基于核酸适配体的差减荧光法检测鳗弧菌(Vibrio anguillarum)

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)可感染鳗鲡、虹鳟和大菱鲆等多种水产动物,是水产养殖中的一种重要病原菌,对其进行快速检测是病害防控的前提和基础。利用鳗弧菌与其核酸适配体之间有较强的亲和特异性,首次建立了一种基于核酸适配体的可定量检测鳗弧菌的差减荧光法。该方法对鳗弧菌有较好的特异性,对鳗弧菌的检测荧光值是其他菌(溶藻弧菌、哈维氏弧菌、铜绿假单胞菌、变形假单胞菌、嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌和大肠杆菌)的4～11倍,对鳗弧菌的最低检测限为10²CFU/mL,可用于10²～10⁸CFU/mL的范围内的定量检测。通过对不同盐度海水和鱼体组织样品进行加标回收检测,结果表明,回收率和相对标准偏差等指标均符合相应的标准,说明该检测方法可用于海水样品和水产动物组织中鳗弧菌的检测。     

利用核酸适配体的竞争置换作用检测溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是水产养殖中致病性较强的一种条件致病菌,为更灵敏、高效地对其进行检测,研发出一种基于核酸适配体竞争置换作用的检测方法。首先设计并制备出磁珠-核酸适配体-荧光报告探针的检测复合物(MAP检测复合物),然后利用溶藻弧菌与其核酸适配体有较好的亲和特异性,在对样品进行检测时,样品中的溶藻弧菌就会竞争MAP检测复合物中的核酸适配体,从而置换出与该核酸适配体结合的荧光报告探针,再通过检测置换出的报告探针的荧光强度来表征溶藻弧菌的浓度,从而实现对溶藻弧菌的定量检测。结果表明,该方法对溶藻弧菌的检测限可达到1CFU/mL,与嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、大肠杆菌(Escherichia coli)等水产养殖中的常见致病微生物没有交叉反应,并在1~20、20~100和100~1000 CFU/mL范围内都表现出较好的线性关系。另外还对MAP检测复合物的制备条件进行了优化,较为理想的制备条件为:100nmol/L核酸适配体与100nmol/L荧光报告探针按体积比1︰1混合结合30 min,制备出50 nmol/L的核酸适配体-荧光报告探针复合物,然后该复合物再与25μg/mL的磁珠按体积比1︰1混合结合60 min,制备出相应的MAP检测复合物。利用核酸适配体的竞争置换作用检测溶藻弧菌有较好的灵敏度和特异性,展现了较好的应用前景。     

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)核酸适配体筛选中高频序列的进化多样性研究

核酸适配体是采用分子进化技术从随机寡核苷酸文库中筛选得到的对靶目标有较高亲和力的寡核苷酸序列。研究核酸适配体筛选过程中高频序列的进化多样性,对于提高筛选效率,掌握核酸适配体的进化规律具有重要意义。利用Margalef丰富度指数、Shannon-Wiener多样性指数、Pielou均匀度指数、Berger-Parker优势度指数,研究了鳗弧菌(Vibrio anguillarum)核酸适配体筛选产物中高频序列的进化多样性,结果表明,随着筛选进行,高频序列的种类数、丰富度、多样性、优势度和均匀度在前六轮都呈现较为剧烈的波动,之后种类数、丰富度、多样性、优势度呈现逐步增加的趋势,而均匀度则呈逐步下降的趋势,说明竞争力强的序列在筛选竞争中逐渐占据优势,其种类数量不断增加;利用相对重要性指数(IRI)对高频序列进行了计算分析,根据IRI值可将高频序列分为5类:优势序列,重要序列,常见序列,一般序列和少见序列,其中前三种序列是筛选进化中的相对优势种群;最后对IRI较高的7种核酸适配体进行了二级结构预测,结果显示其二级结构中存在着大小、数量不等的环状结构,这些环的大小数量可能与其结合位点相关。相关研究结果对于鳗弧菌的病害防控及核酸适配体的筛选都具有重要意义。     

苗期中国对虾幼体异养细菌区系及其变化与病害发生的关系

研究了2个育苗场不同发育期的中国对虾(Penaeus chinensis)幼体的异养菌和弧菌种群变化的动态过程。以典型特征法、BIOLOGGN法和数值分类法对菌株进行鉴定。结果表明，对虾幼体样品中所分离的细菌，大多是革兰氏阴性杆菌。鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas)、气单胞菌属(Aeromonas)和弧菌属(Vibrio)。弧菌属主要为溶藻弧菌(Vibrioal-ginozyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)。在对虾幼体发育早期，假单胞菌(Pseudomonas)和气单胞菌(Aeromonas)占优势，随着对虾幼体的发育，弧菌(Vibrio)渐成为优势，其中溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)优势明显。二者的消长与苗期病害的发生相关，溶藻弧菌总是在虾幼体健康时出现或成为优势，而哈维氏弧菌成为优势时，苗期病害容易发生。     

迟缓爱德华氏菌胶体金快速检测试纸的研制

本研究用纳米胶体金颗粒标记抗迟缓爱德华氏菌(AL60306NA1)单克隆抗体3A7并制备金标垫,将抗迟缓爱德华氏菌(AL60306NA1)单克隆抗体4F11与羊抗鼠抗体作为捕获抗体包被硝酸纤维素膜,建立迟缓爱德华氏菌的胶体金免疫层析快速检测方法。经过对试纸条的特异性和灵敏度测定,结果表明:试纸条与嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌、海安气单胞菌、产碱假单胞菌、无乳链球菌、大肠埃希杆菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、类志贺邻单胞菌、鲁氏不动杆菌等15种水产常见病原菌没有交叉反应,与迟缓爱德华氏菌特异性反应,检测灵敏度为1×105cfu.mL-1,检测所需时间低于20min。所制备的迟缓爱德华氏菌胶体金免疫层析检测试纸条具有快速、简便、特异性高和适应基层生产推广应用等优点。     

中国对虾成虾肠道微生物区系

对野生健康中国对虾成虾肠道微生物区系进行了研究.从其肠道中分离出47株菌,它们分别属于弧菌属、发光杆菌属、不动杆菌属、假单胞菌属、黄杆菌属、气单胞菌属、屈挠杆菌属和色杆菌属8个属.其中弧菌属和发光杆菌属在整个肠道中为优势菌属,不动杆菌属和假单胞菌属为次优势菌属,黄杆菌属、气单胞菌属、屈挠杆菌属和色杆菌属为非优势菌属.在对虾的整个肠道中,前肠和中肠的优势菌属为弧菌属,而后肠的优势菌属为发光杆菌属.在弧菌属中溶藻胶弧菌、漂浮弧菌和坎贝氏弧菌为优势菌,哈唯氏弧菌为非优势菌.前肠、中肠和后肠的菌量分别为1.3×105、2.8×105和1.1×104cfu/虾体.     

刺参肠道微生物组成分析及产酶、溶血性试验

对野生和人工养殖刺参的肠壁及内容物中的菌群数量、种类组成进行了研究;并结合产酶试验和溶血性试验,对刺参肠道益生菌做了初步的体外筛选。结果表明,野生刺参肠壁及内容物中的细菌数量分别为(3.30±0.41)×107 cfu/g、(6.39±0.32)×107 cfu/g,养殖刺参肠壁及内容物中的细菌数量分别为(2.83±0.31)×107 cfu/g、(5.67±0.53)×107 cfu/g。野生刺参肠道优势菌为弧菌属(Vibrio),次优势菌为假单胞菌属(Pseudomonas)和希瓦氏菌属(Shewanella);养殖刺参肠道优势菌为弧菌属(Vibrio),次优势菌为假单胞菌属(Pseudomonas)。在224株细菌中,共有160株细菌具有产酶能力,所占比例为71.43%,其中具产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶能力菌株分别为114株、114株、108株,所占比例分别为50.89%、50.89%、48.21%。99株细菌中有23株具有溶血性,所占比例为23.23%。综合分析实验数据,确定6株细菌作为刺参肠道潜在益生菌,菌株代号分别为HS1(Pseudomonas)、HS5(Bacillus)、HS7(Shewanella)、HS8(Vibrio)、HS10(Vibrio)、HS11(Vibrio)。     

4种微生态制剂对对虾育苗水体主要水质指标的影响

研究了由球形红假单胞菌(Rhodopseudomlonas sphaeroides)、噬菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)及黏红酵母(Rhodotorula glutinis)制成的4种微生态制剂对中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)育苗水质的影响.结果表明,试验组与对照组相比都能明显净化水质,试验组中以添加噬菌蛭弧菌和黏红酵母组的效果最差,添加球形红假单胞茵和噬茵蛭弧茵组的效果最好,此组水质的pH值稳定,NH4+-N明显下降,而亚硝酸盐、化学需氧量及硫化物等指标也优于其他试验组.统计分析显示,试验组与对照组相比,细菌数降低了3个数量级,添加嗜菌蛭弧菌试验组在减少异养茵(包含有害细菌)方面效果较好.同时用鳗弧菌攻毒,在5 d内,对照组的死亡率显著高于试验组(P<0.05),试验组免疫保护率为29.4%～58.5%,以添加嗜菌蛭弧菌和球形红假单胞菌组最高.建议联合使用噬菌蛭孤菌和球形红假单胞菌,混合密度初步定为2×105个/mL.     

来自大黄鱼(Pseudosciaena crocea)肠道的弧菌拮抗菌的筛选与鉴定

采用点种法并以副溶血弧菌(Vp1.2164)和溶藻弧菌(Va-Y)为弧菌指示菌,对从健康的大黄鱼肠道内分离的115株细菌进行体外拮抗试验。并对筛选出的拮抗菌进行抗菌谱测定,最后利用VITEK-32细菌快速鉴定系统和16SrRNA基因序列对拮抗菌进行鉴定。结果表明,从中筛选到3株有较强拮抗作用的菌株,编号分别为X1402-1、X1108和X3914,且菌株X1402-1的抗菌作用最强,抗菌谱最广,21株病原指示菌中,对16株均能产生较强的抑制作用,其中对Vp-1.2164的抑菌直径最大,达到28.5mm,对Va-Y的抑菌直径为8.7mm;其次为菌株X1108和X3914,对两种指示弧菌的抑菌直径分别为:12.0mm、9.0mm和0mm、7.2mm。经VITEK-32细菌快速鉴定系统鉴定,3株拮抗菌分别与铜绿假单胞菌,恶臭假单胞菌,地衣芽孢杆菌的相似性均为99%。通过16SrRNA基因序列分析表明,3株拮抗菌分别与类产碱假单胞菌Pseudomonas pseudoalcaligenes(EU419918)、恶臭假单胞菌Pseudomon asputida(FJ440105)和地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis(DQ988136)的16SrRNA基因同源性最高,分别为100.0%、97.5%、99.0%。综合分析试验结果,X1402-1、X1108和X3914分别被确定为类产碱假单胞菌、恶臭假单胞菌和地衣芽孢杆菌。     

应用二温式PCR检测诊断爱德华氏菌病

根据爱德华氏菌(Edwardsiella)的16S rDNA基因序列设计一对特异性引物,用二温式PCR对6株爱德华氏菌均扩增出与预期大小相一致的576 bp产物,而对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、荧光假单胞菌(Pseudcmonas fluoroscercs)、柱状屈挠杆菌(Cytophaga columnaris)、链球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococci)、弧菌(Vibrio)、大肠杆菌(Escherichia colibacillus)和沙门氏菌(Salmonella)等10种病原体的扩增,结果全为阴性。该二温式PCR可以检测到1 pg的爱德华氏菌DNA模板和48个菌体。本实验建立的二温式PCR为爱德华氏菌病的早期诊断与有效的防治提供了快速检测方法,对水产品的食品安全有重要的意义。     

海马齿对不同盐度水质的碳汇作用以及不同形态氮利用的研究

为探讨海马齿(Sesuvium portulacastrum)对水域环境修复作用,本文研究了水培海马齿对不同盐度水质的碳汇作用以及不同形态氮的利用情况。实验设计0、10、20、30、35盐度梯度,海马齿水培时间82 d,然后测定植株干重、营养元素含量以及积累速率,最后在抑菌与不抑菌条件下研究海马齿根际与铵态氮(NH₄⁺-N)、硝态氮(NO₃^--N)、无机磷(PO₄^3-)以及色氨酸(Trp)吸收转化关系。研究结果表明,盐度10条件下海马齿植株干重、有机元素含量以及积累速率最高,有机碳、有机氮与有机磷积累速率分别为(5.572±1.611)、(0.313±0.058)、(0.057±0.013)mg/(d·ind.),而高盐环境35盐度条件下对海马齿生长造成一定胁迫。盐度0～35范围,海马齿均未出现死亡现象。不同盐度抑菌培养条件下,色氨酸与无机氮共存时均能被能被海马齿利用,色氨酸利用量远高于硝态氮、铵态氮;不抑菌条件下铵态氮则表现出增加的结果。海马齿作用在盐度...     

富油微藻富碳培养下油脂积累及固碳研究

微藻固碳是一种新型节能减排技术，具有长期可持续发展的潜力。本文对两株富油微藻（球等鞭金藻和微拟球藻）进行了富碳培养下生长特性及中性脂积累特性的研究。两株富油微藻的最佳培养条件为10%CO₂浓度和f培养基。本研究对两株富油微藻的最大生物量产率、总脂含量、最大油脂产率、微藻的C含量和CO₂固定率进行了测定。球等鞭金藻的各参数指标分别为：142.42±4.58g/（m²·d），39.95%±0.77%，84.47±1.56g/（m²·d），45.98%±1.75%和33.74±1.65g/（m²·d）。微拟球藻的各参数指标分别为：149.92±1.80g/（m²·d），37.91%±0.58%，89.90±1.98g/（m²·d），46.88%±2.01%和34.08±1.32g/（m²·d）。实验结果显示，两株海洋微藻均属于高固碳优良藻株，适合应用于微藻烟气减排技术开发，具备用于海洋生物质能耦合CO₂减排开发的潜力。     

近交对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)生长、存活及抗逆性的影响

通过设计交配组合,建立中度近交组GM(近交系数大于0.25,家系G1,G2,G3,G4)、轻度近交组GL(近交系数0.0625—0.25,家系Z1,Z2,Z3,Z4),非近交组GN(近交系数为0,家系F1,F2,F3,F4),比较共同环境养殖90d不同近交程度凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)家系体质量(BW)、存活率(SR)、高氨氮耐受存活率(SRA)及低溶氧耐受存活率间(SRH)的差异性,计算近交家系相关性状的近交衰退系数,评价近交对凡纳滨对虾生长、存活和抗逆性的影响。结果显示:GN组BW为7.66±2.86g,显著高于GM组BW(P0.05);GL组SR、SRA、SRH间差异近交衰退系数为–6.41%、–13.63%、–11.84%;GM组的SR、SRA、SRH的近交衰退系数为5.30%、–4.73%、–4.77%;Z2的BW最大为8.59±3.85g,G3的BW高于GN组均值;G2家系SR为84.81%±10.37%,显著高于其它家系(P0.05);75%的近交家系表现出SR近交衰退,62.5%的近交家系表现出SRH近交衰退。结果表明:近交导致凡纳滨对虾生长、高氨氮耐受性及低溶氧耐受性的衰退普遍存在,应避免高度近交个体的产生,近交系数应控制在0.25以下;少数近交家系的生长、存活、高氨氮耐受性或低溶氧耐受性优于非近交家系,推测选择合理亲缘选配方案可加快凡纳滨对虾遗传改良进程。     

黄海典型漂浮大型藻类光谱特征分析

利用实测高光谱和多光谱相机数据对在黄海海域采集的浒苔和马尾藻样本进行光谱特征分析。结果显示:漂浮大型藻类的高光谱反射率均值(Rmean_H)与多光谱反射率均值(Rmean_M)、高光谱藻类指数(VB-FAHH)与多光谱藻类指数(VB-FAHM)之间的相对误差小于15.6%,说明这两种数据具有较好的一致性;基于光谱特征波长的反射率建立比值光谱指数,其中浒苔和马尾藻的差异最为明显的是R640/R554指数;基于多光谱相机计算反射谷深度指数(T-depth),采用阈值法来区分浒苔和马尾藻,T-depth阈值的区分精度分别为69.6%±30.0%和69.6%±24.3%,稍优于虚拟基线漂浮藻类指数(VB-FAH)阈值的区分精度。     

冬季东寨港微微型浮游植物丰度、分布及影响因素

微微型浮游植物是水环境生态碳汇的重要基石之一,也是初级生产的重要执行者。选取了一个典型的陆海交界关键带环境——海南东寨港入海口水域,采集了东寨港红树林保护区开阔水域、入港河流和新埠海海端的微微型浮游植物的样品,通过流式细胞仪分析技术对样品进行分析,以探究它们在东寨港水域中的丰度、分布及环境指示意义。结果表明,冬季水域微微型浮游植物以真核浮游植物(Eukaryote,Euk)和聚球藻(Synechococcus,Syn)两大类群为主,其中聚球藻有两个亚群,分别为富含藻蓝蛋白聚球藻(Phycocyanin-rich,PC)和富含藻红蛋白聚球藻(Phycoerythrin-rich,PE)。Syn-PC、Syn-PE和Euk在东寨港水域表层水体的平均丰度分别为(2.61×10⁴±1.09×10⁴)、(3.06×10⁴±7.05×10³)、(1.56×10⁵±8.03×10⁴) cells/m L,底层水体的平均丰度分别为(2.64×10⁴±...     

考洲洋牡蛎养殖海域海-气界面CO2交换通量的时空变化

根据2018年7月、11月和2019年1月、4月对广东考洲洋牡蛎养殖海域进行4个季节调查获得的pH、溶解无机碳(DIC)、水温、盐度、溶解氧(DO)及叶绿素a(Chla)等数据,估算该区域表层海水溶解无机碳体系各分量的浓度、初级生产力(P_P)、表层海水CO₂分压[p(CO₂)]和海-气界面CO₂交换通量(F_CO2),分析牡蛎养殖活动对养殖区碳循环的影响。结果表明:牡蛎养殖区表层海水中Chla、DIC、HCO₃^–和P_P显著低于非养殖区;养殖淡季表层海水中pH、DO、DIC、HCO₃^–、和CO₃^2–显著大于养殖旺季,养殖旺季的p(CO₂)和F_CO2显著大于养殖淡季。牡蛎养殖区表层海水夏季、秋季、冬季和春季的海-气界面CO₂交换通量F_CO2平均值分别是(42.04±9.56)、(276.14±52.55)、(–11.59±18.15)和(–13.02±6.71)mmol/(m²·d),冬季各站位F_CO2值离散度较大,其中位数是–10.73mmol/(m²·d)。在全年尺度,表层海水p(CO₂)及F_CO2与水温呈显著正相关,与盐度呈显著负相关。在非养殖区,浮游植物光合作用可能对影响表层海水p(CO₂)及F_CO2起主导作用。养殖牡蛎钙化、呼吸作用等生理因素释放的CO₂对表层海水p(CO₂)及F_CO2未产生显著影响。考洲洋养殖海域养殖旺季为CO₂的源,养殖淡季整体为CO₂的弱汇。     

斑石鲷(Oplegnathus punctatus)雌、雄鱼核型及Ag-NORs带型分析

为研究斑石鲷雌、雄鱼染色体的形态与结构,本文采用植物血球凝集素(PHA)及秋水仙碱体内注射法,取头肾细胞采用冷滴片结合空气干燥的方法获取了斑石鲷雌、雄鱼染色体的中期分裂相,分别对其进行了常规的吉姆萨和硝酸银染色并进行核型和带型分析。结果显示:(1)雄性斑石鲷核型为2n=47、1m+2sm+44t、NF=50,雌性斑石鲷核型为2n=48、2sm+46t、NF=50。(2)斑石鲷雌、雄鱼染色体相对长度分别为(2.30±0.37)—(6.87±0.42)及(2.28±0.30)—(10.33±0.86),雄性斑石鲷具有一条体型巨大的异形中部着丝粒染色体,其相对长度达到其它染色体的2—5倍。(3)染色体经银染后,发现含有2个Ag-NORs位点的分裂相最多,位点位于一对亚中部着丝粒染色体短臂末端,呈短棒状,且具有活性异形现象。(4)本研究中雄性斑石鲷具有一条异形性染色体,可能是性染色体Y,我们推测其染色体的性别决定类型可能为X1X1X2X2/X1X2Y型。本研究为鲈形目鱼类的细胞遗传学研究提供了基础资料,并将为进一步开展斑石鲷遗传育种等研究奠定基础。     

洞庭湖水系五强溪水库光泽黄颡鱼(Pelteobagrus nitidus)遗传多样性的AFLP分析

为了了解沅水五强溪大坝阻隔对光泽黄颡鱼可能造成的遗传多样性影响,采用AFLP分子标记技术,对沅水五强溪水库库区和沅水下游两个光泽黄颡鱼野生群体进行了遗传多样性分析。9对选择性引物在两个光泽黄颡鱼群体中,共扩增出1243个位点,多态位点1091个,多态位点比率为87.77%。其中库区和沅水下游群体多态位点比率分别为85.41%、83.25%,观测等位基因数分别为1.854±0.592、1.803±0.622,有效等位基因数分别为1.597±0.381、1.574±0.377,Nei’s多样性指数分别为0.220±0.211、0.207±0.195,Shannon’s信息指数分别为0.330±0.305、0.302±0.338;两个群体内的平均遗传距离分别为0.124±0.072、0.119±0.057,群体间的平均遗传距离为0.127±0.100。两个群体的遗传参数比较不存在显著差异(P0.05)。聚类分析显示,UPGMA系统树没有依据群体而形成明显的两大分支。以上结果表明,五强溪水库库区和沅水下游两个光泽黄颡鱼群体的遗传多样性丰富,光泽黄颡鱼种群遗传结构对水库大坝阻隔的响应不明显。