二温式RT-PCR检测对虾Taura综合征病毒的研究

设计了一对能扩增大小为231bp对虾Taura综合征病毒(TSV)某段基因的特异性引物,优化建立了能快速检测TSV的二温式RT-PCR。特异性和敏感性试验结果表明。二温式RT-PCR能对3个试验用TSV毒株的RNA进行扩增,并得到与预期大小一致的231bp的扩增产物,而其它3种对虾病原则无相同大小的特异性扩增产物出现;RT-PCR最低能检测到1pg的TSV RNA。应用RT-PCR对320份分别来自广西沿海不同对虾养殖场的对虾样品进行检测,结果共有85份检出TSV。说明TSV在广西沿海地区养殖对虾中已呈现出区域性流行趋势。同时也显示了RT-PCR在TSV临床检测中具有较高的实用性。     

对虾急性肝胰腺坏死综合症研究进展

近年来,对虾急性肝胰腺坏死综合症(Acute hepatopancreas necrosis syndrome,AHPNS)在亚太对虾重要养殖区流行,引起国际范围广泛关注,已成为当前养殖对虾重要疾病之一。本文就AHPNS的发生与流行特点、发病症状、病理特征、病因及防控措施方面进行了概述与分析,为今后进一步深入开展AHPNS研究提供参考。     

天津地区养殖鲤鱼(Cyprinus carpio)鲤浮肿病毒(CEV)PCR检测与人工感染试验

对2015—2016年天津地区鲤鱼养殖场采集的发生鲤浮肿病毒(CEV)/锦鲤睡眠病(KSD)的鲤鱼样品,进行套式PCR检测和人工浸泡感染试验,并测定养成期鲤鱼感染率。实验观察研究发现,所采集样品均表现为体色发黑,头部上方颅骨软组织周围皱缩,眼球凹陷,鳃粘脏,黏液较多,常滞游于浅水区水面。套式PCR检测结果显示全部10个样品均出现特异性目的条带,为CEV阳性。目的产物测序后经NCBI BLAST,与已报道的CEV相关序列相似性介于85%—99%;系统发育树分析显示样品编号JY1856与JY1650位于同一分支,与已知CEV病毒株亲缘关系较近,而其余8个样品位于同一分支,与已知CEV病毒株亲缘关系较远。通过人工浸泡感染健康鲤鱼,半数致死时间为55d,累计死亡率为71.1%±3.2%,并从试验感染鱼组织中检测到CEV病毒DNA。养成期鲤鱼CEV携带率为77.5%。以上结果表明,天津地区养殖鲤鱼中存在CEV感染,揭示了我国鲤鱼养殖产业可能面临新的疫情,需引起养殖业的高度重视。     

白斑综合征病毒对脊尾白虾的致病性研究

2010年、2011年江苏沿海多数地方海水养殖中发生了脊尾白虾大规模死亡的现象,本课题通过对患暴发性流行病的脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)进行病毒分子生物学检测,发现病虾体内白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,简称WSSV)检测普遍呈阳性;应用发病虾组织制备的病毒粗提液,进行了人工感染实验,实验表明该病毒对脊尾白虾具有较强的致病性,可引起68.5%的死亡率。电镜结果表明,发病虾与感染病虾鳃及肝胰脏等组织器官都发生了相同的细胞病理变化,主要表现为细胞核内染色质边聚、线粒体肿胀、内嵴消失等一系列细胞病理变化,在其细胞核与细胞质中发现了具有单层囊膜结构的对虾白斑综合征病毒粒子,病毒粒子大小约为(130~170)nm×(305~405)nm,核衣壳呈子弹形,一端较细另一端较粗,完整病毒粒子由核心、衣壳和囊膜构成,分子生物学实验表明该病毒为WSSV。实验结果符合柯赫氏法则,可以初步推断WSSV感染脊尾白虾并与引发的大规模死亡有着直接关系。     

对虾白斑综合征病毒(WSSV)宿主研究进展

对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)自1992年暴发以来,已在世界范围内传播开来,每年给对虾养殖业造成巨大经济损失,至今仍未得到完全控制。本文根据1995～2005年的有关文献资料,综述了对虾白斑综合征病毒宿主方面的研究进展。     

水体中添加两种菌剂对凡纳滨对虾存活、生长及消化酶活力的

向水体中添加不同浓度的短小芽孢杆菌CGMCC 1004(Bacillus pumilus)和胶红酵母菌CGMCC 1013(Rhodotorula mucilaginosa)以研究凡纳滨对虾(Litoenaeus vannamei)体长、体质量、存活率、胃蛋白酶、肝胰腺淀粉酶和肝胰腺脂肪酶的影响,以及需钠弧菌(Vibrio natriegens)的感染效果.结果表明:向水体中添加104CFU/mL短小芽孢杆菌能提高对虾体长、存活率,但结果不显著,但对体质量增长率具有显著提高作用;水体中添加104CFU/mL短小芽孢杆菌对提高需钠弧菌感染后对虾成活率有一定的提高作用;水体中添加104CFU/mL短小芽孢杆菌能显著提高胃蛋白酶活性,但是对肝胰腺淀粉酶活性有一定抑制作用;添加复合菌剂比添加单一菌种的作用要好;亦证明了向水体中添加细菌的方式对凡纳滨对虾的体长、体质量、存活率以及水质指标影响比较小,但是对消化酶具有一定的提高作用.     

中国明对虾精氨酸激酶与白斑综合征病毒结构蛋白VP31的作用初探

白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是危害对虾的主要病原,给全球水产养殖业带来了巨大经济损失。为研究阻断WSSV的途径,前期研究WSSV与宿主相结合的受体蛋白发现,白斑综合征病毒囊膜蛋白VP31可以与中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)精氨酸激酶(FcAK)发生结合作用。精氨酸激酶(AK)通过调节无脊椎动物体内磷酸精氨酸与三磷酸腺苷(ATP)之间平衡在能量代谢、储存和利用方面具有重要作用。作者通过重组表达的rFcAK与rVP31的far-Western blotting分析,证实两者有结合作用,此外,rFcAK还与WSSV的VP19、VP28等6种结构蛋白有结合作用。双向电泳分析观察到,rFcAK与rVP31的磷酸化反应后,rVP31部分发生pI降低现象,提示rVP31可能发生了磷酸化。生物信息学分析表明VP31存在21个精氨酸残基,FcAK具有12个精氨酸结合位点,这可能为VP31和FcAK的结合活性提供了靶位。为进一步研究WSSV与宿主结合机理及阻断感染的机制提供思路。     

地衣芽孢杆菌De株之胞外产物对凡纳滨对虾淀粉酶活性影响的体外研究

试验以半透膜法收集地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)De株的胞外产物(extracellular products,ECP),以匀浆离心法提取凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)成虾的肝胰腺和肠道消化酶,将芽孢杆菌胞外产物和对虾消化酶按体积比10∶90混合,采用体外分析法研究在不同温度、pH及胞外产物添加量等条件下胞外产物对对虾淀粉酶活性的影响.试验共设A、B、C、D、E 5个试验组,每组三个平行.其中空白组A为地衣芽孢杆菌的胞外产物,试验组B、C组分别为添加了胞外产物的对虾肝胰腺消化酶、肠道消化酶,对照组D、E分别为未添加胞外产物的对虾肝胰腺消化酶和肠道消化酶样品.温度为20～40℃时试验组B、C的淀粉酶活性要明显高于对照组(p＜0.05),其中肝胰腺淀粉酶和肠道淀粉酶的活性分别提高了25.9%和19.3%,但该温度要远低于芽孢杆菌胞外淀粉酶的最适温度60～90℃.在pH为5～6时,试验组B、C的淀粉酶活性明显高于对照组(p＜0.05),对虾肝胰腺淀粉酶和肠道淀粉酶的活性分别较对照组提高了33.3%和122.2%,而该pH同样要低于芽孢杆菌胞外淀粉酶的最适pH值(6～9).此外,研究还表明试验组的淀粉酶活性随胞外产物添加量的升高而降低,即胞外产物在一定条件下可能抑制对虾内源淀粉酶的生物学活性.从本研究看,地衣芽孢杆菌胞外产物在一定程度上可促进对虾的淀粉酶活性,而当胞外产物活性高于0.02 U/mg蛋白质时,对虾淀粉酶活性将受到抑制.     

对虾白斑综合征病毒分子生物学研究进展

对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus．WSSV)是引起对虾白斑综合症的主要病原。对虾白斑综合症于20世纪90年代初首先在中国台湾地区发生,1994年扩展到整个亚洲的对虾养殖地区。1995年11月,西半球首先发现该病毒,1999年美国中部和南部也有类似的报道。2001年欧洲和澳洲都检测到了WSSV。短短10余年,对虾白斑综合症席卷了全球的对虾养殖地区,给世界对虾养殖业造成了不可估量的损失。     

对虾一种无包涵体杆状病毒病原的PCR检测

为建立对虾无包涵体杆状病毒的快速诊断技术,应用PCR技术分别对暴发性流行病发生前、流行中和发病后的对虾样品进行了检测.根据已克隆的对虾杆状病毒部分基因组序列而设计的引物能特异性地扩增出靶DNA片段,最低可以检测1pg的病素DNA.由典型发病症状对虾的胃、腮、肝胰腺、中肠、游泳足、肌内和心脏等器官和组织中成功地检测到病毒.不同组织和器官经扩增得到的信号强弱不同:病虾的胃扩增得到的信号最强,中肠、肌肉、心脏和游泳足次之,腮和肝胰腺信号最弱,说明病毒在不同组织和器官中数量及感染程度不同.在对虾发病前及发病后,用二次PCR还能检测表面不发病呈隐性感染状态的对虾携带的病毒;而对野生健康虾的检测结果为阴性.研究表明,PCR是检测对虾暴发性流行病快速、灵敏而准确的方法,对病毒病的早期诊断、防治和高健康对虾品种的选育具有指导意义.     

凡纳滨对虾造血激素的组织分布及细胞定位分析

造血激素（astakine）是一种具有促进造血组织细胞分化和增殖作用的甲壳动物细胞因子,参与甲壳动物的造血活动,对于只依赖于非特异性免疫的甲壳动物抗感染能力有重要的意义。本实验室前期成功克隆凡纳滨对虾造血激素（LvAST）的基因Lvast。为了进一步了解其功能,本文通过实时荧光定量PCR技术检测了Lvast表达的组织分布,同时还用Dlight标记抗LvAST抗体进行了LvAST在对虾细胞和组织中的免疫荧光定位分析。荧光定量PCR测定结果说明,Lvast主要在肝胰腺、鳃和肌肉中大量表达,而淋巴器官和血淋巴细胞中表达量较低;免疫荧光结果显示,LvAST可同时存在于血淋巴细胞内和血淋巴细胞膜表面,不同的血淋巴细胞表面的LvAST分布呈现出明显差异,可能具有重要的血细胞分类意义。LvAST的蛋白在肝胰腺、鳃、肌肉、淋巴器官等组织中均有分布,并且肝胰腺组织中分布较多,淋巴器官组织中分布较少。     

应用巢式逆转录聚合酶链反应检测鱼类病毒性出血性败血症病毒(VHSV)

参照鱼类病毒性出血性败血症病毒序列,根据PCR引物设计的原则,设计巢式PCR引物,采用巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,对如何快速检测鱼类病毒性出血性败血症病的方法进行了较为系统的研究,并对RT-PCR的反应条件进行了优化.结果表明,巢式RT-PCR扩增获得279bp的特异性片断,阴性对照无扩增条带.巢式RT-PCR扩增出的特异性片段经测序分析,结果证实与报道的序列完全一致.该方法最低可检测出0.1pg的鱼类病毒性出血性败血症病毒RNA.初步建立了VHSV的巢式RT-PCR检测方法,该方法灵敏、特异,可为VHSV的检测提供一个快速、有效的手段.     

脊尾白虾C-型凝集素基因cDNA全长的克隆和表达分析

本研究利用本实验室构建的脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)血细胞c DNA文库中的C-型凝集素基因EST序列,采用c DNA末端快速扩增(rapid amplification of c DNA end,RACE)技术克隆获得脊尾白虾C-型凝集素基因c DNA全长,命名为Ec CTL。该基因全长1285 bp,包含1041 bp的开放阅读框,编码346个氨基酸组成的蛋白质,分子量为38.56 k Da,为甘露糖型凝集素。同源性分析表明,脊尾白虾Ec CTL基因氨基酸序列与秀丽白虾(Palaemon modestus)的同源性最高,达到91%。荧光定量PCR分析结果表明,Ec CTL基因在血细胞、肝胰腺、肌肉等组织中均有表达,其中在肝胰腺当中的相对表达量最高。感染鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)后6~12 h,脊尾白虾血细胞和肝胰腺中Ec CTL的表达量较对照组均显著增加(P0.05),且具有明显的时间差异性。本研究证明脊尾白虾C-型凝集素在其免疫反应中起到重要作用,为进一步探索脊尾白虾免疫系统打下基础。     

福建省连江县养殖对虾病毒性疾病的调查研究

对福建省连江县养殖对虾的虾病流行情况和发病规律及流行过程中水环境化学、浮游植物、微生物等的动态变化进行了调查，研究了对虾疾病的传染性、传播途径，以及病原与各因子的相互关系。结果表明：不同的对虾种类发病症状基本一致，典型症状为甲壳白斑，甲壳下水肿。该疾病的流行过程可分为三个阶段：发病前期（１－７ｄ）；发病中期（持续时间约１０—１５ｄ）；发病晚期（对虾暴发性死亡时间仅为２—５ｄ）。该流行病是杆状病毒引起并发细菌性传染病，可借海水和病虾尸体为媒介，通过消化道和体表面在不同种虾体间迅速传播。     

二温式多重PCR检测鉴别对虾白斑综合征病毒(WSSV)和传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)的研究与应用

建立了一种同时检测对虾白斑综合征病毒（WSSV）、传染性皮下和造血器官坏死病毒（IHHNV）的二温式多重PCR技术。根据基因库中WSSV（AF369029）和IHHNV（NC002190）基因序列，设计了两对分别与WSSV和IHHNV某段保守基因序列互补的引物，用这两对引物对同一样品中的WSSV和IHHNVDNA模板进行多重PCR扩增，结果均同时得到了两条大小与实验设计相符的593bp（WSSV）和356bp（1HHNV）特异性多重PCR扩增条带，而对其他对虾疾病病原的PCR扩增结果均为阴性；敏感性测定结果表明，该多重PCR技术最低能检测到WSSV和IHHNVDNA各100pg。用该多重PCR对400份临床病料进行检测，结果230份检出WSSV，阳性率57．5％；96份检出IHHNV，阳性率24％；56份同时检出WSSV和IHHNV，阳性率14％。18份为阴性，阴性率为4．5％。结果提示了WSSV和IHHNV广泛存在于中国南方的养殖对虾中，作者建立的二温式多重PCR可以用于这两种病毒的临床快速检测和鉴别诊断。     

纳米塑料和二氧化钛食相暴露对凡纳滨对虾血细胞功能及抗氧化系统的影响

纳米塑料和纳米金属氧化物粒子在不同领域的使用量日益增多,这些纳米材料进入水生系统可能带来的相关环境风险引起了人们的关注。本文通过食相暴露,分析了100 nm纳米聚苯乙烯(PS)和纳米二氧化钛(TiO2)暴露对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的血细胞功能和氧化还原平衡的干扰。实验组对虾分别投喂混有200 mg/kg和2 000 mg/kg纳米PS和纳米TiO2的饲料,试验周期为28天。在暴露第14天和第28天测定其对凡纳滨对虾的血细胞ROS含量变化、细胞吞噬率和凋亡率,以及肝胰腺组织内的总抗氧化酶(T-AOC)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)活性、丙二醛(MDA)含量和Na+/K+-ATP酶活性的影响。结果表明,纳米PS和纳米TiO2均导致凡纳滨对虾血细胞凋亡率显著上升,并且导致肝胰腺组织T-AOC、SOD和GST活性不同程度的升高以及Na+/K+-ATP酶活性显著降低。生物标志物指数(IBR)结果显示,纳米TiO2对凡纳滨对虾产生的胁迫压力高于纳米PS。     

对虾白斑综合症病毒vp15基因的RNA干扰研究

VP15是对虾白斑综合症病毒(WSSV)的一种核衣壳蛋白,以往的研究表明VP15属DNA结合蛋白,具有潜在的浓缩包装病毒基因组的功能.利用RNAi技术将vp15基因沉默,来研究vp15基因沉默后对WSSV增殖及结构的影响.体外合成了vp15基因的特异双链RNA(vp15-dsRNA)和非特异双链RNA(gfp-dsRNA),分别与WSSV混合共注射淡水原克氏螯虾.在感染后24、36、48 h,每个实验组分别取病虾步足肌肉,样品用Trizol试剂盒提取RNA用于RT-PCR检测、用病毒检测试剂盒提取DNA模板用于荧光定量PCR分析.另外每组随机选取1只虾,取中肠,用于树脂包埋组织超薄切片分析.逆转录PCR分析结果显示vp15-dsRNA能特异性敲除vp15基因转录表达,实时荧光定量PCR分析结果显示vp15-dsRNA干扰vp15基因的表达能有效抑制WSSV病毒粒子的增值.此外,利用树脂包埋组织超薄切片电子显微镜技术观察发现vp15基因被干扰后病毒粒子数量上明显降低并且引起病毒粒子包装异常.通过vp15基因特异dsRNA干扰,有效抑制了WSSV病毒增殖,此外进一步阐明VP15蛋白的功能及其在病毒组装方面的重要作用,对进一步了解病毒组装以及病毒防治具有重要的意义.     

饲料中添加芽孢杆菌组分对凡纳滨对虾幼虾生长、能量代谢和抗WSSV能力的影响

以凡纳滨对虾(Litopnnaus vannamei)幼虾为实验动物,在其基础饲料中分别添加芽孢杆菌(Bacillus sp.)胞外蛋白粗提物(1.0%,胞外蛋白组)、胞内多糖粗提物(1.0%,胞内多糖组),以基础饲料为对照组饲料,进行为期28d的养殖实验,探讨芽孢杆菌胞外蛋白和胞内多糖粗提物对幼虾生长、能量代谢及抗病能力的影响。研究表明,芽孢杆菌2种粗提物对凡纳滨对虾的生长和成活率影响不显著(P>0.05)。饲喂2种粗提物影响了凡纳滨对虾肝胰腺和肌肉中能量代谢相关酶活力。胞外蛋白组肝胰腺中磷酸果糖激酶(PFK)、乳酸脱氢酶(LDH)活力在养殖实验前期显著高于对照组(P<0.05),而肌肉中PFK、LDH活力显著低于对照组(P<0.05);胞内多糖组肝胰腺中己糖激酶(HK)活力及肌肉中PFK、LDH活力显著低于对照组(P<0.05)。饲喂2种粗提物均显著提高了凡纳滨对虾肌肉中琥珀酸脱氢酶(SDH)活力和肝胰腺中电子传递系统(ETS)活力(P<0.05),胞外蛋白粗提物对肝胰腺中的SDH活力也有显著的提高作用(P<0.05)。饲喂2种粗提物显著降低了凡纳滨对虾肝胰腺及肌肉组织中脂肪酸合酶(FAS)含量(P<0.05)。此外,饲喂2种粗提物均会显著提高凡纳滨对虾肠道蛋白酶活力(P<0.05),而胞外蛋白粗提物使凡纳滨对虾肠道脂肪酶活力显著降低(P<0.05)。白斑综合征病毒(WSSV)感染后,与对照组相比,胞外蛋白组和胞内多糖组凡纳滨对虾半致死时间分别延长了26.19%和7.14%。根据以上结果推测,芽苞杆菌2种粗提物能够影响凡纳滨对虾能量代谢水平并提高其抗WSSV能力,且二者之间密切相关。     

日本沼虾黑鳃病几种同工酶的变化与病理分析

酯酶（EST），过氧化物酶（POD），乳酸脱氢酶（LDH）和苹果酸脱氢酶（MDH）同工酶在日本沼虾中存在着组织和器官的特异性，患黑鳃病后酶带发生显著变化。在肌肉、肝脏、心脏和鳃中病虾较健康虾的LDH酶谱分别缺失了2、6、2和1条酶带，同时肝脏中新增了1条酶带；POD酶谱分别缺失了0、7、4和2酶带，肌肉中新增了2条酶带；EST酶谱分别缺失了0、2、3和1条酶带，肌肉、心脏和鳃中分别新增了1、2和2条酶带；MDH酶谱分别缺失了0、2、1和1条酶带，肌肉和脏脏中各新增了1条酶带。