/mL,组内与组间变异系数则分别为2.1~5.7和3.0~7.3,表现出更高的敏感度与精确度,推荐该方法用于环境雌激素活性的检测。     

褐牙鲆卵黄原蛋白免疫胶体金技术的开发及其在环境雌激素检测中的应用

为快速检测海洋环境雌激素,本研究利用20 nm胶体金颗粒和褐牙鲆(Paralichthys olivaceus) Vtg单/多克隆抗体开发了夹心法免疫胶体金检测试纸条,并对胶体金标记条件、T线和C线抗体浓度等参数进行了优化,构建了褐牙鲆Vtg的快速检测技术。实验结果表明该胶体金试纸条工作范围为15.7～1 000 ng·mL^-1(R²>0.98),检出限为7.8 ng·mL^-1。本研究制备的胶体金试纸条检出限与目前常用的多种Vtg的ELISA方法相近,但是检测时间仅为15 min,比常规方法节省了约14 h。此外,该试纸条在存放30和90 d后,对Vtg的检测结果并无明显偏差,表现出较好的稳定性和可重复性。最后,通过测定多种常见环境雌激素(双酚A、雌二醇、乙炔雌二醇)暴露对雄性成年褐牙鲆血浆中Vtg的诱导情况,进一步验证了该试纸条在海洋环境雌激素活性检测中的应用。     

金鱼卵黄原蛋白单抗夹心ELISA的开发及其在环境雌激素检测中的应用

利用Western blot和ELISA方法,从实验室现有的斑马鱼(Danio rerio)卵黄脂磷蛋白(Lipovitellin,Lv)单克隆抗体库中筛选出了对金鱼(Carassius auratus)卵黄原蛋白(Vitellogenin,Vtg)具有高特异性、高亲和力的单抗H3A8。以纯化的单抗H3A8、金鱼Lv与HRP标记的Lv多克隆抗体建立了夹心ELISA,其工作范围为15.6~1 000ng·mL-1,检出限为9.6ng·mL-1,组内差异与组间差异分别为1.30%~4.99%和2.30%~4.37%,并且金鱼Vtg与Lv的标准曲线几乎重合,表明建立的夹心ELISA可以准确定量金鱼Vtg,并利用建立的ELISA测定了10、100、1 000ng/L 17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)暴露3和21d后雄性金鱼血浆与体表粘液中的Vtg含量,发现1 000ng·L-1 E2暴露3d、100与1 000ng·L-1 E2暴露21d均能显著升高雄鱼血浆和体表粘液中的Vtg含量,E2暴露21d后雄鱼血浆与体表粘液中的Vtg含量较为接近,建议将取样简便且对鱼体无伤害的体表粘液用作今后金鱼Vtg的检测样品。     

杂色鲍血蓝蛋白多克隆抗体的制备与血蓝蛋白35kDa片段鉴定

以杂色鲍(Haliotis diversicolor Reeve)为研究对象,通过密度梯度离心方法纯化得到高纯度血蓝蛋白,以其作为抗原皮下注射免疫新西兰大白兔,从而获得高效价的兔源多克隆抗血清。进一步通过Protein A抗原亲和纯化的方法对该抗血清纯化,最终获得效价更高、检测特异性更好的血蓝蛋白多克隆抗体。应用该抗体进行Western检测发现,鲍血淋巴中存在着多样的血蓝蛋白衍生产物;进一步结合质谱技术对其中35 kDa条带进行鉴定发现,其来源于血蓝蛋白I型亚基的H结构域。     

Preparation of hemocyanin polyclonal antibody and the identification of 35 kDa hemocyanin fragment in HaHotis diversicolor Reeve

以杂色鲍（Haliotis diversicolor Reeve）为研究对象,通过密度梯度离心方法纯化得到高纯度血蓝蛋白,以其作为抗原皮下注射免疫新西兰大白兔,从而获得高效价的兔源多克隆抗血清。进一步通过ProteinA抗原亲和纯化的方法对该抗血清纯化,最终获得效价更高、检测特异性更好的血蓝蛋白多克隆抗体。应用该抗体进行Western检测发现,鲍血淋巴中存在着多样的血蓝蛋白衍生产物;进一步结合质谱技术对其中35kDa条带进行鉴定发现,其来源于血蓝蛋白I型亚基的H结构域。     

大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)荧光AFLP分析体系的建立及优化

以大泷六线鱼为材料,通过对DNA提取质量和浓度、EcoR Ⅰ/MseⅠ酶切反应时间、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度以及选择性扩增中预扩增产物稀释倍数等关键因素进行研究,建立并优化了大泷六线鱼荧光AFLP分子标记反应体系.用优化的反应体系,筛选到10对适合大泷六线鱼的引物,为今后利用AFLP标记技术进行大泷六线鱼...     

大泷六线鱼人工繁殖及育苗技术初步研究

总结了2009 ～2010年关于大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)人工繁殖及育苗技术的研究结果,论述了大泷六线鱼苗种繁育的关键技术.通过对亲鱼强化培育和促熟,创新发明人工平面授精技术和网箱吊式孵化技术,加强饵料的合理搭配与投喂、水质调控技术等措施,突破了大泷六线鱼人工繁殖的技术难点,明显提高了受精率、孵化率和苗种成活率,解决了人工繁殖大泷六线鱼苗种生产问题.在水温16～ 17℃,盐度31,光照500 ～ 1000 1x的培育条件下,大泷六线鱼鱼苗经过90 ～ 100 d的培育,全长生长至5 ～6cm.2009和2010年分别培育出全长5 cm以上大泷六线鱼鱼苗4.1万尾、11.4万尾,苗种成活率分别达到41.7％、43.2％,在国内首次实现了大泷六线鱼人工规模化繁育.     

环境因子对海州湾及邻近海域大泷六线鱼分布影响的分析

根据2011年在海州湾及其邻近海域进行的5个航次的渔业资源和环境调查数据,分析该海域大泷六线鱼的空间分布特征及其季节变化,运用广义可加模型(GAM)研究时空因子和环境因子对其分布的影响。结果表明:海州湾及其邻近海域的大泷六线鱼主要集中分布于35.0°N~35.6°N,119.6°E~121.2°E海域;7月平均网获质量最高(4 709.19g/h),12月平均网获质量最低(66.92g/h)。大泷六线鱼的空间分布存在明显的季节变化,且主要分布于研究海域的东北部。GAM模型分析表明,底层水温是影响大泷六线鱼空间分布的主要环境因子。模型筛选出的解释变量对大泷六线鱼空间分布的影响从大到小依次为:月份、底层水温、纬度、底层盐度和经度,GAM模型的总偏差解释率为75.32%。     

大菱鲆血清免疫球蛋白IgM的纯化及应用研究

用硫酸铵分级盐析法纯化大菱鲆血清免疫球蛋白IgM,所得产物用Sepharose-4B和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析进一步纯化,以纯化的大菱鲆IgM免疫新西兰大白兔,获得兔抗大菱鲆IgM抗血清.SDS-PAGE电泳显示大菱鲆IgM重链为76 kD,轻链为27 kD;纯化的大菱鲆IgM重链与特异性抗血清具有较好的反应,而轻链与抗血清反应不明显;以制备的兔抗大菱鲆IgM抗血清为二抗建立了大菱鲆血清特异性抗体的间接ELISA检测方法,用该方法检测了鳗弧菌灭活疫苗免疫后大菱鲆产生特异性抗的变化规律,大菱鲆在免疫后第1周就产生了特异性抗体,在3周时达到峰值,该特异性抗体可维持13周以上.     

大泷六线鱼睾酮和雌二醇及其受体在精巢发育中的生理作用

大泷六线鱼主要分布在我国的黄海和渤海水域,是北部海区重要的经济鱼类之一。本文采用免疫组织化学方法和激素放射免疫测定技术,研究了血浆睾酮(T)和雌二醇(E2)含量、雄激素受体(AR)和雌激素受体(ER)在性腺组织中的定位,以及它们与性腺发育周期的关系。结果表明:雄鱼血浆T和E2含量表现明显的季节变动,在繁殖期(11月至翌年1月)内显著上升,T和E2水平分别达到21.26 ng/dL和13.36 pg/mL,在非生殖季节(2～8月)显著下降。ER在精巢间质细胞中表现强阳性反应,AR只在间质细胞中表现中等强度的反应。在恢复期发育的精巢(Ⅲ期),芳香化酶表现出强的免疫阳性反应,特别是在精原细胞和精母细胞中,在成熟精巢中阳性反应减弱,在精子细胞和精子中表现阴性反应。上述研究结果说明,睾酮、雌二醇及芳香化酶参与了大泷六线鱼精巢发育和繁殖内分泌功能调节。     

市政污水厂尾水对文蛤卵黄蛋白原的诱导效应研究

本研究目的是检验市政污水厂尾水排放对海洋双壳类动物文蛤的内分泌干扰效应,判断其血浆中卵黄蛋白原(Vtg)水平作为尾水受纳海域雌激素效应生物标志物可行性。将文蛤在不同浓度的尾水-海水混合液(0%、1%、5%、10%、20%、40%)中持续暴露培养20d,定期测定雄性文蛤血浆中Vtg含量,分析暴露期间Vtg水平随尾水体积比(EVR)和培养时间的变化趋势。结果表明,暴露培养10d后,尾水体积比40%的处理组中雄性文蛤的血浆Vtg含量明显上升(P0.05),随着培养时间延长到15和20d,在较低的EVR(10%、20%)下也能监测到尾水对文蛤Vtg的明显诱导,表明污水处理厂尾水中存在一定数量的内分泌活性物质,对雄性文蛤具有显著类雌激素效应;Vtg最大值出现在EVR20%的尾水暴露15d以及EVR40%的尾水暴露20d,分别比对照组增加45.86%和47.40%。如果采用笼养文蛤监测尾水受纳海域的类雌激素效应,适宜的暴露时间为20d,此时采集的雄性文蛤Vtg可指示较大范围尾水的影响。     

山东俚岛人工鱼礁区大泷六线鱼生长、死亡及资源评价

为研究人工鱼礁区大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)生长、死亡和资源利用,本文根据2012—2015年山东俚岛人工鱼礁区与对照区的地笼与三重刺网调查资料,运用ELEFAN I基于体长频率时间序列分析法、变换体长渔获曲线法、单位补充量等渔获量曲线法和生物学参考点等对其群体结构、生长、死亡、资源现状和资源管理进行初步研究,再运用蒙特卡洛模拟法将不确定性分析引入资源评估。研究表明鱼礁区大泷六线鱼平均体长、平均体重、渐近体长和渐进体重均大于对照区,自然死亡系数小于对照区,即鱼礁区大泷六线鱼个体较大、人工鱼礁对大泷六线鱼确有保护作用。本文首次将生物学参考点F0.1和Fmax及其不确定性分析应用于人工鱼礁区大泷六线鱼资源评估,结果表明3种不确定性水平下F0.1判断结果与无不确定性结果一致(F0.1Fcur),而Fmax随着不确定性水平的增加,可能反转无不确定性的结果(FmaxFcur),即存在误判的风险,故F0.1更适合礁区大泷六线鱼资源评估。结合Gulland理论、生物学参考点和单位补充量渔获量等判断,鱼礁区大泷六线鱼资源处于过度开发状态,应适当降低捕捞强度以保证其持续发展,对照区其资源处于合理开发状态,仍可通过提高捕捞强度来实现资源更为合理地利用。     

大泷六线鱼的营养成分分析

大泷六线鱼（Ｈｅｘａｇｒａｍｍｏｓ　ｏｔａｋｉｉ）俗称黄鱼,隶属鱼由形目,六线鱼亚目,六线鱼科,六线鱼属,具有耐低温、肉质鲜美等特点,颇受消费者青睐。近年来,由于大量捕钓以及大泷六线鱼本身产卵量少等原因导致其天然资源日渐匮乏,人工养殖业应运兴起。但迄今为止,有关大泷六线鱼的基础生物学研究较少,至于营养化学更未见报道。本实验通过对大泷六线鱼营养成分的测定分析,同时比较测定鳚鱼、杜父鱼的营养成分,并对照其他几种常见的养殖鱼类,初步评定其营养价值,为其营养学研究提供基础性资料并期进一步推广发展其养殖事…     

大泷六线鱼全人工繁育技术研究

2012年~2014年,作者在山东省海洋生物研究院鳌山卫中试基地进行了大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)全人工繁育研究,通过人工促熟、激素诱导,培育F1代全人工亲鱼558尾(雄鱼231尾,雌鱼327尾),获得受精卵33.0万粒,孵化F2代仔鱼30.0万尾,受精率98%,孵化率91%。在水温16~17℃、盐度31、p H 7.8~8.1、溶解氧6 mg/L条件下,历时110 d,培育平均全长6.2 cm F2代苗种11.7万尾,苗种成活率39%。作者在国内外首次开展了大泷六线鱼全人工繁育技术研究,丰富了大泷六线鱼养殖基础资料,为大泷六线鱼产业的发展奠定基础。     

渤、黄海大泷六线鱼耳石微化学特征与群体判别

为探究中国近海大泷六线鱼(Hexagrammosotakii)耳石微化学成分特征及群体分化状况,采集了连云港、青岛、威海、烟台、秦皇岛、大连、丹东7个野生群体和1个威海养殖群体的大泷六线鱼样本。利用LA-ICPMS技术测定耳石中的微量元素,以微量元素与钙的比值进行了分析,结果显示大泷六线鱼耳石中, Na/Ca、Sr/Ca、Fe/Ca、Mg/Ca较高,而Mn/Ca、Ba/Ca、Zn/Ca、Li/Ca较低。耳石1龄前元素比值的组间比较(S-N-K检验)结果显示:Na/Ca、Sr/Ca、Fe/Ca在群体间具显著性差异(P<0.05)。耳石边缘区元素与环境中元素比较发现,Li、Mn元素在耳石中富集程度较大,Sr在耳石的中元素含量远远大于水环境中的浓度,说明耳石中的元素沉积与海水中元素并不是简单的线性关系。判别分析结果显示:耳石1龄前元素指纹的判别分析结果表明,大泷六线鱼群体的判别成功率为63.0%,判别正确范围为30.0%～80.0%,耳石边缘区元素的判别正确率为57.1%,判别正确范围20.0%～80.0%,秦皇岛群体有高的判别成功率80.0%。耳石元素指纹可以用于不同大泷六线鱼群体的...     

利用鱼抗血清及鼠抗血清分析鱼肠道弧菌全菌蛋白抗原性

从患腹水症牙鲆脾脏组织中分离得到一株优势菌株CD86,经人工感染实验证实菌株CD86对牙鲆有较高的致病力,其半致死浓度为1.8×105 CFU/尾。通过生理生化特征测定和16SrDNA基因序列分析,判定菌株CD86为鱼肠道弧菌(Vibrio ichthyoenteri)。以福尔马林灭活的菌株CD86全菌分别免疫健康的小鼠和牙鲆,ELISA测定鼠抗血清和牙鲆抗血清效价分别为12 800和1 200。利用间接免疫荧光技术检测2种抗血清与菌株CD86的结合活性,结果显示,2种血清均可同菌体发生阳性反应,其中鼠抗血清阳性反应信号明显强于鱼抗血清。同时,利用Western blotting分析了菌株CD86全菌蛋白的抗原性,结果显示分子量为27、30和37kDa的菌体蛋白条带与2种血清均发生阳性反应;分子量为19、25、28、29和35kDa的菌体蛋白条带仅与鼠抗血清发生阳性反应;分子量为45kDa的菌体蛋白条带只与鱼抗血清发生阳性反应。研究结果表明,牙鲆对菌体抗原产生的抗体应答与小鼠存在明显差异,该发现对研筛鱼用高效的鱼肠道弧菌亚单位疫苗具有重要的参考价值。     

温度、盐度和两种麻醉剂对大泷六线鱼幼鱼耗氧率、排氨率的影响

采用静水呼吸室法,研究了温度、盐度和两种麻醉剂(丁香油、MS-222)对体质量为(6.44±0.59)g的大泷六线鱼幼鱼耗氧率和排氨率的影响。实验分别设置了5个温度梯度(8℃、12℃、16℃、20℃、24℃),5个盐度梯度(15‰、20‰、25‰、30‰、35‰),6个丁香油浓度梯度(0、8、16、24、32、40 mg/L)和5个MS-222浓度梯度(0、10、20、30、40 mg/L)。结果显示,温度、盐度和两种麻醉剂均对耗氧率和排氨率有显著性影响。8℃时,耗氧率和排氨率最低,随温度升高先升高后降低,且均在20℃时达到峰值;盐度30‰时,耗氧率和排氨率最低,盐度升高或降低都会导致耗氧率和排氨率升高;丁香油和MS-222均能有效降低大泷六线鱼的耗氧率和排氨率,其中丁香油的降低效果更为明显;丁香油浓度为24 mg/L时或MS-222为20 mg/L时可使大泷六线鱼处于深度镇定期,结合耗氧率及排氨率变化,认为上述浓度是大泷六线鱼幼鱼保活运输的最佳浓度;本研究所有处理组的O∶N比值范围均在14.77~24.11之间,表明适宜温度和盐度条件下,大泷六线鱼幼鱼主要由蛋白质和脂肪提供能量。研究认为,适度降温、自然盐度和适宜浓度的麻醉剂处理均可显著降低大泷六线鱼幼鱼的呼吸代谢强度,其中丁香油相比MS-222作用效果更加明显。本研究结果为实现大泷六线鱼高质量运输提供了科学参考。     

大泷六线鱼脾脏细胞体外培养的研究

应用植块法,比较大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)脾脏细胞在2种基础培养基和3个胎牛血清浓度下的体外培养效果。根据细胞的迁出、贴壁、细胞种类以及生长状况,得出大泷六线鱼脾脏细胞适宜的体外培养体系为:MEM+15%胎牛血清、pH7.2~7.4、20℃;培养产物由6种细胞组成,其中C型细胞培养120 d以上依然状态良好,并进行了传代培养。培养启动12 d后,C型细胞层上出现造血灶,造血灶细胞最长可以维持50 d以上。本研究为大泷六线鱼脾脏细胞系的构建和脾脏功能的研究奠定了基础。     

大泷六线鱼仔鱼饥饿试验及不可逆点的研究

为了确定大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)仔鱼的初次摄食饥饿不可逆点(PNR),作者利用人工孵化得到的大泷六线鱼初孵仔鱼,在水温(16±0.5)℃、盐度31条件下,研究了饥饿对大泷六线鱼前期仔鱼生长的影响,并确定了仔鱼的初次摄食饥饿不可逆点。结果表明,仔鱼3日龄开口摄食,卵黄于7日龄消耗完毕,油球于8日龄消耗完毕,混合营养期为5~6 d,饥饿对仔鱼卵黄吸收速度影响显著(P0.05),对油球的吸收在仔鱼开口前影响不显著(P0.05),仔鱼开口后影响显著(P0.05)。摄食仔鱼生长呈线性增加,饥饿仔鱼生长呈现先升高后降低的趋势。仔鱼饥饿不可逆点出现在8日龄和9日龄之间。