蛤蜊科3种贝类16S rRNA基因片段及ITS2核苷酸序列分析

利用PCR技术分别扩增连云港及启东沿海蛤蜊科的西施舌(Coelomactra antiquata)、中国蛤蜊(Mactrachinensis)和四角蛤蜊(Mactra veneriformis)3种双壳贝的16S rRNA基因片段和ITS2核苷酸序列,测序后用DNA star软件分析了核苷酸差异。结果显示:三种贝类16S rRNA基因片段长度相同,均为306bp(去除引物),核苷酸存在多态性,共有45个变异位点,54个核苷酸发生了变异,全部为碱基置换。西施舌与中国蛤蜊此片段核苷酸的同源性为88.9%,与四角蛤蜊的同源性为88.6%,中国蛤蜊与四角蛤蜊的同源性为90.6%。三种蛤蜊ITS2序列分别为390 bp(西施舌)4、41 bp(四角蛤蜊)和466 bp(中国蛤蜊),存在长度多态性,ITS2核苷酸差异分析结果显示,西施舌与中国蛤蜊的同源性为70.9%-71.1%,西施舌与四角蛤蜊的为70.5%-71.0%,中国蛤蜊与四角蛤蜊的同源性为88.1%-88.8%。ITS2序列分析结果与16S rRNA基因片段分析结果一致,2种分子分析法均显示中国蛤蜊与四角蛤蜊的亲缘关系近。     

钦州湾牡蛎线粒体16SrRNA和COI基因片段的序列变异分析

利用线粒体16SrRNA基因和线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ（cvtocllrome oxidase Ⅰ，COI）基因片段初步研究钦州湾牡蛎（Ostxea）的物种组成。以特异引物进行PCR扩增，对扩增产物进行纯化、测序，分析表明，16SrRNA基因部分长度为413bp，COI基因部分长度为535bp，2种牡蛎序列的碱基组成均显示出较高的A＋T比例：16SrRNA基因598％；COI基因605％。对位排序比较表明，16SrRNA片段种内个体间变异较小，存在7个变异位点，4种单倍型，其中包括5个转换位点突变，2个颠换位点突变；COI片段有30个碱基存在变异，7种单倍型，其中包括16个转换位点突变，14个颠换位点突变。运用MEGA4软件计算出不同个体间的遗传距离，并构建了NJ和UPGMA系统树。香港牡蛎（Crassostrea hongkongensis）16SrRNA和COI序列与白肉牡蛎的遗传距离均为0000，有明巨牡蛎（Crassostrea ariakensis）16SrRNA和COI序列和红肉牡蛎（redmeatostxea）的遗传距离分别为0000和0011，白肉牡蛎16SrRNA和COI序列和红肉牡蛎之间的遗传距离分别为0035和0146。结果表明，钦州湾牡蛎分为2个不同的种，线粒体16SrRNA和COI基因在种间存在明显的多态性，证实了16SrRNA和COI基因序列适用于牡蛎的系统学分析。     

一株H_5N_1亚型禽流感病毒株NA基因的克隆与序列分析

用RT-PCR方法从1个H5N1亚型禽流感病毒分离株A/Chicken/Guangdong/DH/1997扩增NA基因cDNA片段,将其克隆至pMD18-T载体,获得重组质粒pMD-NA,并对其核苷酸序列进行测定和分析。结果表明,该毒株的NA基因长度为1350bp,编码449个氨基酸,与其它H5N1亚型AIV分离株的核苷酸序列同源性为97.0%～99.4%,氨基酸序列同源性为97.7%～99.1%,提示禽流感病毒NA基因保守性较高。NA基因氨基酸序列的聚类分析表明该毒株与来自香港的A/Pheasant/HK/FY155/01和A/Ch/HK/FY150/01两个分离株处于同一进化枝,亲缘关系较近。     

一株H_5亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆与序列分析

根据GenBank中发表的H5亚型禽流感病毒HA基因序列设计2对引物,用RT-PCR方法从禽流感病毒广东分离病毒株(A/Chicken/Guangdong/1997)中扩增HA基因cDNA片段,并将其克隆至pMD-18T载体进行核苷酸序列测定。结果表明:用2对引物所扩增的片段大小分别约为1300 bp和800 bp,经序列拼接获得的HA基因cDNA长度约为1601 bp,编码533个氨基酸,与国内己发表的11个代表株的核苷酸和氨基酸序列同源性为分别为96.9%~99.9%和86.5%~93.0%;HA基因编码的氨基酸序列的系统进化树也表明A/Chicken/Guang-dong/1997、A/Goose/Huadong/01/2000、A/Ck/Hk/37.4/2002、A/Chicken/Zhoukou/2/02、A/Duck/Guangxi/53/2002、A/Duck/Fujian/01/2002等毒株处于同一进化枝,亲缘关系较近;而与A/Silly/Chicken/Hongkong/SF189/01株处于不同进化枝,亲缘关系较远。     

3种柔鱼线粒体基因与核核糖体基因片段序列比较分析

为准确检测柔鱼（Ommαstrephesbartram川、茎柔鱼（ Dosidicus gigas）与阿根廷滑柔鱼（ IIIex argentinus ） 的种间遗传差异,对线粒体16SrRNA、细胞色素b（Cytb）与编码核糖体大亚基的基因（28SrDNA）片段序列进 行测定。经比对获得同源片段序列的长度分别为444、430、464坤,其中16SrRNA与28SrDNA基因片段上分别存在3处和47处碱基插入/缺失。核昔酸组成分析表明;3种柔鱼在3个基因片段上的核音酸组成差异不显著, 在线粒体2个基因片段上的A＋T含量（16SrRNA;69.90%、72.01%、74.66%; Cytb; 63.61%、68.91%、71.65% ） 均明显高于C＋C含量（16SrRNA;30.10%、27.99%、25.34%; Cytb; 36.39%、31.09%、28.35% ）,而在28SrDNA 基因片段上的A＋T含量（37.16%、36.74%、38.29% ）明显低于C＋C含量（62.84%、63.26%、61.71 %）0 3种柔鱼 在28SrDNA基因片段上检测到的核昔酸替代率最低,为6.68%,而蛋白质编码基因Cytb核昔酸替代率最高,为 20.93%,核营酸替代均发生在密码子第3位点上,而且未引起氨基酸替代。基于邻接法、最大简约法与最大似然 法重建的系统树显示,柔鱼与茎柔鱼的亲缘关系较近。根据C严b基因片段序列分析,柔鱼与茎柔鱼和阿根廷滑柔鱼的分歧时间分别为653-790万a和765 - 925万a,种间分化事件发生在中新世至上新世间。     

冲绳日本绒螯蟹线粒体DNA125rRNA序列的研究

采集日本冲绳源河川和边野古川的日本绒螯蟹样品参考果蝇与蚤状线粒体ＤＮＡ１２ｒＲＮＡ基因片段序列进行了其相同片段的引物设计、ＰＣＲ扩增及序列测定。结果表明冲绳两河川４只日本绒螯蟹的碱基序列完全相同，为４５８ｂｐ，其Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ含量分别为１６０ｂｐ（３４．９４％）、１７９ｂｐ（３９．０８％）、４９ｂｐ（１０．７０％）、７０ｂｐ（１５．２８％）同果与蚤状蚤相同基因片段的序列含量相似。     

运用ITS基因分析大鹏半岛海域石珊瑚系统发育关系

通过ITS基因特异扩增测序,对大鹏半岛海域46种石珊瑚ITS基因片段序列进行了比较分析。结果表明,该片段序列长度在674~806碱基对(bp)之间,A、T含量在40%~55.5%之间,大部分物种的序列碱基A、T含量小于G、C含量。46种造礁珊瑚的平均遗传距离为0.261。采用邻位连接(NJ)和最小进化(ME)法分别构建15种复合型珊瑚的5.8S r DNA系统发育树和28种坚实型珊瑚的ITS2系统发育树,结果显示15种复合型珊瑚的5.8S r RNA序列系统进化聚类结果较符合传统形态学分类结果,而28种坚实型珊瑚的ITS2序列系统进化聚类结果与传统形态学存在较大的差异,提示石珊瑚表型的变异性可能对传统分类存在影响。     

金龟子绿僵菌甘露糖6-磷酸异构酶基因cDNA序列的克隆及分析

通过绿僵菌属甘露糖6-磷酸异构酶基因保守核苷酸区域设计简并性引物,采用RT-PCR及RACE-PCR技术成功克隆了金龟子绿僵菌mpi基因cDNA序列。该基因cDNA序列全长为1 513 bp,开放阅读框长度为1 328 bp,共编码441氨基酸。BLAST分析发现该基因演绎的氨基酸序列与其它真菌同源性较高,蛋白结构分析表明MPI蛋白是较保守的蛋白磷酸酶结构特征,主要由α螺旋和不规则卷曲构成。     

粤西镇海湾近江牡蛎线粒体16S rRNA基因序列变异分析

采用聚合酶链式反应 (PCR)技术对粤西镇海湾水域的近江牡蛎Crassostrearivularis(Gould)群体 2 7个个体的线粒体DNA16SrRNA基因序列片段进行扩增 ,获得大约 5 0 0bp的扩增产物。PCR产物经纯化后进行序列测定 ,经ClustalX同源排序 ,除去引物及部分端部序列 ,得到4 14bp的核苷酸片段。 2 7个个体共检测到 2个变异位点 ,均为颠换位点 ,没发现碱基位点插入、缺失及转换位点 ,共 3种单倍型 ,每个单倍型只有一个碱基的差异。运用DNASP软件计算得该群体的核苷酸多样性和平均核苷酸差异数分别为 0 .0 0 0 36和 0 .14 815。此结果提示镇海湾近江牡蛎群体遗传多样性已很低 ,很有必要从其他分布区引进近江牡蛎亲贝来扩大该种群的遗传多样性     

2种亚洲龙鱼的D—Loop序列结构分析

采用PCR技术对2种亚洲龙鱼的mtDNAD-Loop全序列进行扩增和测序，序列结构分析和序列同源性比对结果表明，2种亚洲龙鱼的mtDNAD-Loop在靠近5’端有3个终止相关序列TAS（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），靠近D-Loop的3’端有4个保守区域CSB1、CSB2、CSB3、CSB—D。在终止相关序列和保守区域之间是连续重复区域。经DNASP4．0软件分析，全序列中检测出多态位点数（S）为26，其中有17个转换，核苷酸多样性（Pi）为0．013，平均核苷酸差异数（K）为17．333。     

勒氏笛鲷(Lutjanus russellii)肌肉生长抑制素基因的克隆与分析

以勒氏笛鲷(Lutjanus russellii)基因组DNA为模板,采用同源克隆的方法,获得2 887 bp的肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因组序列,该MSTN序列具有3个外显子和2个内含子,包括101 bp的5′-UTR、385bp的外显子1、354 bp的内含子1、370 bp的外显子2、761 bp的内含子2、381 bp的外显子3和1 932 bp的3′-UTR。整个开放阅读框编码了378个氨基酸,前面的22个氨基酸为信号肽,具有9个保守的半胱氨基酸及一个RVRR的蛋白酶解加工位点。氨基酸序列分析发现,该基因编码的蛋白质与其他鱼类的I型同源性较高,与其他鱼类的2型MSTN同源性较低,且与鲈形目的同源性最高,与鲤形目的同源性较低,与人、鼠和鸡的同源性最低。采用邻接法(Neighbor-Joining)构建的MSTN的系统发育树表明,勒氏笛鲷MSTN与鲈形目鱼类的狼鲈属亲缘关系较近,且与鱼类的MSTN-1聚为1支。这表明该基因属于Ⅰ型MSTN基因。     

2008年黄河入海口潮间带大型底栖动物生物量研究

于2008年5月(枯水期)和8月(丰水期),分别对黄河入海口潮间带大型底栖动物进行了野外调查与研究。结果表明,底栖动物生物量平均为177.23±55.56 g.m-2,软体动物占据绝对优势;各潮带丰水期底栖动物生物量较枯水期增加,且低潮带>中潮带>高潮带。底栖动物栖息密度平均为573.07±125.60 m-2,软体动物栖占据绝对优势,丰水期底栖动物栖息密度较枯水期升高。四角蛤蜊(Mactra veneriformis)、泥螺(Bullacta exarata)、双齿围沙蚕(Perinereis aibuhitensis)、彩虹明樱蛤(Moerella iridescens)、天津厚蟹(Helice tientsinensis)、青蛤(Cyclina sinensis)、豆形拳蟹(Philyra pisum)、光滑河蓝蛤(Potamocorbula laevis)、托氏昌螺(Umbonium thomasi)和短文蛤(Meretrix pethechialis)等种类的相对重要性指数值较高。     

企鹅珍珠贝Sox9基因的克隆及表达分析

【目的】更好地了解企鹅珍珠贝性别转换机制。【方法】RACE-PCR技术克隆企鹅珍珠贝Sox9基因cDNA的全长序列,分析其理化性质和进化地位;荧光定量PCR技术分析Sox9基因在各组织及不同时期性腺中的表达特征。【结果与结论】Sox9基因cDNA序列全长2 267 bp,其中开放阅读框(ORF)为1 410 bp,编码469个氨基酸。氨基酸序列比对显示企鹅珍珠贝Sox9基因与黑蝶真珠蛤(Pinctada margaritifera)和马氏珠母贝(Pinctada fucata)有高度同源性(81%)。Sox9在企鹅珍珠贝各组织中均有表达,在足中表达量最高(P0.05),精巢中其次;Sox9在成熟期精巢检测到最大表达量(P0.05),在发育早期精巢、退化期精巢和成熟期卵巢中表达量较低,其中发育早期卵巢表达量最低(P0.05)。     

粤西镇海湾近江牡蛎线粒体16S rRNA基因序列变异分析

采用聚合酶链式反应(PCR)技术对粤西镇海湾水域的近江牡蛎Crassostrea rivularis (Gould)群体27个个体的线粒体DNA16S rRNA基因序列片段进行扩增，获得大约500bp的扩增产物。PCR产物经纯化后进行序列测定，经Clustal X同源排序，除去引物及部分端部序列，得到414bp的核苷酸片段。27个个体共检测到2个变异位点，均为颠换位点，没发现碱基位点插入、缺失及转换位点，共3种单倍型，每个单倍型只有一个碱基的差异。运用DNASP软件计算得该群体的核苷酸多样性和平均核苷酸差异数分别为0．00036和0．14815。此结果提示镇海湾近江牡蛎群体遗传多样性已很低，很有必要从其他分布区引进近江牡蛎亲贝来扩大该种群的遗传多样性。     

草鱼种质退化相关SRAP分子标记的筛选

采用相关序列扩增多态性（sequence-reared amplified polymorphism，SRAP）技术分析野生草鱼和家养草鱼，并筛选与草鱼种质退化相关的分子遗传标记。共进行88对引物组合的检测，产生标记数目共计905个。依据标记在群体中出现的频率和变化规律，共筛选出21个可能与种质相关的特异性标记，对这些特异性标记进行测序并将测序结果进行BLAST分析，发现测得片段中有8个片段能在GeneBank中找到同源性较高的序列，而其他片段与数据库中序列的相似性较低。     

3种星虫线粒体16S rRNA、COⅠ和Cyt b基因片段的序列比较

对裸体方格星虫（Sipunculus nudus）、可口革囊星虫（Phascolosoma esculenta）和澳洲管体星虫（Siphonosoma australe）的线粒体16S rRNA、COⅠ和细胞色素b（Cyt b）基因片段序列进行比较,并对其系统发生进行了初步探讨.采用PCR方法得到总长度分别为531～544 bp（16S）、652～675 bp（COⅠ）和406～453 bp（Cyt b）的线粒体片段.片段碱基A＋T比例较高（16S rRNA基因58.3%,COⅠ基因56.9%,Cyt b基因59.5%）. 16S rRNA片段存在169个碱基变异位点（其中包括167个简约信息位点）和44个碱基插入/缺失,种内个体间变异较小;COⅠ片段有512个碱基（333个简约信息位点）存在变异,79个碱基插入/缺失;Cyt b片段存在347个碱基（318个简约信息位点）变异位点,16个碱基插入/缺失.数据分析结果支持3种星虫和环节动物的分类地位较近,与软体动物较远的分类观点.此外,裸体方格星虫与澳洲管体星虫之间亲缘关系较近（D=0.3159、03156、0.2361）.认为3种星虫线粒体16S rRNA、COⅠ和Cyt b基因在种间存在明显的多态性,证实了三种基因序列均普遍适用于星虫种及以上阶元的系统学分析.     

马氏珠母贝热休克蛋白HSP60基因的克隆与表达分析

运用cDNA末端快速扩增（RACE）技术,克隆马氏珠母贝（Pinctadamαrtensii）热休克蛋白HSP60基因 cDNA全序列。序列全长2495坤,开放阅读框（ORF） 1734坤,编码577个氨基酸,预测的分子量约为61.79阳, 理论等电点为5.4905＇非翻译区（ 5＇UTR）长150坤, 3＇非翻译区（3＇UTR）长611 bp。同源性比对分析结果,马 氏珠母贝HSP60基因与与太平洋长牡妨（Crωsos仰a gIgω）和光滑双蹄螺（Biomphalaria glabrata）的同源性较 高,达到75%。氨基酸序列分析显示,马氏珠母贝HSP60氨基酸序列具有典型的rnt-HSP60特征序列、C-末端典型的GGM重复基序和一个ATP结合结构域。荧光定量数据分析发现,该基因在闭壳肌、外套腹、血淋巴、肝膜腺、性腺、躁、等6个组织中具有表达,在肝膜腺中表达量最高,腮中次之,而在血液和闭壳肌中仅有少量表达;在脂多糖剌激后,该基因表达水平上调,12 h后达到最大值,之后又逐渐下调,均高于对照组,差异具统计学意 义（P〈0.05）。     

斜带石斑鱼氨基酸转运载体B~0AT1基因的克隆和组织表达

为研究斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)氨基酸转运吸收机制,采用RACE-PCR技术克隆得斜带石斑鱼氨基酸转运载体B~0AT1(SLC6A19)基因的c DNA部分序列,分析该基因在斜带石斑鱼的组织分布。结果表明,所克隆的该部分序列长度为610 bp,包括88 bp的5′非翻译区(5′UTR)、编码174个氨基酸、长度522 bp的开放阅读框(ORF)。分子进化聚类和同源性分析显示,斜带石斑鱼与鲈鱼(Dicentrarchus labrax)同源性较高,为93%。SLC6A19基因在斜带石斑鱼8个组织中分布广泛,其组织表达量由高到低依次是肝脏、肌肉、脑、肾脏、前肠、中肠、后肠和心脏,肝脏和肌肉中SLC6A19 mRNA表达高于其余各组织(P0.05),心脏和后肠SLC6A19m RNA表达量低于其余各组织(P0.05)。     

口蹄疫病毒VP1植物表达载体的构建

P1-T重组质粒上含有口蹄疫病毒(FMDV)GD10分离株的p1 cDNA片段，以此为模板，用PCR方法扩增其中的VP1基因，获得大小约640bp的片段。该片段用BglⅡ和BstEⅡ酶切消化后克隆至表达载体pCAMBIA1305．2，转化Ecoli TOPIO感受态细胞。重组质粒经PCR、酶切及序列分析，证实VP1基因处于CaMV35S启动子控制，且读码框正确。     

荧光分光光度法测定海洋生物中的谷胱甘肽

对应用荧光分光光度法测定海洋生物中还原型谷胱甘肽（GSH）含量的方法进行了研究，并测定了分属于鱼、虾、贝、藻的10种海洋生物中谷胱甘肽的含量。利用邻苯二甲醛与GSH反应构成的荧光体系，在激发波长为365nm，发射波长为425nm的条件下，方法的回收率为99．22％-99．69％，变异系数为2．16％。应用此方法测得10种海洋生物中谷胱甘肽的含量为：红笛鲷（Lutjanus sanguineus）0．399mg／g，银鲳（Pampus argenteus）0．352mg／g，大海鲢（Megalops cyrinoides）0．561mg/g，尖紫蛤（Sanguinolaria acuta）0．289mg/g，菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarun）0．287mg／g，墨吉对虾（Penaeus merguiensis）0．892mg／g，凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）1．434mg／g，囊藻（Colpomenia sinuose）0．221mg／g，石莼（Ulva lactucal）0．727mg／g，马尾藻（Sargassum muticum）0．137mg／g。