寄生性病原血卵涡鞭虫(Hematodinium sp.)感染山东半岛养殖梭子蟹的初步研究

寄生性病原血卵涡鞭虫(Hematodinium sp.)逐渐成为危害我国沿海养殖三疣梭子蟹、锯缘青蟹、脊尾白对虾等蟹虾类的致病性病原。为研究血卵涡鞭虫在我国北方的感染、流行情况,2012年7—11月间,作者从山东半岛三疣梭子蟹的主要养殖区域和邻近海域随机采集梭子蟹样品,进行了血淋巴、组织病理、电镜和分子生物学检测,首次在从胶南和莱州湾养殖区采集的梭子蟹中发现了血卵涡鞭虫感染。在感染血卵涡鞭虫的梭子蟹血淋巴中,共发现了该寄生性病原的四个生活史阶段:丝状滋养体、单细胞滋养体、滋养体聚合体和多核孢子体;该区域发现的血卵涡鞭虫(Hematodinium sp.)形态上与其他报道Hematodinium spp.类似,与在我国东南沿海报道发现的血卵涡鞭虫有亲密的遗传关系;人工感染实验表明该寄生性虫具感染性并对宿主的主要器官造成显著的病理变化。该研究表明血卵涡鞭虫感染养殖蟹类不仅局限于我国东南沿海,在我国北方的养殖蟹类中也存在;这些养殖区普遍采用的混合养殖模式可能一定程度上加剧了该寄生性病原的传播、扩散,因此其传播扩散方式亟需进一步调查研究。     

血卵涡鞭虫在养殖锯缘青蟹中的寄生

利用光镜和电镜对2005年9月浙江三门湾地区某养殖场发生的养殖锯缘青蟹规模性死亡病蟹进行观察，并对病原进行分子生物学鉴定。组织病理学研究发现，病蟹蟹体消瘦，肌肉白浊，头胸甲内可见大量乳白色液体，血淋巴细胞的量急剧减少，代之以大量寄生原虫，该原虫在病蟹的肝胰腺、鳃、心脏、肌肉等部位大量寄生，引起这些组织发生以坏死为主的变质性病变。电镜下，乳白色液体及病变组织内可见大量寄生虫体，其形态特征、内部结构及宿主表现的症状，与血卵涡鞭虫相类似。采用Small等^[5]的血卵涡鞭虫ITS特异引物，扩增出分子量为300bp左右的条带，并对其进行了测序及序列相似性比较，确定该寄生原虫为一种血卵涡鞭虫Hemntodinium sp。血卵涡鞭虫是海水甲壳类的重要病原寄生虫，我国尚未有该寄生虫病的研究报道，文中首次发现其在养殖锯缘青蟹中的寄生，为靳一步研究该寄生虫病积累了资料。     

海水甲壳类寄生性病原血卵涡鞭虫(Hematodinium spp.)研究进展

血卵涡鞭虫(Hematodinium spp.)是一类危害海水甲壳类的致病性寄生性甲藻,在世界范围内严重威胁了多种重要经济甲壳类的渔业生产。近年来,血卵涡鞭虫先后在我国浙江、广东沿海的锯缘青蟹、三疣梭子蟹、脊尾白对虾等重要养殖甲壳类中被报道发现,并已确定该寄生病原是近年来引起当地养殖青蟹"黄水病"、三疣梭子蟹"牛奶病"和脊尾白对虾大规模死亡的主要病原之一。本文结合作者近年来关于Hematodinium spp.的研究成果,系统综述了国内外该寄生性病原的研究进展,包括其系统分类、生活史、传播途径、发生机制等;并针对目前该寄生性病原研究中存在的关键问题,结合我国相关研究现状做出了分析和展望,以期为我国海水甲壳类血卵涡鞭虫流行病的预防与控制提供理论依据和技术支持。     

血卵涡鞭虫感染三疣梭子蟹的病原形态学及组织病理学变化

血卵涡鞭虫是一类主要感染海产甲壳类的致病性寄生性甲藻。近年来,该寄生性病原在我国沿海主要经济蟹类养殖区域流行性发病,给当地蟹类养殖业造成了严重经济损失。为厘清血卵涡鞭虫的生活史形态,了解宿主的病理损伤机制,本文通过血涂片法和HE染色法系统研究了感染过程中该寄生虫的形态变化和宿主的组织病理变化。结果表明,血卵涡鞭虫在感染过程中经历丝状滋养体、单核/双核/多核滋养体、团聚体、蛛网状滋养体、孢子前细胞及孢子等不同生活史阶段。感染导致三疣梭子蟹发生系统性病理变化,肝胰腺、心脏、鳃、肌肉等器官和组织在不同感染阶段均发生相应程度的组织病理变化,主要表现为体细胞破损或坏死、细胞间隙模糊、疏松结缔组织充斥大量寄生虫细胞。最终由于寄生虫在宿主主要器官组织间隙内大量增殖,导致重度感染的梭子蟹器官或组织功能破坏、丧失而死亡。     

日照沿海养殖三疣梭子蟹血卵涡鞭虫流行病发生过程研究

血卵涡鞭虫(Hematodinium spp.)是一类严重危害海洋甲壳类动物的新型寄生性病原,可引发养殖三疣梭子蟹“牛奶病”,导致梭子蟹大量死亡,造成巨大经济损失。目前,对于血卵涡鞭虫在日照养殖梭子蟹中的流行发生情况还未见报道,2020年8月和2021年5～11月期间在日照主要梭子蟹养殖区开展流行病学调查研究,通过形态学观察、组织病理检测和分子生物学鉴定发现了血卵涡鞭虫(Hematodinium perezi)在日照地区的流行分布,并发现其流行病发生在6～9月间,高发期为7～8月,感染率高达52.5%。感染宿主的血淋巴和心脏、肝胰腺、鳃、肌肉等组织中发现了丝状滋养体、类变形虫滋养体、蛛网状滋养体、团块状聚合体、孢子前细胞和孢子等血卵涡鞭虫的多个生活史阶段。在养殖池塘环境水体中检测到血卵涡鞭虫存在,水体中血卵涡鞭虫丰度与宿主感染率存在错峰现象,间隔3～4周。流行病的发生与水体温度和盐度变化密切相关,7～8月较高的水温(26.2～28.6°C)促进了血卵涡鞭虫在宿主体内快速增殖及流行病爆发,而较低的盐度(20.7～25.3)可能抑制了环境水体中血卵涡鞭虫的存活及其传播扩散。以上研究结果初步...     

干露胁迫对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)HSP70和ferritin基因表达的影响

采用常规急性实验方法,研究了不同干露胁迫条件对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)成活率的影响。结果表明,保持虾体湿润并用冰块降温的P组干露胁迫12h后成活率为75%,显著高于其它各实验组(P<0.05)。采用实时荧光定量PCR方法研究了不同干露胁迫条件对脊尾白虾血细胞和肝胰腺组织中热休克蛋白70(HSP70)和ferritin基因表达的影响。干露胁迫能诱导脊尾白虾血细胞、肝胰腺HSP70基因的表达上调,肝胰腺中的高表达时间相对血细胞中出现的较早;干露胁迫能诱导湿润低温P组脊尾白虾血细胞和肝胰腺ferritin基因的表达上调,并显著高于对照组(P<0.05),而且各组织ferritin基因表达的上调时间具有差异性,血细胞最先上调。其余实验组脊尾白虾各组织ferritin基因表达均下调,并显著低于对照组(P<0.05)。上述结果表明,在脊尾白虾受干露胁迫的耐受范围内,HSP70和ferritin基因发挥抗氧化功能。     

白斑综合征病毒对脊尾白虾的致病性研究

2010年、2011年江苏沿海多数地方海水养殖中发生了脊尾白虾大规模死亡的现象,本课题通过对患暴发性流行病的脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)进行病毒分子生物学检测,发现病虾体内白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,简称WSSV)检测普遍呈阳性;应用发病虾组织制备的病毒粗提液,进行了人工感染实验,实验表明该病毒对脊尾白虾具有较强的致病性,可引起68.5%的死亡率。电镜结果表明,发病虾与感染病虾鳃及肝胰脏等组织器官都发生了相同的细胞病理变化,主要表现为细胞核内染色质边聚、线粒体肿胀、内嵴消失等一系列细胞病理变化,在其细胞核与细胞质中发现了具有单层囊膜结构的对虾白斑综合征病毒粒子,病毒粒子大小约为(130~170)nm×(305~405)nm,核衣壳呈子弹形,一端较细另一端较粗,完整病毒粒子由核心、衣壳和囊膜构成,分子生物学实验表明该病毒为WSSV。实验结果符合柯赫氏法则,可以初步推断WSSV感染脊尾白虾并与引发的大规模死亡有着直接关系。     

脊尾白虾酚氧化酶原基因克隆及表达分析

利用RACE方法获得了脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)酚氧化酶原(Prophenoloxidase,proPO)基因。该基因cDNA全长3092bp,开放阅读框2013bp,编码671个氨基酸,其预测分子量为74.82kDa。脊尾白虾酚氧化酶原基因推导的氨基酸序列与其他虾类酚氧化酶原氨基酸序列同源性较高(65%—78%),该氨基酸序列具有铜离子结合位点等酚氧化酶原基因所具有的典型特征位点。组织表达分析结果表明,proPO基因在脊尾白虾血细胞中表达量最高,其次是鳃和肝胰腺组织,在肌肉中几乎不表达。利用荧光定量PCR分析了不同盐度胁迫下脊尾白虾血细胞和鳃组织中的表达变化规律,结果发现在不同盐度胁迫后血淋巴proPO表达量显著高于对照组,盐度胁迫初期鳃组织proPO表达量显著高于对照组。本研究结果表明脊尾白虾酚氧化酶原基因参与了盐度胁迫引起的机体应激反应。     

白斑综合症病毒(WSSV)的宿主调查

用地高辛 (DIG)标记的WSSVDNA探针斑点杂交与原位杂交技术 ,在中国对虾、斑节对虾、南美白对虾、刀额新对虾、脊尾白虾、天津厚蟹、日本大眼蟹体内检测到了WSSV ,它们是WSSV的天然宿主 ;在经人工感染的哈氏美人虾、短脊鼓虾、克氏原螯虾、肉球近方蟹、滕壶体内检测到了WSSV ;在球形侧腕水母、病虾池的桡足类等浮游生物、卤虫无节幼体以及人工浸泡感染卤虫成体体内没有检测到WSSV。经原位杂交检测 ,虾类的甲壳下上皮、胃上皮、附肢、造血组织、鳃等组织器官均可被WSSV侵染 ,其中甲壳下上皮和鳃对WSSV敏感 ;蟹类的甲壳下上皮和鳃对WSSV敏感 ;在中国对虾、南美白对虾、脊尾白虾、注射感染的克氏原螯虾的精巢中 ,精荚的结缔组织细胞和血细胞呈阳性 ,在中国对虾、脊尾白虾以及注射感染的短脊鼓虾的卵巢中 ,结缔组织细胞和滤泡细胞被WSSV感染。     

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)血卵涡鞭虫病的流行病学分析

为解析拟穴青蟹(Scylla paramamosain)血卵涡鞭虫病的流行病学特征,于2012年4—11月采用跟踪监测和实地调查的方法,结合病原分离鉴定及病蟹的病理学观察,统计分析了浙江省温州地区养殖拟穴青蟹血卵涡鞭虫病的流行情况。结果表明,患病拟穴青蟹的肝胰腺、肌肉、鳃等组织病理显示有大量血卵涡鞭虫侵染,并能用PCR方法快速检出。温州地区养殖拟穴青蟹血卵涡鞭虫病在每年5—11月均有发生,7—9月为集中发病时间,死亡高峰出现于8—9月之间,年份间(2010—2012)与发病率无相关性,而不同月份对病害的发生有极显著影响(P0.01)。不同发育阶段以脱壳期的发病率相对较高,发病蟹的规格主要以50g以下的幼蟹和250g以上的成蟹为主。拟穴青蟹血卵涡鞭虫病的发生与水温(r=0.756)和盐度(r=0.631)变化关系较密切,夏、秋季节受梅雨、台风影响而引起水温和盐度的剧烈变化可能是暴发血卵涡鞭虫病的诱发因素。     

真鲷（Pagrus major）vasa基因5′端启动子克隆及表达载体构建

采用染色体步移（Genome walking）的方法克隆了真鲷vasa基因5′侧翼序列,采用生物信息学方法分析潜在的顺式作用元件,并与斑马鱼核心启动子进行比对,在此基础上构建了绿色荧光蛋白表达载体。序列分析结果显示：克隆得到的真鲷vasa基因5′侧翼序列序列长度为2762bp,其中包括TATA-box、CAAT-box...     

黄海小型水母的分布特征

根据"973"项目2000年10月—2007年8月浮游生物大网样品,对黄海小型水母类的种类组成及其丰度的时空变化进行了研究,讨论了各优势水母种类在黄海的分布格局。结果表明,黄海测区内小型水母整体丰度较低,且主要分布在50m等深线以浅海域,各小型水母类群如水螅水母类,管水母类和栉水母类以及10种优势种类的季节更替非常明显。与其它海域相比,黄海小型水母丰度水平最低,平均为0.8ind/m3,占整个浮游动物丰度的比例小于0.5%,因此从丰度上看,小型水母在黄海浮游动物功能群中并不占优势。     

辽东湾北部近海大型水母数量分布和温度盐度特征

通过2009-2011年5月下旬-7月下旬辽东湾北部近海10m等深线内的大型水母调查数据,分析了辽东湾北部近海近三年中大型水母资源状况,并探讨了辽东湾大型水母的生态类型。结果显示:辽东湾北部近海大型水母种类主要有海蜇(Rhopilema esculentum)、沙蜇(Nemopilema nomurai)、白色霞水母(Cyanea nozakii)、海月水母(Aurelia sp.1),海蜇和沙蜇是优势种。海蜇幼水母阶段主要集中分布在5m等深线以内的近岸河口水域,随着个体增大有略向深水或密度较小的水域扩散的趋势,仍主要分布在5m等深线两侧水域,属于高温低盐种类。6月份调查海区中发现大量的沙蜇幼水母,随着沙蜇个体增大,7月份调查海区中沙蜇数量大幅度减少。辽东湾海月水母在南部海域出现较多,2010、2011年在北部近海部分海域出现。白色霞水母近几年来辽东湾出现较少,栖息在盐度较高的水域。辽东湾各种大型水母中,沙蜇的生长速度最快。辽东湾海蜇幼水母、沙蜇幼水母的海区出现时间要晚于黄、东海。     

鳕鱼(Gadous macrocephaius)皮水解蛋白亚铁修饰对大鼠营养性贫血改善的实验研究

以鳕鱼皮为原料,采用双酶水解法制备鱼蛋白水解物再经亚铁修饰获得鱼蛋白水解物亚铁复合物(Fe-FPH),并对Fe-FPH进行了抗营养性贫血的实验研究。结果表明:(1)以水解度(DH)为5%的鱼蛋白水解物为原料,在pH7.0、温度20℃、螯合时间15min的条件下可获得Fe-FPH6.7%;(2)Fe-FPH蛋白含量为85.1%,铁含量达40254mg/kg,氨基酸价为59.62;(3)抗营养性动物实验研究表明:Fe-FPH给药组第5天可显著提高营养性贫血大鼠的Hb含量,第11天时表现出极显著效果;Fe-FPH组,第11天有显著降低大鼠血中PPIX作用,到第18天时表现出极显著效果。因此,Fe-FPH不仅含有较高的营养价值,而且有显著抗营养性贫血功能,可望成为鳕鱼加工副产物高效利用的有效途径。     

河流弧菌(Vibrio fluvialis)对大黄鱼( Pseudosciaena crocea ) 鳃粘液粘附特性研究

采用间接ELISA法(最低检测值约104cfu)研究不同培养条件、不同培养阶段、抗体处理、营养饥饿等对河流弧菌粘附作用的影响。结果表明,经TSB培养的菌体的粘附作用极显著强于TSA培养的菌体的粘附作用(P<0.01);河流弧菌能很好地粘附于大黄鱼粘液,粘附量随菌浓度升高而增大并符合饱和粘附动力学:y=0.1782ln(x)1.6923(R2=0.9810);不同生长阶段河流弧菌的粘附能力不同,在培养初期阶段细菌的粘附量先是随着培养时间的延长而增大,并在培养24h后粘附量达到最大,而后随着培养时间的延长其粘附量急剧下降;抗体处理后河流弧菌的粘附量显著低于对照组(P<0.05);营养饥饿菌体的粘附量明显降低。以上结果表明:海水中的河流弧菌能很好地粘附于大黄鱼鳃粘液,其粘附作用受细菌培养条件、营养状况等自身因素的显著影响。本研究结果有助于了解河流弧菌的流行病学和致病机理。     

日本对虾(Penaeus japonicus)病原需钠弧菌(Vibrio natriegens)表型与分子特征及LAMP检测方法的建立

采用常规表观生物学特性及16S rRNA、gyrB及rpoA基因同源性检索与系统发育学分析等方法,对分离自江苏连云港某育苗场的大批死亡日本对虾蚤状幼体的优势生长菌进行了综合鉴定。结果表明,其形态和生理生化特征与弧菌属的需钠弧菌相近;16S rRNA、gyrB及rpoA基因同源性检索也均与需钠弧菌相似性最高,分别为98%、89%和95%,且三种基因的NJ系统发育树也均与需钠弧菌聚为一个分支;分离菌的致病性试验表明其半数致死量LD50为1.8×106CFU/ml。综合分离菌的致病性、形态与生理生化特征及基因同源性与系统发育分析结果,认为引起日本对虾蚤状幼体大批死亡的病原为需钠弧菌。基于gyrB基因序列设计1套LAMP特异性引物,建立了需钠弧菌的快速特异性检测方法,可用于由需钠弧菌引起的水产动物疾病的诊断及分子流行病学的调查研究。     

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)源美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)的分离鉴定及致病性研究

于2010年从宁德患病大黄鱼中分离得到一株优势菌NPL1006,经鉴定该菌株为美人鱼发光杆菌。人工感染实验结果显示该菌对大黄鱼的半致死浓度(LD50)为7.96×103CFU/g体重。药敏性实验结果显示NPL1006对头孢唑啉、头孢噻吩和诺氟沙星等9种药物高度敏感。采用纸片法检测得到NPL1006的胞外产物具有蛋白酶、明胶酶和淀粉酶活性。胞外产物感染斑马鱼研究结果显示其LD50为1.20mg蛋白/kg体重。以上结果表明大黄鱼源美人鱼发光杆菌NPL1006胞外产物含有多种毒力因子,与该菌对大黄鱼的致病性密切相关。     

细鳞鲑(Brachymystax lenok)与哲罗鲑(Hucho taimen)的血液学比较研究

对细鳞鲑和哲罗鲑的全血、血浆的理化特征及生理功能进行比较研究,结果表明,在8周的同等养殖条件下,细鳞鲑与哲罗鲑的SGR和DWG不存在显著性差异(P>0.05),均属健康状态下生长。血液生理学方面,细鳞鲑和哲罗鲑的红细胞形态均呈椭圆,细胞核呈长椭圆形;红细胞核体积分别为(50.12±7.85)μm3和(66.25±10.21)μm3。细鳞鲑与哲罗鲑的RBC、Hb、Hct、MCV和RDW存在显著差异(P<0.001),哲罗鲑的MCHC显著高于细鳞鲑的(P<0.01);这些血液生理学数据表明,细鳞鲑和哲罗鲑的耐低氧能力较弱。血液生化方面,细鳞鲑与哲罗鲑的Na+、P、AST、TG和CHOL存在显著性差异(P<0.05),且这几项指标前者均大于后者,这两种鱼的剩余其它生化指标均不存在显著性差异(P>0.05);血清底物浓度在正常范围内,AST和ALT可作为细鳞鲑和哲罗鲑的肝细胞损伤的特异性指标,且细鳞鲑的肝脏更容易受到损伤。     

利用ND1、ITS1序列研究三种背角无齿蚌（Anodontawoodiana）分类学问题

利用ND1、ITS1序列差异对采自太湖、在形态上被认为是背角无齿蚌、圆背角无齿蚌、椭圆背角无齿蚌的三种个体进行鉴定,并与从NCBI中下载到的同属不同种褶纹冠蚌的ND1、ITS1序列进行对比,分析了基于Kimura2-parameter模型参数得到的遗传距离,并构建了NJ树。结果表明,本研究中所有背角无齿蚌种间遗传距离变...     

化学诱变剂在实验海洋食物链中的流动以及遗传毒性的检测

于１９８９年３月－１９８９年９月，利用极谱测定法研究了无机诱变剂Ｃｄ在３级实验食物（链从褐指藻经中国对虾至欧氏六线鱼）中的传递，并对积累Ｃｄ的中国对虾和欧氏六线鱼肌肉和内脏灰样进行了紫露草微核测定。结果表明，Ｃｄ浓度在传递中依次减少；经过６ｄ喂食，Ｃｄ从褐指藻到中国对虾的传递比例为６６．６％；经过７ｄ喂食，Ｃｄ从中国对虾到欧氏六线鱼的传递比例为２９．９％。ｔ测验发现，处理组对虾内脏灰样与肌肉灰样之