溶藻弧菌对三疣梭子蟹抗氧化酶系统的影响

从患乳化病的养殖三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)体组织内分离出痛原菌--溶藻弧菌(Vibrioalginglyticus),通过肌肉注射的方式对三疣梭子蟹进行感染实验,对照组注射等量的生理盐水,在感染后O、24、48和72 h分别采集不同处理组三疣梭子蟹的血淋巴、肌肉和肝胰腺组织,测定溶藻弧菌对其各组织抗氧化相关酶活的影响.结果表明:注射生理盐水的对照组三疣梭子蟹体组织中抗氧化酶和MDA含量在不同的采样时间变化不显著(P>0.05).与对照组比较,三疣梭子蟹感染溶藻弧菌后血淋巴、肌肉和肝胰腺组织中SOD活性随着感染时间的延长显著降低(P<0.05).在感染溶藻弧菌24 h时血淋巴和肝胰腺组织中GSH-px活性有增强的趋势(P>0.05),随后在感染48 h后GSH-px活性显著降低(P<0.05);感染组各体组织中的MDA含量均随着感染时间的延长而显著上升(P<0.05).结果显示梭子蟹感染溶藻弧菌后机体消除氧化过程自由基的抗氧化酶活降低,脂质过氧化物水平升高,使得抗氧化防御能力下降.     

氟苯尼考在三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)疾病模型内的代谢动力学

为了解健康和疾病条件下药物在三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)体内的代谢差异,在构建三疣梭子蟹溶藻弧菌疾病模型的基础上,按25mg/kg剂量分别给健康和患病三疣梭子蟹单次口灌氟苯尼考后,采用高效液相色谱法测定了其肝胰腺、肌肉和血浆中的药物浓度,药时数据应用3P97药代动力学软件拟合。结果显示:氟苯尼考在健康和患病条件下三疣梭子蟹相同组织中的药时曲线形态相似,三种组织的药时数据均符合带时滞的一级吸收二室开放模型;肝胰腺吸收药物最快,肌肉次之,血浆最慢;与健康组相比,患病蟹肝胰腺、肌肉、血浆三种组织对氟苯尼考的吸收和消除速度明显减慢,达峰时间推迟,半衰期延长,清除率减低,最高药物浓度下降,表观分布容积和药时曲线下总面积变大。说明疾病使氟苯尼考在三疣梭子蟹体内的吸收、分布、代谢和消除均发生了显著变化,建议患病三疣梭子蟹口服氟苯尼考的休药期至少10d。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)CTL基因SNP位点E4-205 C/T与抗溶藻弧菌相关性分析

C-型凝集素(C-typelectin,CTL)是甲壳类动物体液免疫中重要的免疫因子之一。但CTL基因在溶藻弧菌对三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)感染的过程中的表达及抗病机制尚有待进一步研究。为初步阐明CTL基因SNP E4-205 C/T位点与抗溶藻弧菌感染相关的分子机制,对不同基因型梭子蟹进行溶藻弧菌感染,通过绝对定量方法分析不同基因型梭子蟹肝胰腺、肌肉组织中溶藻弧菌的复制情况。发现溶藻弧菌感染后12 h内梭子蟹肝胰腺、肌肉组织中C/C组细菌数量显著高于T/T组,结果表明T/T组梭子蟹抗感染能力显著高于C/C组。进一步对该位点非同义突变(ACT-ATT)导致的一个氨基酸改变(Thr-Ile)的两种蛋白进行体外重组表达,并对两种重组蛋白CTL-ATT及CTL-ACT进行活性分析。发现两种重组蛋白对溶藻弧菌生长均具有一定的抑制作用, CTL-ATT的抑菌活性显著高于CTL-ACT。重组蛋白CTL-ATT与PAMPs的结合活性高于CTL-ACT与PAMPs的结合活性,同时两种蛋白与PAMPs和溶藻弧菌的结合活性具有浓度依赖性。结果表明三疣梭子蟹CTL基因参与机...     

外源神经递质5-羟色胺(5-HT)和多巴胺(DA)调控三疣梭子蟹争斗行为的初步研究

影响甲壳类动物争斗行为的因素包括性别差异、体型和生殖状态等,神经递质对甲壳动物的争斗行为也具有调控作用.为探索三疣梭子蟹在养殖和繁殖过程中由于争斗行为受损或死亡的行为机制,采用双抗体夹心法测定争斗前后三疣梭子蟹血淋巴中5-HT和DA的含量,并分析了争斗前后肌肉、胸神经节、肝胰腺三种组织中5-HT和DA受体基因表达量变化...     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)CYP2基因的cDNA克隆及表达分析

通过RT-PCR及Smart?TM Race技术,首次克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)CYP2基因cDNA全长序列。该基因cDNA全长1662bp,编码一个由492个氨基酸组成的多肽,预测理论等电点为6.348,分子量大小为56.68kD。氨基酸序列中含有CYP基因家族所特有的K螺旋保守序列(ExxR)和血红素结合区(FxxGxxxCxG)。经氨基酸序列比对及系统进化树分析发现,与岸蟹(Carcinus maenas)的同源性最高,达到75%。实时荧光定量PCR结果表明,CYP2基因在肝胰腺、鳃、肌肉、血淋巴、心脏和眼柄中均有分布,在肝胰腺中表达量最高。肌肉注射磺胺嘧啶后,三疣梭子蟹高、中、低三剂量组CYP2基因表达较对照组都有上调,并具有时间差异性,低剂量组表达量逐渐降低,趋于对照组,中剂量组和高剂量组表达量先升高后降低,6h后同一时间点,均是高剂量组表达最高,低剂量组最低。表明磺胺嘧啶可诱导三疣梭子蟹CYP2基因,CYP2基因可能参与三疣梭子蟹的药物代谢反应。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)半乳糖凝集素PtGAL的基因克隆与原核重组表达

半乳糖凝集素(Galectin)是动物凝集素家族的一员,在脊椎动物和无脊椎动物中都参与了重要的免疫防御反应,是一种重要的免疫因子。通过RT-PCR和RACE技术克隆获得了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)半乳糖凝集素基因全长,并命名为PtGal。该基因全长875bp,开放阅读框为669bp,编码222个氨基酸,包含一个糖识别结构域CRD(位于16—142位氨基酸),预测蛋白的分子量(Mw)为23529.4Da,理论等电点(p I)为5.21。同源性比对结果显示,PtGal编码的氨基酸序列与中华绒螯蟹、南美白对虾、日本囊对虾galectin的同源性分别为77%、66%、58%。实时荧光定量PCR(qRT-RCR)结果表明,PtGal在三疣梭子蟹肝胰腺、肌肉、肠、胃、鳃、心脏、性腺中都有表达,其中在性腺中的表达量最高,在肝胰腺中的表达量最低,但人工感染溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)后,肝胰腺的表达呈先升高后降低的趋势。利用原核表达系统对三疣梭子蟹PtGal进行了重组表达,并通过纯化复性获得了重组目的蛋白rPtGal,ELISA检测rPtGal与不同细菌及真菌的结合活性,结果表明,该重组蛋白与革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌均有较强的结合。本研究为进一步深入研究三疣梭子蟹半乳糖凝集素的功能奠定了基础。     

三疣梭子蟹几丁质酶基因(PtCht6)的克隆及其在免疫中的功能分析

几丁质酶(chitinase)在甲壳动物的蜕皮、消化和免疫等很多生物学过程中发挥重要功能,为深入探讨几丁质酶的免疫防御机制,本实验利用RACE技术克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)PtCht6基因。该基因cDNA全长2736bp,开放阅读框(ORF)2103bp,编码700个氨基酸,具有几丁质酶GH18家族典型特征。利用实时荧光定量技术分析PtCht6在三疣梭子蟹不同组织、不同蜕皮阶段、不同病原感染以及低盐胁迫(11)下的表达特征,结果显示:PtCht6在各组织中均有表达且在肝胰腺中的表达量最高;在不同蜕皮时期的肝胰腺中,其表达量由蜕皮后期(A/B)、蜕皮间期(C)、蜕皮前期(D)依次递减(P0.05);人工感染WSSV和副溶血弧菌后.PtCht6的表达量在肝胰腺中分别于12h、72h达到最大值,在血细胞中均于12h达到最大值,且相较于对照组,整体显著上调表达(P0.05);低盐胁迫能够显著抑制该基因的表达,最高抑制73倍(P0.05)。同时发现,低盐环境下感染WSSV后,该基因达到峰值的时间明显延迟(至少延迟12h.P0.05)。该研究结果预示PtCht6作为免疫因子参与三疣梭子蟹的病原防御,且低盐胁迫在一定程度上抑制了该基因的免疫功能。     

斑节对虾 弧菌病的病理学研究

对患有典型弧菌病症状的养殖斑节对虾进行了病理学研究，取病虾血淋巴制作血涂片，并取鳃、肝胰腺、肌肉等组织作组织病理和超微病理观察，同时取肌注感染后的患病对虾测定血淋巴中超氧化物歧化酶（SOD）的活力，结果显示，患病对虾的血细胞数目急剧减少，胞质浓染，透明细胞很难找到，血细胞形态多样，有的伸出伪足或形成异样突起，患病对虾锶、肝胰腺、心脏、肌肉以及胃肠等组织内均出现程度不同的炎症反应，以肝胰腺最为严重，组织中充满大量的浓染血细胞，细胞肿胀，细胞核核质边聚，线粒体肿胀，变性、严重时整个细胞呈溶解状态，此外，在鳃和肝胰腺组织中还发现溶酶体增多的现象，肌注感染2h后，感染对虾的SOD活力即开始显著下降，之后缓慢回升，至48h恢复大部分活力。     

Cd2+对三疣梭子蟹的毒性效应研究

本研究以三疣梭子蟹Portunus trituberculatus为研究对象,通过急性和亚急性暴露试验,研究Cd²⁺对其肝胰腺和鳃的毒性效应。结果表明:Cd²⁺对三疣梭子蟹的48、72和96 h半致死质量浓度分别为6.55、4.33和3.12 mg/L,Cd²⁺对三疣梭子蟹的安全质量浓度为0.31 mg/L;在安全质量浓度和渔业水质标准质量浓度(<0.005 mg/L)下,随着暴露时间的延长,三疣梭子蟹的肝胰腺和鳃中HSP70的表达量都出现“先升后降”的趋势,与对照组相比,鳃中HSP70的表达量比肝胰腺的变化明显。在安全质量浓度以下,三疣梭子蟹的存活率并没有明显的变化,但是HSP70的诱导表达反映机体受到Cd²⁺的胁迫。因此HSP70基因可用作低质量浓度Cd²⁺污染检测的生物标志物。     

三疣梭子蟹CYP4C基因的cDNA克隆及表达分析

采用RT-PCR及Smart-TM Race技术,首次获得三疣梭子蟹CYP4C基因cDNA全长序列。该基因全长1888bp,编码一个由514个氨基酸组成的多肽,预测分子量大小为59.54kDa,理论等电点为8.08。氨基酸序列中含有CYP基因家族特有的K螺旋保守序列（ExxR）和血红素结合区（FxxGxxxCxG）。同源性及系统进化分析表明,三疣梭子蟹CYP4C基因与岸蟹、凡纳滨对虾、日本沼虾、中国对虾、沟虾、红螯螯虾的同源性分别为88%、72%、66%、59%、60%、59%。荧光定量RT-PCR结果表明,CYP4C在肝胰腺、肌肉、眼柄、鳃和心脏中均有分布,在肝胰腺中表达量最高。高盐（45）胁迫后,三疣梭子蟹CYP4C的表达量显著高于对照组,随着胁迫时间的延长出现逐渐降低的趋势,在胁迫48h后表达量达到对照组水平;低盐（11）胁迫条件下,CYP4C的表达水平随着胁迫时间的延长呈现逐渐下降的趋势,且从胁迫6h开始显著低于对照组。研究推测,CYP4C基因参与三疣梭子蟹盐度适应调节,是蜕皮机制的调控因子之一。     

凡纳滨对虾类Ig定性和定位的初步研究

以凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）为研究对象,运用Western—blotting和免疫组织化学等现代免疫学方法,对对虾中的类Ig（immunoglobulin,免疫球蛋白）蛋白进行定性和定位研究。结果发现,虾血清中有两种分子质量约为70ku和62ku的蛋白可与抗人Ig发生特异性的结合。同时,虾血细胞——无颗粒细胞的外膜及虾类淋巴器、肝胰脏、心脏、胃和肠等5种组织器官的石蜡切片与抗人Ig反应呈不同程度的阳性,其中类淋巴器和肝胰脏显色较深。提示,虾体内确实存在能与抗人Ig发生特异性结合的类Ig蛋白,其不仅存在于虾血清中,还存在于无颗粒细胞、类淋巴器和肝胰脏等组织中,为对虾的免疫系统的研究和疾病的防治奠定基础。     

熊本牡蛎、葡萄牙牡蛎和长牡蛎组织菌群构成及功能的比较分析

为探究健康二龄熊本牡蛎、葡萄牙牡蛎和长牡蛎5种组织间细菌群落组成、多样性和功能的差异,本研究利用Illumina高通量测序技术和PICRUSt2对3种牡蛎5种组织中的细菌群落构成及其潜在功能进行了比较分析。结果显示,在3种牡蛎的5种组织中共鉴定到6 020个细菌OTUs,其中3种牡蛎整体间共有的OTUs数占42.4%。3种牡蛎5种组织中的优势菌主要隶属于γ-变形菌纲（γ-proteobacteria）、α-变形菌纲（α-proteobacteria）、柔壁菌门（Tenericutes）和厚壁菌门（Firmicutes）。弧菌属（Vibrio）在熊本牡蛎的鳃、外套膜、性腺和血淋巴中的相对丰度均显著高于长牡蛎和葡萄牙牡蛎,且分别在熊本牡蛎外套膜、长牡蛎性腺和葡萄牙牡蛎血淋巴中相对丰度最高,但均在3种牡蛎肝胰腺中相对丰度最低。3种牡蛎5种组织间的菌群多样性均有所差异,其中在熊本牡蛎鳃、葡萄牙牡蛎外套膜和长牡蛎血淋巴中菌群多样性最高,而在熊本牡蛎血淋巴、葡萄牙牡蛎性腺和长牡蛎肝胰腺中菌群多样性最低。在不区分组织的情况下,3种牡蛎整体间的菌群结构存在显著差异（r=0.661,p<0.001）。此外,在熊本牡蛎肝胰腺、葡萄牙牡蛎鳃和长牡蛎血淋巴中细菌参与的能量代谢相关功能通路的相关丰度显著高于对应牡蛎的其他组织。本文结果表明,熊本牡蛎、葡萄牙牡蛎和长牡蛎组织内的菌群构成存在差异,且由细菌介导的功能也随牡蛎种类和组织类型发生改变。     

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)雄性生殖系统发育过程中生化成分的季节变化

采用生化方法测定了中华绒螯蟹雄性生殖系统及肝胰腺各组织中甘油三酯、胆固醇、蛋白质、葡萄糖和糖原含量的季节变化。结果表明，全年胆固醇含量在肝胰腺、血淋巴和精巢中均有2个高峰，分别在6月和12月、7月和12月、9月和次年1月，且第二峰值均明显高于第一峰值；肝胰腺葡萄糖含量最高值出现在6月，之后逐渐下降，而血淋巴和精巢则在7月，之后亦逐渐下降；肝胰腺和血淋巴出现糖原峰值的时间和葡萄糖相似，但精巢在9月，而副性腺在8月时已达到较高含量，最高值出现在次年1月；蛋白质的变化与上述3种物质基本相似，但血淋巴出现峰值的时间要早于肝胰腺。上述各生化成分变化的先后顺序和连续性表明，肝胰腺内上述物质在进入性腺快速发育期前，经血淋巴向精巢和副性腺转移，精巢对胆固醇和葡萄糖的积累要早于副性腺，这些物质的变化与生殖周期存在明显的相关性。肝胰腺中甘油三酯始终处于积累状态，而精巢和副性腺在前期对甘油三酯的积累极少，直至后期才略有上升，表明甘油三酯并非性腺发育所必需。     

日本沼虾黑鳃病几种同工酶的变化与病理分析

酯酶（EST），过氧化物酶（POD），乳酸脱氢酶（LDH）和苹果酸脱氢酶（MDH）同工酶在日本沼虾中存在着组织和器官的特异性，患黑鳃病后酶带发生显著变化。在肌肉、肝脏、心脏和鳃中病虾较健康虾的LDH酶谱分别缺失了2、6、2和1条酶带，同时肝脏中新增了1条酶带；POD酶谱分别缺失了0、7、4和2酶带，肌肉中新增了2条酶带；EST酶谱分别缺失了0、2、3和1条酶带，肌肉、心脏和鳃中分别新增了1、2和2条酶带；MDH酶谱分别缺失了0、2、1和1条酶带，肌肉和脏脏中各新增了1条酶带。     

Heavy metal stress induced hyperglycemia in blue swimmer crab, Portunus pelagicus

The study was to find out the effect of cadmium and mercury on levels of hemolymph glucose, crustacean hyperglycemic hormone (CHH) and hepatopancreas glycogen in the blue swimmer crab Portunus pelagicus. The experiments were performed in both intact and eyestalk ablated crabs. Quantification of CHH was done by the indirect ELISA with the aid of primary anti-Carcinus maenas-CHH antibody. Higher glucose concentration was observed on exposure to 8×10^-6 of cadmium ((825.6±5.42) μg/mL) and 6×10^-6 of mercury ((90.5±6.25) μg/mL) after 48 h and 24 h respectively. Higher level of hemolymph glucose was observed in eyestalk intact crabs on exposure to cadmium and mercury than eyestalk ablated crabs. Decrease in the levels of CHH was observed in both eyestalk intact and ablated crabs on heavy metal exposure. Decline of the hepatopancreas glycogen level was also witnessed with the exposure to heavy metal, which validated its utilization in the production of glucose. Thus this study brings to light, the variations in hemolymph glucose, CHH and hepatopancreas glycogen on heavy metal stress. These carbohydrate metabolites can be used as biomarkers in assessing heavy metal contamination in water bodies.     

口虾蛄超氧化物歧化酶同工酶的组织特异性研究

以口虾蛄为材料进行研究，用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，对其肌肉、心脏、腹鳃、肝胰腺及眼球5种组织器官进行超氧化物歧化酶(SOD)同工酶的研究分析。结果表明：不同组织中超氧化物歧化酶(SOD)的同工酶谱带存在差异，具有明显的组织特异性。眼球、腹鳃、肝胰腺和心脏中有2条酶带，肌肉中几乎不表达，心脏中SOD2和肝胰腺中SODl谱带表达最浓，而腹鳃中的酶带表达最弱。     

克氏原鳌虾LDH同工酶的组织特异性研究

以克氏原螯虾为材料,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法,分析了肌肉、眼球、肝胰腺和心脏4种组织和器官中乳酸脱氢酶(LDH)同工酶的表达情况.结果发现,眼球中出现Ldh-5和Ldh-6 2条酶带,肌肉中出现Ldh-1、Ldh-2、Ldh-3、Ldh-4、Ldh-5共5条酶带,肝胰腺中只出现Ldh-6 1条酶带,心脏中出现Ldh-3和Ldh-5共2条带.在这些检测到的酶带中,肌肉中Ldh-5活性最强,染色最深.实验结果表明,不同组织中LDH的同工酶的表达存在差异,表现出明显的组织特异性.     

饥饿对方斑东风螺形态和组织生化成分的影响

以室内实验测定了方斑东风螺（Babylonia areolata）在饥饿120d过程中形态、组织生化成分及RNA/DNA比值的连续变化.结果显示,饥饿前期幼螺体重变幅较小,肝体比与体壳比下降迅速,三者分别于饥饿80、40、20d时显著地低于对照组,至饥饿120d时其降幅分别为22.33%、44.02%、30.39%.方斑东风螺在饥饿过程中,螺足肌与肝胰脏的水分含量分别从80.19%、48.44%上升至89.68%、63.97%;灰分含量分别从11.35%、8.92%增加至22.80%、16.52%;肝胰脏蛋白质含量从53.18%上升至56.65%.饥饿40d时,其足肌、肝胰脏脂肪含量均显著低于对照组,糖原含量在其饥饿20、40d时也显著地下降.饥饿120d时,其足肌的脂肪和糖原含量相应降幅分别为32.22%、44.64%,而肝胰脏的脂肪和糖原含量相应降幅则分别为26.87%、47.17%.足肌蛋白质含量在其饥饿80d前较稳定,后期迅速下降,实验结束时降幅为8.61%.这2种组织的RNA/DNA比值也呈逐渐下降趋势.上述结果表明,在饥饿状态下幼螺主要消耗这2种组织中脂肪与糖原的供能,当禁食长达80d后则加大对足肌蛋白质的动用,而相对保留肝胰脏蛋白质.组织含水量、RNA/DNA比值均可作为方斑东风螺饥饿状态下的营养预测指标.